专利名称：感染性克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备DNA或RNA的方法、应用该方法获得的核酸及其用作疫苗和用于基因治疗的用途。
背景技术：
重组DNA技术的进步使生物之间的基因转移获得发展。目前，为了应用基因转移技术生产具有经济和工业价值的化学品、药物和生物制品，进行了巨大努力。
对原核细胞和真核细胞进行基因操作的一个重要步骤是研制载体和载体-宿主系统。一般来说，载体是能够在宿主细胞中复制或表达的核酸分子。载体-宿主系统可定义为携带载体而且允许其包含的基因信息复制和表达的宿主细胞。
已经应用DNA病毒基因组和RNA病毒基因组研制载体。从DNA病毒获得能够在宿主细胞核复制的病毒载体的缺点是能够整合入所述细胞的基因组，因此这样的病毒载体一般不是非常安全。相反，从RNA病毒获得的病毒载体在宿主细胞细胞质中复制，它们比基于DNA病毒的载体更安全，因为复制是通过细胞核外的RNA进行的。因而这样的载体整合入宿主细胞基因组的可能性非常小。
已经从以下正极性单链RNA病毒[ssRNA(+)]获得了cDNA克隆例如微小RNA病毒(Racaniello & Baltimore，1981)、雀麦花叶病毒(Ahlquist等，1984)、甲病毒属(包括新培斯病毒、无名森林病毒(SemlikiForest Virus)(SFV)和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEE)(Rice等，1987；Liljestrm和Garoff，1991；Frolov等，1996；Smerdou和Liljestrom，1999)、黄病毒和瘟病毒(pestivirus)(Rice和Strauss，1981；Lai等，1991；Rice等，1989)以及星状病毒科病毒(Geigenmuller等，1997)。同样，已经用与ssRNA(+)病毒基因组互补的DNA克隆研制获得表达异源基因的载体，所述ssRNA(+)病毒例如甲病毒属，包括新培斯病毒、无名森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑脊髓炎(VEE)病毒(Frolov等，1996；Liljestrm，1994；Pushko等，1997)。然而，应用RNA病毒制备重组病毒的所有方法仍然非常复杂，因为大多数RNA病毒含有细菌毒性序列。所以，制备病毒RNA的cDNA，然后使cDNA亚克隆入细菌，常常导致细菌宿主DNA序列缺失或重排。为此，大多数常用亚克隆及表达载体不能用来制备重组RNA病毒来源的DNA大片段。但是，研制药物、尤其是疫苗在许多方面需要获得可携带外源长DNA序列的载体。
冠形病毒是RNA病毒中具有最大已知基因组的ssRNA(+)病毒，其长度为约25-31千碱基对(kb)(Siddell，1995；Lai & Cavanagh，1997；Enjuanes等，1998)。在冠形病毒感染期间，其基因组RNA(gRNA)复制，而且合成一套正极性和负极性亚基因组RNA(sgRNA)(Sethna等，1989；Sawicki和Sawicki，1990；van der Most & Spaan，1995)。合成sgRNA是在感染细胞细胞质中进行的RNA依赖性过程，然而其准确机制仍然不完全清楚。
关于构建编码某些冠形病毒(例如小鼠肝炎病毒(MHV)、传染性气管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BCV)(Chang等，1994)和猪胃肠炎病毒(TGEV)(西班牙专利申请P9600620；Méndez等，1996；Izeta等，1999；Sanchez等，1999))的干扰缺损(DI)病毒基因组(其复制和转录需要存在互补病毒的缺失突变体)的cDNA已有介绍。但是仍然不能构建编码冠形病毒完整基因组的cDNA克隆，其原因是冠形病毒基因组太大以及存在毒性序列。
总而言之，尽管已经研制成功了大量在宿主细胞复制和表达异源核酸的病毒载体，但是大多数表达异源基因的已知载体不是非常适合亚克隆RNA病毒。此外，如此获得的病毒载体因为缺乏种特异性和靶器官或靶组织限制以及其克隆能力有限而存在若干缺点，限制其在基础研究和应用研究中应用的可能性。
所以，需要开发能够克服上述缺点、表达异源基因的新型载体的方法。具体来说，最好获得表达异源基因的安全性和克隆能力高的大载体，可以进行设计使其种特异性和向性受到控制。
发明概述按照本发明应用一种制备DNA的方法解决上述问题，该方法包括多个步骤，其中将一种如下DNA克隆入细菌人工染色体(BAC)(a)包含RNA病毒的全长拷贝基因组RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含一个或若干个RNA病毒gRNA片段的DNA，所述片段编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白；或者(c)与(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。
意想不到的是，本发明人发现，采用BAC作克隆载体可克服使用现有技术方法亚克隆和表达得自病毒gRNA的长DNA序列遇到的问题。使用BAC的特别好处是这些载体在细菌中以每个细胞一个或多个拷贝存在，大大限制了毒性而且减小质粒间重组的可能性。
本发明进一步提供制备病毒RNA或病毒体的多步骤方法，其中按照一种上述方法制备DNA，表达所述DNA，分离病毒RNA或病毒体。进一步公开了包括上述制备DNA方法的步骤的制备药物、尤其是疫苗的方法。
另一方面，本发明提供包含得自冠形病毒基因组RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列与冠形病毒天然序列的同源性至少为60％，而且编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白，其中所述DNA的一个片段能够转录为RNA，该RNA能够装配为病毒体。本发明还包括制备相应DNA的方法。
本发明还提供载体，更准确地说是包含相应核酸的细菌人工染色体(BAC)。按照一个进一步的实施方案，本发明涉及宿主细胞和包含本发明DNA或RNA的感染性减毒或失活病毒。
本发明还提供药用制剂，例如包含本发明核酸、载体、宿主细胞或病毒体的单价或多价疫苗。
最后，本发明提供生产病毒体或病毒RNA的方法以及应用该方法获得的病毒RNA，所述方法包括多个步骤，其中转录按照本发明的DNA，然后回收病毒体或病毒RNA。
附图简述
图1图示构建编码TGEV感染性RNA的cDNA克隆。图1A图示TGEV的遗传结构，以字母和数字(1a、1b、S、3a、3b、E、M、N和7)标示基因名称。图1B图示cDNA克隆策略，该策略在于完成了DI-C基因组。标示出了为了重建全长cDNA而完成的缺失Δ1、Δ2和Δ3。DI-C基因组结构下面的数字指示所述DI-C基因组各缺失两侧的核苷酸。图1C图示构建完成缺失Δ1的4个cDNA片段和连接时使用的主要限制性位点位置。插入片段Δ1使cDNA毒性增加。
