专利名称：一种植物凝集素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体地说是涉及一种植物凝集素在体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新中的应用。
背景技术：
造血干细胞移植已经是目前常用的各种恶性、非恶性血液肿瘤疾病和大剂量癌症化疗患者骨髓重建的治疗手段，为得到治疗所需的细胞量，许多人都试图通过离体(exvivo)的手段扩增造血干/祖细胞，包括使用饲养细胞以及各种细胞因子联用等。但细胞增殖和细胞的自我更新及多潜能性的保持之间存在矛盾，扩增往往导致造血干/祖细胞多能性的丧失。相反，如果能将造血干/祖细胞长期维持在静止期，对于使细胞周期同步化以利于下一步的基因治疗，清除残余的肿瘤细胞，保护造血干细胞，以及调整合适的时机进行细胞扩增或移植都十分有利。
凝集素是动植物体内的一类蛋白质或糖蛋白，与细胞表面蛋白或脂类复合物中的单糖或寡糖具有高度特异的结合能力。许多植物凝集素都能作为动物细胞信号转导的外源刺激因子，在各种生理反应中发挥作用，自1988年Stillmark发现豆类种子提取物对动物细胞具有凝集作用以来，越来越多的凝集素得到开发利用。利用某些豆类凝集素可刺激淋巴细胞群的增殖，如ConA、PHA、美洲商陆等；在凝集素与肿瘤、免疫及造血相关的研究领域近年来也有新的进展。
用凝集素在离体条件下长期维持培养造血干/祖细胞将解决造血干细胞移植中出现的许多问题，拓展其临床应用的范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种有维持造血干/祖细胞活存和自我更新能力的植物凝集素的基因及其编码的蛋白质。
一种植物凝集素基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述植物凝集素基因的完整开放读码框为序列表中序列1的第1至819共819个碱基。
一种植物凝集素前体蛋白质，它是下列氨基酸序列之一1)序列表中序列2的氨基酸序列；2)序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
所述植物凝集素蛋白质的两类亚基主体序列分别为序列表中序列2的第17至38共22个氨基酸和第124至152共29个氨基酸。
一种植物凝集素蛋白质的构成亚基，它是下列的氨基酸序列之一1)序列表中序列3的氨基酸序列组的一个或多个序列；2)序列表中序列3的氨基酸序列组的一个或多个序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加或组合且具有与序列3的氨基酸序列组相同活性的由序列3衍生的蛋白质。
所述植物凝集素蛋白质的三个小分子量构成亚基N端起始序列分别为序列表中序列3的β、α1、α2氨基酸顺序。
利用NCBI的Genbank数据库对本发明基因进行检索，结果表明数据库中没有基因与此基因序列完全相同。
由于本发明所提供的蛋白质单独添加到CD34+造血干/祖细胞的培养基中，就能维持CD34+造血干/祖细胞的活存达28天以上，同时保持大部分细胞都处于细胞周期的G0/G1时相，并维持了很高比例的集落形成细胞，因此本发明的基因及其编码的蛋白质有望成为临床骨髓、外周血、脐带血造血干/祖细胞移植重要的维持因子或蛋白类药物，为拓展骨髓、外周血、脐带血造血干/祖细胞的细胞治疗和基因治疗等研究提供足够的能长期维持、可调控细胞周期进程的理想靶细胞，并促使造血细胞相关的基因治疗更加有效和广泛地应用于临床，将会带来巨大的社会效益及经济效益。本发明的基因及其编码的蛋白质可为造血调控过程中造血干/祖细胞响应细胞因子发生信号传导、周期调控、增殖、分化等方面变化的研究提供新思路，为探讨干细胞的自我更新机制、明确白血病的成因并进行治疗提供帮助，也为其它干细胞的长期维持和临床应用提供了新的理论和方法；而且，对于蛋白质作用的不同研究阶段开发的不同产品，包括新抗体、生物芯片的靶基因、筛选出的新药等，也将促进形成新兴的人类基因产业。
图1为本发明蛋白的15％SDS-PAGE电泳结果。
图2为本发明凝集素对不同细胞表面特异受体的杂交结果。其中分别显示A人脐带血阳性结果，B人脐带血阴性对照，C CD34+细胞阳性结果，D CD34+阴性对照，E单个核细胞，F人红白血病细胞K562，G人红白血病细胞HEL，H人红白血病细胞U937，I人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat，J人B淋巴细胞白血病细胞Raji，K人髓系白血病细胞KG1，L人骨髓母细胞KG1a，M膀胱癌细胞EJ1，N人胎肾细胞HEK293，O肝癌细胞HepG2，P人宫颈癌细胞Hela，Q人骨髓基质细胞HFCL，R人乳腺癌细胞MCF-7。
图3为本发明凝集素及FL的单独和组合应用对CD34+造血干/祖细胞增殖影响的结果。
图4为本发明凝集素及FL对CD34+造血干/祖细胞的细胞周期的作用结果。
各图中均以FRIL表示本发明凝集素。
具体实施例方式
实施例1、凝集素基因的克隆本发明的基因cDNA克隆自眉豆Dolichos labab的新生豆苗cDNA文库，引物序列及其多聚酶链式反应(PCR)的条件如下primer15’CGTCACAGAACGCCTCTTGTAA 3’primer25’CGCATGTTTCCCAGTAAGGTTA 3’50μl反应体系包括4μl cDNA(100ng/μl)，各1μl 10μM的primer1和primer2，4μl dNTP(2.5mM)，1μl Ex Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，5μl 10×PCRBuffer，38μl灭菌水。反应条件为94℃ 30s；59℃ 30s，72℃ 45s，35个循环，72℃7min。反应产物克隆至pMD-18T载体(TakaRa公司)。用常规方法测序，结果表明本发明所克隆到的基因为序列表中序列1的DNA序列。