图2图示用于克隆TGEV感染性cDNA的质粒pBeloBAC(Wang等，1997)的结构。pBeloBAC质粒由H.Shizuya和M.Simon(CaliforniaInstitute of Technology)提供，包含7,507个碱基对(bp)，它包含大肠杆菌F因子复制起点(oriS)、保持一个细胞一个拷贝质粒需要的基因(parA、parB、parC和repE)以及氯霉素抗性基因(CMr)。指出了T7和SP6启动子和独特的限制性位点的位置。CosN有助于构建pBAC质粒的λcosN部位；lac Zβ-半乳糖苷酶基因。还指出了制备质粒时使用的序列lxoP。
图3图示构建TGEV cDNA时使用的基础质粒结构。pBAC-TcDNAΔClaI质粒包含除了一个5,198bp的ClaI-ClaI片段之外的所有TGEV RNA信息。在巨细胞病毒(CMV)立即早期表达(IE)启动子控制下克隆cDNA，3’末端侧为24个A残基的多聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)的核酶和牛生长激素(BGH)终止序列和聚腺苷酸化序列。pBAC-B+C+D5’质粒包含完成pBAC-TcDNAΔClaI直至所述cDNA为全长所需要的ClaI-ClaI片段。pBAC-TcDNAFL质粒含有TGEV全长cDNA。SAP虾碱性磷酸酶。
图4图示TGEV PUR46-MAD(MAD)和C11克隆的S基因核苷酸序列的差异。数字指示取代核苷酸的位置，每个基因的第一个核苷酸为起始密码子的A。条图中的字母指示所示位置的相应核苷酸。条图下面的字母指示指示位置周围的核苷酸编码的取代氨基酸(aa)。Δ6nt指示6个核苷酸的缺失。箭头指示S基因终止密码子的位置。
图5图示从全长TGEV cDNA拯救感染性TGEV遵循的策略。使pBAC-TcDNAFL质粒转染ST细胞(猪睾丸细胞)，转染后48小时用上清液感染新的ST细胞。按照所示时间传代病毒。每次传代时，分别收集等份上清液和单层细胞进行病毒滴定以及分离RNA进行RT-PCR分析。vgRNA全长病毒RNA。
图6图示TGEV cDNA在转染ST细胞产生的致细胞病变作用(CPE)。非感染(对照)ST细胞没有CPE(图6A)，pBAC-TcDNAFL转染ST细胞后14小时和20小时观测到CPE(分别为图6B和6C)。
图7图示病毒滴度随传代的变化。所示图为pBAC-TcDNAFL转染后不同传代数的2个系列单层细胞(1和2)上清液的病毒滴度。模拟物1和2是指非转染ST细胞。TcDNA1和2是指pBAC-TcDNAFL转染ST细胞。
图8图示对pBAC-TcDNAFL转染ST细胞后回收的病毒进行序列分析的结果。上图显示TGEV基因组的结构。同样，指出了从pBAC-TcDNAFL(TcDNA)质粒回收的病毒与TGEV克隆C8和C11之间的核苷酸序列差异(遗传标记)。条图上的数字指示所述核苷酸之间不同的位置。通过对RT-PCR(逆转录和聚合酶链式反应)获得的片段进行测序，确定TcDNA病毒和C11克隆的cDNA序列。C8克隆的序列正待公开(Penzes等，1999)，它列在该专利的后面。以通过RT-PCR获得的片段的ClaI和DraIII显示限制图谱，所述片段包含TcDNA和C8病毒的核苷酸18,997和20,990。限制图谱显示这些病毒的cDNA中是否存在ClaI和DraIII位点。该分析结果表明，回收的TcDNA病毒存在预期的分离克隆C11的S基因序列。MWM分子量标记。
图9显示回收病毒的RT-PCR分析结果。在细胞聚合酶pol II识别的CMV启动子控制下表达病毒RNA。通常该RNA在转运至细胞质的过程中进行剪接。为了研究情况是否如此，使用预测人DNA序列剪接位点的程序确定高剪接概率的RNA位点(2.1.5.94版，Department of Cell Biology，Baylor College of Medicine)(Solovyev等，1994)。最高剪接概率的潜在剪接位点是nt 7,243的剪接供体位点和nt7,570的剪接受体位点(图9A)。为了研究该结构域是否进行剪接，从第零代和第二代非转染培养物的RNA(对照)或者具有反向ClaI片段的TcDNA(TcDNAFL(-ΔClaI)RS)转染的ST细胞或者具有正向ClaI片段的TcDNA(TcDNAFL)转染的ST细胞制备nt 7,078和nt 7,802之间的RT-PCR片段(图9B)，以琼脂糖凝胶分析RT-PCR获得的产物。图9C(第0代)和9D(第二代)显示所获得的结果。
图10图示对TcDNA转染的ST细胞培养物产生的病毒的免疫荧光分析结果。用TGEV PUR46-MAD分离株特异性抗体和pBAC-TcDNAFL质粒转染后回收的病毒特异性抗体进行免疫荧光染色。为此，使用结合两种分离株或者只结合PUR46-MAD的TGEV特异性单克隆抗体(Sanchez等，1990)。结果证实所述TcDNA病毒具有预期抗原性。TGEV特异性多克隆抗血清结合两种病毒，但是不结合非感染培养物，只有预期的S(ID.B12和6A.C3)、M(3B.B3)和N(3B.D8)蛋白特异性单克隆抗体结合所述TcDNA病毒(Sanchez等，1999)。
图11图示在基因间(IG)序列的5’侧翼区不同的不同转录调节序列(TRS)之下表达GUS。在CMV启动子控制下克隆小基因组M39。在该小基因组中插入多克隆序列(PL1，5’-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3’；SEQ ID NO2)和转录单位，转录单位的组成是选定的转录调节序列(TRS)、另一个多克隆序列(PL2，5’-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3’；SEQ ID NO3；或者PL3，5’-GTCGAC-3’；SEQ ID NO4)、具有Kozak(Kz)结构域结构的序列、β-半乳糖苷酶(GUS)基因和再一个多克隆位点(PL4，5’-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3’，SEQ ID NO5)。这些序列的3’末端侧1为小基因组M39的3’序列、HDV核酶和BGH的终止序列和聚腺苷酸化序列。TRS在IG序列(CUAAAC)1的5’末端具有不同数量(0、-3、-8和-88)核苷酸，如图所示，它们来自N、S或M基因。用不同质粒转染ST细胞，用互补病毒(PUR46-MAD)感染，传代上清液6次。利用Izeta介绍的方案(Izeta等，1999)测定感染细胞的GUS活性。根据GUS表达与传代数关系获得的结果总结在图12B中。
图12图示在IG序列的3’侧翼区改变的不同TRS之下表达GUS(见图11A)。应用相当于TGEV N基因的-88核苷酸和IG序列(CUAAAC)的5’-侧翼区的转录单位，修饰3’-侧翼序列。如图12A所示，这些序列相当于不同TGEV基因(S、3a、3b、E、M、N和7)的序列。在两种情况下，3’-序列被包含限制性位点(SalI)和优化Kozak序列(Kz)的其它序列代替或者被与第一个IG序列之后的序列相同的序列代替，第一个IG序列之前为病毒基因组的前导序列。应用上述方案(Izeta等，1999)测定感染细胞的GUS活性。cL12指示与TGEV基因组“前导”序列3’末端序列相同的12个核苷酸序列(参见最后标示的病毒序列)。根据GUS表达与传代数关系获得的结果总结在图12B中。
图13图示小基因组中表达模块的插入位点对GUS表达水平的影响。在小基因组M39的4个限制性位点(图13A)中插入包含IG序————————————————————————————————1需要指出的是，CTAAAC和CUAAAC对于本专利具有相同含义。第一种为DNA序列，第二种为相应的RNA。
列(CUAAAC)5’末端侧的N基因的-88nt和3’末端侧的Kz序列(参见图12A)的GUS转录单位，以确定是否所有这些位点都同样允许表达异源基因。用这些质粒转染ST细胞，并用互补病毒(PUR46-MAD)感染。按照上述方案(Izeta等，1999)测定没有传代(P0)时感染细胞的GUS活性。获得的结果总结于图13B。
发明详述按照本发明提供制备DNA的方法，该方法包括多个步骤，其中将一种下列DNA克隆入细菌人工染色体(BAC)中(a)包含RNA病毒全长拷贝的基因组RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一个或若干个gRNA片段的DNA，所述片段编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白；或者(c)与(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。
按照所述应用，“细菌人工染色体”是包含F因子序列的DNA序列。包含该序列的质粒(所谓的F质粒)能够稳定维持低拷贝数(每个细胞一个或两个拷贝)的300Kb以上的异源序列。相应的BAC是本领域已知的(Shizuya等，1992)。
按照本发明，克隆入BAC的DNA与RNA病毒天然序列的同源性为至少60％、优选75％、更优选85％或95％。最好使用可从欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)获得的Clustal计算机程序确定序列同源性。
按照本发明所述方法，克隆入BAC的DNA还可包含所述病毒的一种结构蛋白或非结构蛋白以外的若干种或全部蛋白的编码序列。
在本发明的一个优选实施方案中，克隆入BAC的DNA还包含编码一个或若干个异源基因的序列。按照本发明应用，如果一种基因不是来源于用作编码所述RNA依赖性RNA聚合酶和所述结构蛋白或非结构蛋白的基因来源的病毒，则所述基因称为“异源基因”。因此，“异源基因”也指来源于一种病毒而且以包含来源于另一种病毒的序列的载体表达的基因。任何目的异源基因均可以插入本发明的核酸中。特别优选插入的基因编码被哺乳动物免疫系统识别为感染性因子抗原的一种或若干种肽或蛋白。另一方面，可以应用编码至少一种干扰感染因子复制的分子或者针对感染因子提供保护的抗体的异源基因，实施本发明的方法。异源序列可以包括编码免疫调节蛋白、细胞因子、免疫增强物和/或抗炎化合物的序列。
可以使用任何大小的DNA克隆入BAC来实施本发明方法。然而，如果使用大序列，相对于从病毒制备亚克隆DNA的已知方法，本发明方法具有特别突出的优势。所以，克隆入BAC的DNA长度至少为5Kb，其中特别优选至少15、25或30Kb大小的DNA。
按照特别优选的本发明实施方案，提供这样的方法其中所述BAC包含控制克隆入BAC中的DNA转录的序列。这使得允许转录病毒RNA，由此能够表达所述病毒。为此可使用本领域已知的控制转录的任何序列，包括驱动来自DNA基因组或RNA基因组的基因表达的序列。优选应用巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)启动子。
克隆入BAC的DNA的3’-末端侧也可以为聚腺苷酸尾。该核酸可以包括牛生长激素(BGH)的终止序列和/或聚腺苷酸化序列。此外/或者，所述核酸可以包含编码核酶(例如丁型肝炎病毒(HDV)的核酶)的序列。
如果至少一种所述病毒基因通过取代、缺失或加入核苷酸进行了修饰，则还可以实现其它优势。例如修饰控制病毒向性的基因可以获得向性不同的病毒。或者可以用另一种病毒的相应基因取代控制所述病毒向性的基因。优选在所述病毒的S、M和/或N基因中进行修饰。
在本发明的一个优选实施方案中，提供如下一种方法其中克隆入BAC的DNA能够转录为RNA，该RNA可以装配为病毒体。所装配的病毒体可以为感染性、减毒性、复制缺陷型或失活病毒。
在本发明方法中可以使用任何RNA病毒。所述病毒可以是例如微小RNA病毒、黄病毒、披膜病毒、冠形病毒、toroviruses、arterivurses、calcivirus、弹状病毒、副粘病毒、线状病毒、博尔纳病毒(bornavirus)、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒或呼肠孤病毒。优选使用天然存在正链基因组的病毒。
此外，本发明提供制备病毒RNA或病毒体的方法，该方法包括多个步骤，其中按照一种上述方法制备DNA，在合适的宿主细胞中表达所述DNA，从所述宿主细胞分离病毒RNA或病毒体。可以使用本领域已知的从细胞培养物分离病毒的任何方法。本发明公开了制备病毒RNA或病毒体的替代方法，其中使用化学品、生物试剂和/或细胞提取物转录或翻译本发明DNA，然后分离所述病毒RNA或病毒体。对于某些实施方案，所述病毒随后被灭活或杀死。
本发明还提供制备药用组合物的方法，该方法包括多个步骤，其中按照一种上述方法制备DNA、病毒RNA或病毒体，然后使其与药学上可接受的佐剂和/或载体混合。大量佐剂和载体以及稀释剂是先有技术中已知的，而且可以用于本发明。所述药物优选为保护人类或动物抵抗传染性疾病的疫苗。所述药物也可以有益地用于基因治疗。
本发明进一步首次提供包含得自冠形病毒基因组RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列与冠形病毒天然序列具有至少60％同源性，而且编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白，其中一种所述DNA片段能够转录为可装配为病毒体的RNA。
按照本发明，术语“得自冠形病毒的序列”用以指与冠形病毒天然序列具有至少60％、优选75％、更优选85或95％同源性的核酸序列。可使用欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的Clustal计算机程序测定序列同源性。