实施例2、蛋白质的亲和层析纯化本发明的蛋白质来源于眉豆Dolichos lablab干种子，利用凝集素对特定糖基高亲和力的特性加以亲和层析纯化，过程如下将眉豆研磨成粉，以5倍体积Tris缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，pH8.0)匀浆，4℃平衡4小时以上；4℃ 20000g高速离心20min，取上清；以冰醋酸调pH至4.0，同上高速离心取上清；40％NaOH调pH至8.0，同上高速离心取上清，即凝集素粗提液。粗提液与Tris缓冲液平衡后的亲和层析介质(mannose-Sepharose matrix，Pharmacia公司)结合，4℃反应4小时以上，接着用Tris缓冲液洗涤至没有蛋白流出，再以200mmol/Lα-甲基α-D-甘露糖苷洗脱得到凝集素FRIL纯溶液。15％SDS-PAGE结果如图1所示，从图中可以看出在10kD-25kD范围内有5条明显的条带，是所分离的植物凝集素的5个亚基。
实施例3、蛋白质部分亚基的N端氨基酸测序15％SDS-PAGE分开所纯化的豆类凝集素的各亚基条带，通过半干转移法转移至PVDF膜上，以491A蛋白序列分析仪经自动Edman降解测定N端前5个氨基酸序列，结果表明本发明所纯化的蛋白质其部分构成亚基N端序列为序列表中序列3的氨基酸序列。从表中可以看出，本发明蛋白的α2亚基存在两个组分，其中一个是N端缺失一个氨基酸的。
实施例4、凝集素活性的测定抽取家兔耳缘静脉血，处理后用生理盐水配成2％红细胞悬液。在V型凝血板上，将本发明凝集素用PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L Na2HPO4·7H2O，1.4mmol/L KH2PO4，pH＝7.3)倍比稀释(1∶2)，每孔加25μL，再加入2％新鲜血球悬液25μL，振荡摇匀后，25℃放置1～2h，肉眼观察凝集现象的发生。结果显示，纯化的凝集素在稀释到300ng/ml左右仍有凝集活性，本发明的蛋白质是一种具有凝集血细胞能力的植物凝集素。
实施例5、凝集素的糖抑制试验将蔗糖、甘露糖、α-D甘露糖、3-Oα-D甘露糖、葡萄糖、α-甲基α-D-甘露糖苷分别用蒸馏水配成1mol/L浓度，在V型凝血板上以PBS按1∶10的梯度倍比稀释，每孔加25μL，再往各孔添加900ng/ml的本发明凝集素25μL，以及2％新鲜血球悬液50μL，25℃放置1～2h，肉眼观察抑制结果，能与红细胞竞争结合本发明凝集素的糖将导致红细胞的沉积。糖抑制实验结果见表1。由表中看出，本发明凝集素主要与3-Oα-D甘露糖有很高的亲和性，本发明的凝集素是一种针对3-Oα-D甘露糖特异结合的凝集素。
表1 扁豆凝集素糖抑制实验糖竞争反应有效稀释浓度(mol/L)蔗糖 10-2甘露糖10-2α-D甘露糖10-3glucose 10-1α-甲基α-D-甘露糖苷 -3-Oa-D甘露糖 10-5实施例6、凝集素的细胞表面特异受体的组织化学检测将本发明纯化获得的蛋白质以常规方法用辣根过氧化物酶HRP标记，作为组织化学检测的探针。
利用组织化学方法检测本发明蛋白质受体在多种造血细胞系和组织细胞系中的表达，实验结果表明，本发明蛋白质的受体在人宫颈癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胎肾细胞、骨髓基质细胞上均无表达，在多种造血细胞中，也仅有人红白血病细胞HEL、人骨髓母细胞KG1a和分离纯化的人脐带血单个核细胞MNC和CD34+细胞表面存在特异受体，其余人髓系白血病细胞KG1、U937、人红白血病细胞K562、人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat上也不存在受体，而CD34+细胞中，存在本发明蛋白质特异受体的细胞也仅占其中的一部分。结果如图2所示。图2显示出，本发明蛋白质的受体是部分造血干/祖细胞所特有的，本发明蛋白质能特异性针对造血干/祖细胞发挥作用。
实施例7、蛋白质体外长期维持CD34+造血干/祖细胞实验本发明凝集素的受体是flt3，而flt3的另一个配体是FL(flt3 ligand)，它是目前广泛应用的体外扩增造血干/祖细胞的细胞因子之一，对比本发明凝集素与FL在体外对CD34+造血干/祖细胞的维持作用，方法如下依照CD34+细胞分离试剂盒(miniMACS magnetic cell sorting system，Miltenyi BiotechGmbH公司，德国)操作步骤分离纯化脐带血CD34+细胞，细胞以4～8×105/mL的浓度培养于含10％FBS、0.5％BSA的RPMI 1640培养基中，分别添加FRIL、FL、(FRIL+FL)培养，FRIL、FL添加的终浓度均为300ng/mL，不更换培养基，于一定时间计数细胞量，并收集细胞用于PI染色、流式细胞仪检测细胞周期，另部分细胞进行混合集落培养(2000～8000细胞接种于0.5mL含5ng/mL GM-CSF、5ng/mL IL-3、50ng/mL SCF、2U/mL EPO、5×10-5mol/L 2-ME、10％FBS、10％HS的甲基纤维素预混培养基MethoCultTMSF中，按24孔板中每孔0.5mL加入，培养至16d计数形成的各种集落。