术语“冠形病毒”按照本发明用以指一组这样的病毒具有25-33Kb的线性、正义、ssRNA单个分子。这些病毒通常含有7-10个结构基因，即编码决定病毒结构的蛋白的基因。这些基因在病毒基因组中的排列顺序通常为5’复制酶-(血凝素-酯酶)-刺突-包膜-膜-核蛋白-3’。此外，所述病毒基因组可以含有无数编码具有共同3’末端的一个嵌套组mRNA而且大部分是非必需的非结构基因。
术语“能够转录为可装配为病毒体的RNA”用以特征性描述这样的DNA序列它一旦引入合适宿主细胞，就可以转录为RNA而且产生病毒体。所述病毒体最好为感染性病毒，但是也可以为包含所述RNA的失活病毒、减毒病毒或复制缺陷型病毒。最好是表达所述病毒体必需的所有信息都由本发明的DNA序列编码。
本发明核酸可以进一步包含编码一个或若干个目的异源基因的序列。按照本发明，如果一种基因不是来源于用作编码所述RNA依赖性RNA聚合酶和结构蛋白或非结构蛋白的所述基因的源病毒的冠形病毒时，则所述基因称为“异源基因”。因此，“异源基因”也指得自一种冠形病毒而且在包含得自另一种冠形病毒的序列的载体中表达的基因。在本发明核酸中可以插入任何目的异源基因。特别优选插入的基因编码被哺乳动物免疫系统识别为感染性因子抗原的肽或蛋白。因此，异源基因可以编码至少一种适合诱导抗感染因子的免疫应答的抗原、至少一种干扰感染因子复制的分子或者针对感染因子提供保护的抗体。或者/此外，异源基因可以编码免疫调节蛋白、细胞因子、免疫增强物和/或抗炎化合物。
转录为RNA的本发明DNA片段的大小最好为至少25Kb。特别优选至少30Kb大小的片段。
按照本发明的一个优选实施方案，所述DNA进一步包含得自冠形病毒的序列，所述序列编码除了一种冠形病毒结构蛋白或非结构蛋白以外的若干或所有蛋白。另一方面，本发明的DNA进一步包含编码冠形病毒所有结构蛋白或非结构蛋白的序列。
按照再一个实施方案，本发明核酸包含控制来源于冠形病毒gRNA的序列转录的序列。为此可以使用本领域已知的控制转录的任何序列，包括驱动来自DNA或RNA基因组的基因表达的序列。优选使用巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)启动子。
按照本发明的核酸的3’末端侧也可以为聚腺苷酸尾。所述核酸可以包含牛生长激素(BGH)的终止序列和/或聚腺苷酸化序列。此外/或者，所述核酸可以包含编码核酶如丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列。
本发明核酸可以包含得自任何冠形病毒的序列，例如得自以下病毒分离株的序列猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、传染性气管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BoCV)、犬冠形病毒(CCoV)、猫冠形病毒(FcoV)或人冠形病毒。按照一个优选实施方案，所述核酸得自传染性胃肠炎病毒。
按照本发明的再一个实施方案，本发明DNA为质粒的组成部分、优选为细菌人工染色体(BAC)的组成部分。
本发明进一步提供包含相应核酸或载体的宿主细胞。该宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。另一方面，本发明提供包含按照本发明的核酸的病毒体。相应的病毒体例如可以从本发明核酸转染或感染的细胞培养物中分离获得。
按照又一实施方案，本发明提供制备病毒体或病毒RNA的方法，该方法包括多个步骤，其中将本发明DNA导入宿主细胞中，在允许所述DNA表达的情况下培养含有所述DNA的宿主细胞，回收病毒体或病毒RNA。此外，提供这样的制备病毒体或病毒RNA的方法其中使本发明DNA与化学品、生物试剂和/或细胞提取物在允许表达所述DNA的条件下体外混合，回收病毒体或病毒RNA。本发明还包括通过以上两种方法中任何一种方法获得的病毒体和病毒RNA。优选携带异源基因的RNA和病毒体。如此获得的病毒可以为传染性、减毒、复制缺陷型或失活病毒形式。
所述病毒可以含有修饰基因，例如修饰的S、N或M基因。在本发明的一个特别实施方案中，对S、N或M基因的修饰产生减毒病毒或向性不同的病毒。
按照再一个实施方案，本发明提供包含按照本发明的核酸、宿主细胞或病毒体的药用制剂。按照一个优选实施方案，所述药用制剂为能够保护动物抗感染性因子引起的疾病的疫苗。疫苗可以包含例如至少一种适合诱导抗感染性因子的免疫应答的抗原的序列或者包含对所述感染性因子提供保护的抗体的序列。疫苗可以包含表达至少一种干扰所述感染性因子复制的分子的DNA。或者，所述疫苗可以包含表达至少一种抗原的载体，所述抗原能够诱导抵抗在呼吸道或肠道粘膜或其它组织中繁殖的不同感染性因子的系统免疫应答和/或粘膜免疫应答。所述疫苗也可以为能够保护动物抗一种以上感染性因子引起的感染的多价疫苗，该多价疫苗包含一种以上的本发明核酸，其中每种核酸表达能够诱导抗各所述感染性因子的免疫应答的抗原，或表达针对各所述感染性因子提供保护的抗体，或者表达干扰任何一种感染性因子复制的其它分子。
本发明疫苗还可以包含技术水平已知的药学上可接受的任何载体或稀释剂。
本发明还提供如下的制备本发明DNA的方法，该方法包括多个步骤，其中将在启动子表达之下的冠形病毒来源的干扰缺陷型基因组克隆入BAC载体，重新插入所述缺陷型基因组中的缺失。该方法还包括多个步骤，其中在重新插入其它基因组DNA之前鉴定所述病毒基因组中的毒性序列。所述病毒基因组中的毒性序列最好是在完善所述基因组之前最后重新插入的序列。按照本发明，这种方法适合产生冠形病毒感染性克隆，该冠形病毒感染性克隆在细菌中稳定至少80代，因而提供非常有效的克隆载体。
本发明提供对得自冠形病毒的cDNA感染性克隆的研制(Almazan等，2000)以及从还包含插入所述克隆的异源核酸序列的所述感染性克隆构建的载体。本发明提供的感染性克隆和载体在基础研究和应用研究中均具有无数用途，而且克隆能力高，可以对其进行设计使得其种特异性和向性容易控制。
本专利介绍这样的研制方法这种方法使得在冠形病毒历史上首次可获得编码冠形病毒基因组的全长感染性cDNA克隆(Almazan等，2000)。
研制了以用编码冠形病毒基因组RNA(gRNA)的感染性cDNA克隆制备的冠形病毒为基础的表达异源核酸的新型载体或系统。在本发明的一个具体实施方案中，所述冠形病毒是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。
所述新型表达系统可用于基础研究或应用研究，以便例如获得作为疫苗载体的目的产物(蛋白、酶、抗体等)，或者可用于人类和动物的基因治疗。可以用常规遗传工程技术操作得自感染性cDNA克隆的感染性冠形病毒，这样可以将新的基因导入所述冠形病毒基因组，因而这些基因可以组织特异性和种特异性方式表达，以便诱导免疫应答或用于基因治疗。此外。通过选择可以增加百倍以上表达水平的新型转录调节序列(TRS)而优化所述表达。
得自冠形病毒、尤其是TGEV的载体相对于不在粘膜中复制的其它表达系统存在以下多个诱导粘膜免疫的优点(i)TGEV感染肠道粘膜和呼吸道粘膜(Enjuanes和Van der Zeijst，1995)，也就是说，感染诱导分泌型免疫的最佳部位；(ii)其向性可以通过修饰S(刺突)基因进行控制(Ballesteros等，1997)；(iii)存在开发依赖于互补病毒的表达系统的非致病株(Sanchaz等，1992)；(iv)冠形病毒是胞质RNA病毒，它可以复制但是不通过中间DNA期传代(Lai和Cavanagh，1997)，使其几乎不可能整合入细胞染色体。
能够从编码冠形病毒gRNA的cDNA回收感染性冠形病毒的方法包括以下策略(i)在合适启动子控制下表达所述冠形病毒的RNA；
(ii)以细菌人工染色体(BAC)克隆所述冠形病毒基因组；(iii)鉴定对细菌具有直接或间接毒性的冠形病毒cDNA序列；(iii)鉴定编码冠形病毒感染性RNA的cDNA组分(启动子、转录终止序列、聚腺苷酸化序列、核酶等)连接的准确顺序；(iv)鉴定一组综合允许有效拯救cDNA的感染性冠形病毒的技术和方法(BAC的生长条件、对BAC DNA纯化方法的改进、转化技术等)。
启动子对于增强病毒RNA在细胞核内表达起重要作用，病毒RNA在细胞核内合成，然后转运到胞质中。
BAC的应用构成本发明方法的一个关键点。众所周知，克隆细菌质粒中的真核细胞序列常常因为所述外源性序列对细菌的毒性而失败。在这样的情况下，所述细菌通常通过修饰所导入的序列而消除毒性。然而，随之而产生的策略是，为了避免这些病毒序列的可能毒性，进行必要的克隆以便获得在BAC中的完整冠形病毒cDNA。这些质粒在每个细胞中仅有一个拷贝，最多一个细胞两个拷贝，这样明显限制其毒性以及降低质粒间重组的可能性。
通过鉴定冠形病毒的细菌毒性cDNA序列，可以完成编码冠形病毒完整基因组cDNA的构建，而不包括所述毒性序列，毒性序列在构建完整基因组的最后一步中加入，即恰好在转染真核细胞之前，这样可以避免细菌对其进行修饰。
所以，本发明的一个目的在于编码冠形病毒gRNA的感染性双链cDNA克隆以及获得它的方法。
本发明的再一个目的在于一组重组病毒载体，该组病毒载体包含所述感染性克隆和插入其中的异源核酸序列。
本发明又一个目的在于制备重组冠形病毒的方法，该方法包括将所述感染性克隆导入宿主细胞中，在允许所述感染性克隆复制的条件下培养所述转化细胞，产生重组冠形病毒，从所述培养物回收重组冠形病毒。
本发明另一个目的在于制备修饰重组冠形病毒的方法，该方法包括将所述重组病毒载体导入宿主细胞中，在允许病毒载体复制和修饰重组冠形病毒产生的条件下培养转化细胞，从所述培养物回收修饰的重组冠形病毒。
本发明另一个目的在于制备目的产物的方法，该方法包括在允许表达异源DNA序列的条件下培养包含所述重组病毒载体的宿主细胞。
包含上述感染性克隆或重组病毒载体的细胞构成本发明再一个目的。
本发明又一个目的在于一组疫苗，所述疫苗保护动物抗感染性因子引起的感染。所述疫苗包含感染性载体和药学上可接受的赋形剂，所述感染性载体表达至少一种适于诱导抗各感染性因子的免疫应答的抗原或者至少一种对所述感染性因子提供保护的抗体。根据所述载体是表达一种还是多种能够针对一种或多种感染性因子诱导免疫应答的抗原或者是表达一种还是多种针对一种或多种感染性因子提供保护的抗体，所述疫苗可以为单价疫苗或多价疫苗。
本发明提供的另一个目的包括免疫动物的方法，该方法在于给予所述疫苗。
本发明提供编码冠形病毒感染性RNA的cDNA克隆，然后，本发明的感染性克隆包括(1)一个拷贝的冠形病毒感染性基因组RNA(gRNA)的互补DNA(cDNA)或者病毒RNA本身；(2)另一个基因的表达模块，该表达模块包含优化转录增强序列。
在本发明的一个特别实施方案中，所述冠形病毒为TGEV分离株、尤其是PUR46-MAD分离株(Sanchaz等，1990)，PUR46-MAD中存在的修饰是该病毒的S基因被C11克隆TGEV分离株的S基因代替或者被犬或人冠形病毒的S基因代替。
转录增强序列或启动子为位于冠形病毒各信使RNA(mRNA)5’末端的RNA序列，病毒聚合酶RNA与其结合以开始转录信使RNA(mRNA)。在一个特别优选的实施方案中，应用CMV的IE启动子由cDNA表达所述病毒基因组，因为使用该启动子获得高水平表达(Dubensky等，1996)，而且我们实验室以前获得的结果表明，得自TGEV冠形病毒的大的缺陷型基因组(9.7kb和15kb)表达的RNA在从其合成的细胞核转移至胞质的过程中不会发生剪接。
本发明的感染性克隆还包含转录终止序列和聚腺苷酸信号，例如来自BGH基因的序列。这些终止序列必须位于聚腺苷酸尾的3’末端。在一个特别实施方案中，本发明的感染性克隆包含24个A残基的聚腺苷酸尾以及BGH终止序列和聚腺苷酸化序列，它们之间间隔有HDV核酶序列。
所述病毒感染性cDNA已经插入其中的质粒为具有复制起点的DNA分子，因此，所述质粒有可能在合适细胞中复制。所使用的质粒是适合在合适宿主细胞例如细菌(例如大肠杆菌)中维持和扩增本发明感染性克隆的复制子。所述复制子一般带有抗生素抗性基因(例如cat)，使得可以对携带它的细胞进行选择。
在实施例1中介绍了在CMV的IE启动子控制下构建TGEV感染性克隆。所述cDNA的3-末端侧为24nt聚腺苷酸化序列、HDV核酶和BGH转录终止序列。
获得本发明感染性克隆的程序是由冠形病毒gRNA构建全长cDNA，然后连接转录调节元件。
为了提高cDNA的稳定性，由以BAC在合适启动子控制下克隆为cDNA的冠形病毒产生的DI基因组获得编码冠形病毒感染性gRNA的cDNA。然后鉴定细菌毒性序列，为了消除其毒性，去除所述毒性序列，在构建完成完整基因组之时、恰好在转染真核细胞之前插入所述毒性序列。通过包含所述冠形病毒基因组的BAC质粒转染支持病毒复制的真核细胞，可以重新构建病毒子代。
利用常规技术(Maniatis等，1989)连接转录调节元件。
可以应用常规遗传工程技术操作本发明的感染性克隆，以便插入至少一种编码确定活性的异源核酸序列，该序列处于所述感染性克隆中存在的启动子以及获得的表达载体包含的调节序列的控制之下。
本发明的感染性克隆具有许多用途，例如它既可以在基础研究中使用，例如用于研究冠形病毒的复制和转录机制，也可以在应用研究中使用，例如用于开发表达目的产物(蛋白、酶、抗体等)的有效系统。
可以用本发明感染性cDNA克隆转化合适细胞，并可以回收获得的包含所述冠形病毒完整基因组的病毒体。因此，本发明还提供制备重组冠形病毒的方法，该方法包括将本发明的感染性cDNA导入宿主细胞中；在允许表达和复制所述感染性克隆的条件下培养所述宿主细胞；回收由所述重组冠形病毒获得的病毒体，该病毒体包含所述冠形病毒的感染性基因组。可以用各种方法将本发明的感染性克隆导入宿主细胞中，例如用由本发明感染性克隆体外转录的RNA转染所述宿主细胞，或者用本发明感染性cDNA克隆感染所述宿主细胞。包含本发明感染性克隆的所述宿主细胞构成本发明的又一个目的。
本发明还提供一组得自本发明感染性克隆的重组病毒载体，此后称为本发明病毒载体。本发明病毒载体包括修饰后包含异源核酸的本发明感染性cDNA克隆，所述异源核酸在允许其表达的条件下插入所述感染性克隆中。
在本说明书中使用的术语“核酸”包括基因或基因片段，而且一般包括任何DNA或RNA分子。