集落密度即每104个细胞形成的集落数。)细胞增殖曲线见图3，细胞周期检测结果见图4，混合集落培养计数结果见表2。图3、图4显示，以本发明凝集素培养的CD34+细胞G0/G1期的比例总在80％以上，超出FL的作用水平，同时比较细胞数上的差别，推测本发明凝集素延长了造血干细胞的细胞周期，减少了进入分裂和增殖过程的细胞数。表2显示，以本发明凝集素长期培养CD34+细胞相对FL表现出较高的集落形成能力，可见本发明凝集素更适用于长期保存造血干/祖细胞的多能性。以上结果说明，本发明凝集素具有更强的体外维持CD34+造血干/祖细胞的活存和自我更新潜力的能力，主要是通过将CD34+造血干/祖细胞滞留在细胞周期的G0/G1期实现的。
表2扁豆凝集素及FL不同组合对CD34+造血干/祖细胞集落形成能力的影响Day Medium Myeloid Erythroid Mix0 824±141 8±3 83±103FL 1001±16510±7 17±21FRIL 790±202*21±178±6FL+FRIL863±392 0 16±15Blank 795±28 35±1417±87FL 902±252 34±30107±95FRIL 818±376 35±2290±84FL+FRIL836±240 119±97 107±91Blank 432±107 0 014 FL 260±137 11±1015±13FRIL 326±121*21±13*23±9*FL+FRIL272±147***0***5±5***Blank 0 0 021 FL 130±126 1±1 4±3FRIL 295±117**6±4*12±9*FL+FRIL347±303****0****0***Blank 00 028 FL 120±64 0 1±1FRIL 172±60*0 1±2FL+FRIL180±74 2±2 1±1Blank 00 0*P＜0.05本发明凝集素与FL组相比，**P＜0.01本发明凝集素与FL组相比，***P＜0.001本发明凝集素与FL之间存在交互作用，****P＜0.05本发明凝集素与FL之间存在交互作用。
表中以FRIL表示本发明凝集素。
序列表<160>2<210>1<211>819<212>DNA<213>扁豆属扁豆种(Dolichos lablab L.[Lablab vulgaris Savi])<400>1atgtttccca gtaaggttaa gtcagcacag tcattgtcat ttagtttcac 50caagtttgat cctaaccaag aggatcttat cttccaaggt catgccactt 100ctacaaacaa tgtcttacaa ctcaccaagt tagacagtgc aggaaaccct 150gtgagttcta gtgcgggaag agtgttatat tctgcaccat tgcgcctttg 200ggaagactct gcggtattga caagctttga caccattatc aactttgaaa 250tctcaacacc ttacacttct cgtatagctg atggcttggc cttcttcatt 300gcaccacctg actctgtcat cagttatcat ggtggttttc ttggactctt 350tcccaacgca aacactctca acaactcttc cacctctgaa aaccaaacca 400ccactaaggc tgcatcaagc aacgttgttg ctgttgaatt tgacacctat 450cttaatcccg attatggtga tccaaactac atacacatcg gaattgacgt 500caactctatt agatccaagg taactgctaa gtgggactgg caaaatggga 550aaatagccac tgcacacatt agctataact ctgtctctaa aagactatct 600gttactactt attatcctgg gagtaaacct gcgactctct cctatgatat 650tgagttacat acagtgcttc ctgaatgggt cagagtaggg ttatctgctt 700caactggaca agataaagaa agaaataccg ttcactcatg gtctttcact 750tcaagcttgt ggaccaatgt ggcgaagaag gagaatgaaa acaagtatat 800tacaagaggc gttctgtga 819<210>2<211>272<212>PRT<213>扁豆属扁豆种(Dolichos lablab L.[Lablab vulgaris Savi])