在本发明使用的意义上，用于核酸的术语“异源”是指用以将所述异源核酸导入宿主细胞的载体中通常不存在的核酸序列。
可以包含在本发明病毒载体中的异源核酸可以是编码蛋白、肽、表位或任何目的基因产物(例如抗体、酶等)的基因或片段。所述异源核酸可以利用常规基因工程技术插入到本发明感染性克隆cDNA的任何合适区段中，例如在ORF1b之后或者基因N和7之间、起始密码子(AUG)之后以及所述基因的读框内；或者，在相当于其它ORF的区段中进行插入。构建本发明病毒载体时，插入异源核酸必须不能干扰任何基本病毒功能。
本发明病毒载体可以表达一种或多种活性。在表达多种活性的情况下，所述病毒载体包括与所要表达的活性同样多的异源核酸序列，异源核酸序列之前存在一个或多个启动子、或者一个启动子和不同核糖体识别位点(IRES，内部核糖体进入位点)或者不同启动子和一个核糖体识别位点。
因此，本发明提供生产目的产物的方法，该方法包括在允许所述异源核酸表达和允许目的产物回收的条件下培养包含本发明病毒载体的宿主细胞。包含本发明病毒载体的所述宿主细胞构成又一个本发明目的。
可以设计本发明病毒载体使得其种特异性和向性能够容易地受到控制。因为所述特性，本发明病毒载体的一个非常有趣的应用是作为目的基因载体或疫苗载体用于基因治疗，以便诱导针对不同病原体的免疫应答。
本发明还提供能够保护动物抗感染性因子引起的感染的疫苗，该疫苗包含(i)至少一种本发明病毒载体，该载体表达至少一种适合诱导针对所述感染性因子的免疫应答的抗原，或者表达抗所述感染性因子的保护抗体，以及任选包含(ii)药学上可接受的赋形剂。
在本发明使用的意义上，“诱导保护”应该理解为本发明病毒载体通过适当机制在接受生物(所免疫的动物)体内诱导免疫应答，所述适当机制例如增强细胞应答的物质(白介素、干扰素等)、细胞坏死因子和保护动物抗感染性因子引起的感染的相似物质诱导免疫应答的机制。
术语“动物”包括任何物种、优选哺乳动物(包括人类)的所有动物。
在本发明使用的意义上，术语“感染性因子”包括可以感染动物并且使动物致病的任何病毒、细菌、真菌、寄生虫或其他感染性因子。
在一个特别实施方案中，本发明提供的疫苗包含至少一种这样的本发明病毒载体该载体表达至少一种能够诱导针对在呼吸道粘膜或肠道粘膜内繁殖的不同感染性因子的系统免疫应答和/或粘膜免疫应答的抗原。本发明载体特别适合诱导粘膜免疫以及乳性免疫，乳性免疫对保护新生动物抗肠道感染具有特别的意义。
在另一个具体实施方案中，本发明提供的疫苗包含至少一种这样的本发明病毒载体它表达至少一种编码任何同种型抗体(例如IgG1、IgA等)的轻链和重链的基因，所述抗体保护性抗感染性因子。
可以控制种特异性，使得所述病毒载体可表达感染各种目标动物(人、狗、猫、猪等)的冠形病毒包膜的S蛋白，该S蛋白适合被相应动物种细胞受体识别。
本发明提供的疫苗可以是单价或多价疫苗，是单价还是多价疫苗取决于本发明病毒载体是表达一种还是多种能够诱导针对一种或多种感染性因子的免疫应答的抗原或者是表达一种还是多种抗一种或多种感染性因子的保护抗体。
在本发明的一个特别实施方案中，本发明提供的单价疫苗能够保护人、猪、狗和猫抵抗不同的人、猪、犬和猫感染性因子，而且通过表达具有需要种特异性的冠形病毒S糖蛋白控制向性。
针对猪感染性因子的单价疫苗可以包含表达一种抗原的载体，所述抗原选自基本上由以下猪病原体抗原组成的抗原组大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、猪细小病毒、钩端螺旋体属(Leptospira)、大肠杆菌、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelotrixrhusiopathiae)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、梭菌属菌(Clostridium sp.)、猪痢疾小蛇菌(Serpulina hydiosenteriae)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪呼吸道冠形病毒、轮状病毒，或者引起以下疾病的病原体猪呼吸及生殖综合征、Aujeszky氏病(假性狂犬病)、猪流感、或传染性胃肠炎；以及萎缩性鼻炎和增生性回肠炎的致病因子。针对犬感染性因子的单价疫苗可以包含表达一种抗原子的表达载体，所述抗原选自基本上由以下犬病原体抗原组成的抗原组犬疱疹病毒、1型和2型犬腺病毒、1型和2型犬细小病毒、犬呼吸道肠道病毒、犬轮状病毒、犬冠形病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬瘟病毒、狂犬病毒、逆转录病毒和犬杯状病毒。
针对猫感染性因子的单价疫苗可以包含表达一种抗原的表达载体，所述抗原选自基本上由以下猫病原体抗原组成的抗原组猫杯状病毒、猫免疫缺陷病毒、猫疱疹病毒、猫全白细胞减少症病毒、猫呼吸道肠道病毒、猫轮状病毒、猫冠形病毒、猫传染性腹膜炎病毒、狂犬病毒、猫鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)和猫白血病病毒。
所述载体可表达抗感染性因子的保护抗体，所述感染性因子例如猪、犬或猫感染性因子，例如以上列举的感染性因子。在一个具体实施方案中，所述载体表达中和TGEV的重组单克隆抗体(称为6A.C3)，该重组单克隆抗体表达为同种型IgG1或IgA，其中所述免疫球蛋白恒定部分为猪来源；或者所述载体表达中和人轮状病毒和猪轮状病毒的抗体。
关于所述赋形剂，可以使用诸如生理盐水或其它相似盐溶液的稀释剂。同样，所述疫苗也可以含有通常用于水型疫苗制剂和油型疫苗制剂的佐剂，水型疫苗制剂使用的佐剂有例如氢氧化铝、QuilA、铝凝胶悬浮液等，所述油型疫苗以矿物油、甘油酯、脂肪酸衍生物及其混合物为基质。
本发明疫苗也可以含有增强细胞应答(CRP)的物质，即增强辅助T细胞亚群(TH1和TH2)的物质，例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、γ-IFN(γ干扰素)、细胞坏死因子和理论上可以刺激接种动物的细胞免疫的相似物质。这些CRP物质可用于水型佐剂或油型佐剂的疫苗制剂。也可以使用另一种类型调节和免疫刺激细胞应答的佐剂，例如MDP(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激复合物)或脂质体。
本发明提供能够预防和保护动物抗不同感染性因子引起的感染的多价疫苗。所述多价疫苗可以由编码相应抗原的不同序列插入同一重组载体中的本发明病毒载体制得，或者通过构建独立的重组载体，然后将其混合在一起以联合接种，从而制得所述多价疫苗。因此，所述多价疫苗包含含一种以上异源核酸序列的病毒载体，所述异源核酸编码一种以上抗原；或者所述多价疫苗包含不同病毒载体，其中每种病毒载体表达至少一种不同抗原。
同样，可以使用编码抗感染性因子的保护抗体的序列代替编码所述抗原的序列，制备包含多价载体的多价疫苗。
在本发明的一个具体实施方案中，提供能够分别免疫人、猪、犬和猫抵抗不同的人、猪、犬和猫感染性因子的疫苗。为此，所述疫苗中包含的病毒载体必须表达以上列举的人、猪、犬或猫病原体的不同抗原或者其他抗原。
本发明疫苗可以以液体形式或冻干形式提供，而且可通过使所述重组系统悬浮在所述赋形剂中而制得。如果所述系统为冻干形式，则所述赋形剂本身可以为复制物质。
另一方面，本发明提供的疫苗可以与其他常规疫苗联合使用，本发明疫苗或者构成其中的一部分或者为用其他常规疫苗或重组疫苗稀释的稀释部分或冻干部分。
本发明提供的疫苗可以通过口服、经鼻、皮下、皮内、腹膜内、肌内或以气雾剂给予动物。
本发明还提供免疫动物、尤其是猪、犬和猫抵抗一种感染性因子或者同时抵抗不同感染性因子的方法，该方法包括口服、经鼻、皮下、皮内、腹膜内、肌内或气雾剂(或其组合方式)给予包含免疫有效量的本发明提供的重组系统的疫苗。
另外，本发明还提供保护新生动物抵抗感染所述动物的感染性因子的方法，该方法在于在妊娠期间或之前将本发明提供的疫苗口服、经鼻、皮下、皮内、腹膜内、肌内或者气雾剂给予(或者其组合给予)雌性动物，或者给予其子代。
下面借助实施例阐明本发明，实施例详细介绍了如何获得感染性克隆以及如何构建本发明病毒载体。不应该认为这些实施例限制本发明范围，而只是为了举例说明本发明。在所述实施例中，按照下面介绍的方法学进行细菌转化和培养、DNA纯化、序列分析和评价质粒稳定性的测定。
细菌转化全部质粒均通过电穿孔导入大肠杆菌DH10B菌株(Gibco BRL)，只是对以前介绍的方法(Shizuya等，1992)进行了略微改进。对于每次转化，在0.2-cm培养皿(BioRad)中混合2μL连接混合物和50μL感受态细菌，以200Ω、2.5kV和25μF进行电穿孔。然后，在每各转化物中加入1mL SOC培养基(Maniatis等，1989)，于37℃温育细胞45分钟，最后，在含12.5μg/mL氯霉素的LB SOC培养基(Maniatis等，1989)平板上检测重组菌落。
细菌的生长条件原初质粒中克隆有TGEV不完整基因组(图3)，于37℃培养含有原初质粒的细菌，该细菌显示正常生长动力学。另一方面，于30℃培养含有完整cDNA的BAC，目的是尽可能使稳定性最大化。尽管如此，菌落仍然变小，为了获得正常大小的菌落，必须使培养时间延长至24小时。
纯化DNA按照Woo介绍的方法(Woo等，1994)进行，只进行略微的改进。将单一菌落接种到4L含有氯霉素(12.5μg/ml)的LB中。于30℃培养18小时后，以6,000G离心收集细菌，采用Qiagen PlasmidMaxipreparations试剂盒按照生产商的建议纯化质粒。利用这种方法观测到，获得的质粒DNA污染了细菌DNA。为了消除污染的细菌DNA，利用在氯化铯梯度上以55,000rpm离心16小时纯化质粒DNA。根据质粒的大小，获得产率为15-30μg/L。
序列分析应用荧光染料标记的双脱氧核苷酸和温度抗性聚合酶(PerkinElmer)在自动测序仪(373 DNA测序仪，Applied Biosystems)上对DNA进行测序。所述试剂通过Applied Biosystems公司的试剂盒(ABIPRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)获得。用以进行测序反应的热循环仪为“GeneAmpPCR System 9600”(PerkinElmer)。
分别采用SeqMan II和Align(DNASTAR)程序连接序列以及进行其与TGEV共有序列的比较。检测发现与共有序列没有差异。
质粒稳定性在20mL含氯霉素(12.5μg/mL)的LB培养基中于30℃和37℃培养得自original glycerolates的含有重组pBeloBAC11质粒的细菌。该培养细菌被认为是第0代细菌。将细菌稀释106倍，然后于30℃和37℃培养16小时。连续8天进行连续传代(每次培养传代相当于约20个世代细菌)。在第0代和第8代(160个世代)应用Miniprep纯化质粒DNA，并应用限制性内切核酸酶进行分析。含有部分TGEV基因组的2种质粒非常稳定，而含有TGEV完整基因组的质粒在40个世代后呈现一定的不稳定性(此时约80％DNA呈现正确的限制图谱)。
实施例1构建基于得自TGEV的感染性cDNA克隆的重组载体1.1制备TGEV感染性cDNA为了获得编码完整TGEV基因组的cDNA，我们以编码缺陷型DI-C基因组的cDNA为最初的基础材料(Méndez等，1996)。该cDNA长度大约为TGEV基因组的三分之一，以低拷贝pACNR1180质粒对其进行克隆(Ruggli等，1996)并测序。借助于互补病毒有效拯救(复制和包装)编码缺陷型基因组的cDNA(Méndez等，1996；Izeta等，1999)。
DI-C基因组在ORF 1a、1b以及S基因和7之间分别存在约10、1和8千碱基(kb)的3个(Δ1、Δ2和Δ3)缺失(参见图1)。
完成编码感染性TGEV基因组的cDNA序列遵循的策略是逐步掺入DI-C基因组缺失的序列，分析新制备的构建物的细菌毒性。该方面是非常重要的，因为科学文献充分证明，提供RNA病毒的cDNA的重组质粒一般生长差而且不稳定(Boyer和Haenni，1994；Rice等，1989；Mandl等，1997)。
要完成的第一个缺失是ORF 1b的缺失Δ2(1kb)，获得稳定的重组质粒。通过克隆cDNA片段A、B、C和D导入缺乏ORF 1a的序列(图1)(Almazan等，2000)，使得复制酶基因需要的所有信息是完整的。获得的重组质粒在细菌中是不稳定的，产生在片段B中导入添加和缺失的新质粒(Almazan等，2000)。有趣的是，消除包含核苷酸4,417和9,615之间含有的基因组区段的5,198bp ClaI-ClaI限制性片段(Penzes等，1999)获得在大肠杆菌DH10B菌株中相对稳定的质粒。然后通过克隆TGEV基因组3’末端的所有结构蛋白和非结构蛋白遗传信息加入缺失Δ3序列(图1)。
为了增强TGEV cDNA的稳定性，决定采用pBeloBAC11质粒(Kim等，1992)以BAC亚克隆TGEV cDNA(见图2)。pBeloBAC11质粒由H Shizuya和M.Simon(California Institute of Technology)惠赠。该质粒7,507bp大小，包括来自parB、parC、大肠杆菌F因子的复制起点(oriS)和保持每个细胞一个拷贝质粒必需的基因(parA和repE)。该质粒还提供作为选择标记的氯霉素抗性基因(cat)。在CMV的IE启动子控制下克隆所述cDNA，因为采用这种启动子获得高水平表达(Dubensky等，1996)，而且我们实验室以前获得结果表明，大的(9.7kb和15kb)TGEV来源缺陷型基因组表达的RNA在从细胞核内(RNA在细胞核内合成)转运到细胞质时不会被剪接(Izeta等，1999；Penzes等，1999；Almazan等，2000)。产生的TGEV cDNA(pBAC-TcDNA-ΔClaI)包含复制酶基因信息(缺失的5,198bp ClaI片段除外)和所有的结构蛋白和非结构蛋白基因信息。该cDNA的3’末端侧为24nt聚腺苷酸化序列、HDV核酶和BGH转录终止序列(Izeta等，1999)。另一方面，制备TGEV完整基因组必需的ClaI片段以BAC克隆，获得包含4,310和9,758之间的TGEV基因组区的质粒pBAC-B+C+D5’(见图3)。两种质粒均在大肠杆菌DH10B菌株中生长而且测定其整个序列。获得的序列与本文献结尾提供的TGEV的PUR46-MAD分离株的共有序列(SEQ ID NO1)相同，例外的是在核苷酸6,752(AG，沉默突变)和18,997(TC，沉默突变)位置存在两个取代，以及分离株C11的D基因取代PUR46-MAD的S基因的变化(这些变化在图4中标示出)。