<400>2Met Phe Pro Ser Lys Val Lys Ser Ala Gln Ser Leu Ser Phe Ser15 10 15Phe Thr Lys Phe Asp Pro Asn Gln Glu Asp Leu Ile Phe Gln Gly20 25 30His Ala Thr Ser Thr Asn Asn Val Leu Gln Leu Thr Lys Leu Asp35 40 45Ser Ala Gly Asn Pro Val Ser Ser Ser Ala Gly Arg Val Leu Tyr50 55 60Ser Ala Pro Leu Arg Leu Trp Glu Asp Ser Ala Val Leu Thr Ser65 70 75Phe Asp Thr Ile Ile Asn Phe Glu Ile Ser Thr Pro Tyr Thr Ser80 85 90Arg Ile Ala Asp Gly Leu Ala Phe Phe Ile Ala Pro Pro Asp Ser95 100 105Val Ile Ser Tyr His Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Pro Asn Ala110 115 120Asn Thr Leu Asn Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Gln Thr Thr Thr125 130 135Lys Ala Ala Ser Ser Asn Val Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Tyr140 145 150Leu Asn Pro Asp Tyr Gly Asp Pro Asn Tyr Ile His Ile Gly Ile155 160 165Asp Val Asn Ser Ile Arg Ser Lys Val Thr Ala Lys Trp Asp Trp170 175 180Gln Asn Gly Lys Ile Ala Thr Ala His Ile Ser Tyr Asn Ser Val185 190 195Ser Lys Arg Leu Ser Val Thr Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Lys Pro200 205 210Ala Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Glu Leu His Thr Val Leu Pro Glu215 220 225Trp Val Arg Val Gly Leu Ser Ala Ser Thr Gly Gln Asp Lys Glu230 235 240Arg Asn Thr Val His Ser Trp Ser Phe Thr Ser Ser Leu Trp Thr
245 250 255Asn Val Ala Lys Lys Glu Asn Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Arg Gly260 265 270Val Leu272<210>3本发明凝集素部分亚基N端氨基酸序列subunit AA sequence of N-terminalβ Ala Gln Ser Leu Ser Pheα1 Thr Thr Thr Lys Ala Alaα2 Asp Ser Ser Thr Ser/Ser Ser Thr Ser Gln
权利要求
1.一种具有体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新能力的豆类凝集素基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述具有体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新能力的基因是序列表中序列1的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于所述具有体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新能力基因的完整开放读码框为序列表中序列1的第1至819共819个碱基。
4.一种具有体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新能力的蛋白质，它的前体蛋白具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的前体具有序列表中序列2的氨基酸序列。
6.根据权利要求3或4所述的蛋白质，其特征在于所述具有体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新能力蛋白质的部分构成亚基N端是序列表中序列3的一组或多组氨基酸序列。
全文摘要
本发明目的为提供一种能够在体外长期维持造血干/祖细胞活存和自我更新的基因及其编码的蛋白质。本发明所提供的基因是序列表中序列1的DNA序列；本发明所提供的蛋白质具有序列表中序列2或序列3的氨基酸序列。本发明的基因及其编码的蛋白质有望成为临床造血干/祖细胞体外扩增和定向诱导分化的重要维持因子或蛋白类药物，为细胞治疗和基因治疗等研究提供足够的能长期维持、可调控细胞周期进程的靶细胞，并为研究造血调控及探讨干细胞的自我更新机制提供帮助，也为其它干细胞的长期维持和临床应用提供了新的理论和方法；对于蛋白质作用的不同阶段开发不同的产品，包括新抗体、生物芯片的靶基因、筛选出的新药等，也将促进形成新兴的人类基因产业。
文档编号C12N5/08GK1626661SQ20041007402
公开日2005年6月15日 申请日期2004年9月1日 优先权日2003年10月31日
发明者裴雪涛, 谢小燕, 谢超, 王冬梅, 李艳华, 李锦 , 师伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所