此外，为了制备编码毒性TGEV的cDNA，用TGEV克隆11(此后称为C11)的S基因完全取代PUR46-MAD分离株的S基因，前者在呼吸道(＜106PFU/mL)和肠道(＜106PFU/mL)二者中的复制滴度均高，后者在呼吸道的复制水平高(＞106PFU/g组织)而在肠道的复制水平低(＜103PFU/mL)(Sanchaz等，1999)。C11的S基因的14个核苷酸不同于PUR46-MAD分离株的S基因，而且在C11的S基因的5’末端插入了6个核苷酸(见图4)(Sanchaz等，1999)。我们实验室以前的结果(Sanchaz等，1999)表明，直接重组获得、C11肠道分离株的S基因取代TGEV的PUR46-MAD分离株S基因的突变体获得肠道向性而且毒力增强，而不同于在感染猪的肠道复制非常低或者根本没有的TGEV的天然PUR46-MAD分离株。
通过以pBAC-TcDNA-ΔClaI质粒克隆从pBAC-B+C+D5’质粒获得的5,198bp ClaI-ClaI片段，由含有肠道分离株C11S基因的TGEVPUR46-MAD分离株构建cDNA，获得含有编码完整TGEV基因组的cDNA的pBAC-TcDNAFL质粒(图3)。
通过在大肠杆菌中生长160代后，分析构建感染性cDNA克隆使用的质粒(pBAC-TcDNA-ΔClaI和pBAC-ClaIF)以及含有完整cDNA的质粒(pBAC-TcDNAFL)在细菌中的稳定性。借助于限制性酶消化纯化DNA分析稳定性。没有检测到缺失或插入，但是不能排除所使用的分析技术不能检测出pBAC-TcDNA-ΔClaI质粒和pBAC-B+C+D5’质粒中存在的微小变化。在含有TGEV完整基因组的pBAC-TcDNA质粒的情况下，40代后检测到一定的不稳定性(此时约80％DNA呈现正确的限制图谱)。然而，这种略微的不稳定性并不妨碍拯救感染性病毒，因为细菌生长20代(4L培养物)足以产生允许拯救所述病毒的质粒DNA量。
1.2由编码完整基因组的cDNA拯救感染性TGEV用pBAC-TcDNAFL质粒转染ST细胞。转染后48小时，收集培养物上清液，传代入ST细胞6次(见图5)。从第二代开始，感染后14小时细胞病变明显，之后在感染后20小时扩展至几乎所有形成单层的细胞均呈现细胞病变(见图6)。另一方面，拯救病毒的滴度随传代迅速增高，从第三代起滴度达到约108PFU/mL(见图7)。重复实验5次，在所有5次情况都回收到相似滴度的感染性病毒，而在非转染ST细胞或用相似质粒(ClaI-ClaI片段的存在方向相反)转染的ST细胞情况下，从未回收到病毒。
为了消除所获得的病毒为污染产物的可能性，对使用拯救病毒基因组RNA作为模板通过RT-PCR扩增的cDNA片段进行测序，测定位置6,752和18,997的序列。序列分析确定位置6,752和18,997的核苷酸是所述cDNA中存在的核苷酸。而且，在S基因的cDNA序列中，拯救病毒于位置20,990存在限制性位点DraIII，同对C11的S基因的预料相同(图8)。这3个遗传标记的存在证实所述分离病毒来自所述cDNA。
在更深入表征所制备的病毒时，通过对用pBAC-TcDNAFL质粒转染后回收到的病毒(TcDNA)感染细胞或者TGEV的PUR46-MAD分离株感染细胞进行免疫荧光检测，从而进行比较分析。为此，使用识别C11分离株和PUR46-MAD分离株二者或者只识别后者的特异性多克隆抗体和单克隆抗体(见图10)。所获得的结果证实新TcDNA病毒的预期抗原性。TGEV特异性多克隆抗体、预期的S蛋白特异性单克隆抗体(ID.B12和6A.C3)以及M(3B.B3)和N(3B.D8)蛋白特异性单克隆抗体均识别TcDNA和PUR46-MAD二者。所获得的数据说明，所制备的病毒存在PUR46-MAD分离株的M和N蛋白以及C11分离株的S蛋白，正如用原初cDNA所设计的一样。
1.3体内感染性和毒力为了分析TcDNA病毒的体内感染性，用从第六代克隆的病毒接种一组新生小猪(5只)，分析其死亡率。接种的5只小猪在接种后3-4天死亡，说明TcDNA病毒是毒性病毒。相反，仅用稀释的TcDNA病毒接种而且维持在相同条件下的2只小猪没有任何变化。
1.4通过修饰转录调节序列优化表达水平冠形病毒通过RNA依赖性过程合成RNA，其中mRNA从负极性模板转录。在TGEV中，出现的保守共有序列CUAAAC恰好位于大多数基因之前。这些序列是亚基因组mRNA转录的信号。根据冠形病毒和宿主的类型，冠形病毒中存在6-8种大小不同的mRNA。最大的mRNA对应于基因组RNA，它再用作ORF 1a和1b的mRNA。其余mRNA对应于各亚基因组mRNA。这些RNA从大到小命名为mRNA 1-7。另一方面，在最初描述的mRNA组之后发现的某些mRNA的命名为相应的mRNA名称-数字，例如mRNA 2-1。所述各种mRNA相对于基因组RNA结构存在共同末端结构。除了最小的mRNA之外，其余mRNA在结构上为多顺反子mRNA，尽管一般来说仅最靠近5’的ORF被翻译。
采用最小基因间(IG)序列CUAAAC 5’末端侧不同序列(图11)、IG序列3’末端侧不同序列(图12)和不同插入位点(图13)研究了标记基因(GUS)的表达效率。获得的结果(图11-13)表明，以下组成的TRS实现最佳表达(i)TGEV N基因共有序列侧的-88核苷酸；(ii)IG序列；(iii)S基因的IG序列3’侧序列。此外，与有关异源基因插入点获得的结果一致，当异源基因位于基因组3’末端时表达水平最高。诸如已经介绍的TRS可使GUS的表达水平为2-8μg/106细胞。
1.5表达系统的组织特异性许多病原体通过粘膜进入宿主。为了防止这种感染，重要的是开发可诱导高水平分泌型免疫的表达系统。通过给予呼吸道和肠道相关性淋巴结抗原，基本可达到此目的。为了达到此目的，而且一般来说为了使基因表达控制在目的组织，研究了TGEV向性的分子基础。这些研究表明，通过构建含有需要向性的冠形病毒S基因的重组病毒，可以改进TGEV组织特异性(Ballesteros等，1997；Sanchez等，1999)。该信息使得可以构建以具有呼吸道或肠道向性的冠形病毒cDNA基因组为基础的表达系统。
1.6使用感染性cDNA表达PRRSV ORF5编码的病毒抗原为了优化异源基因表达水平，构建物的组成为可交换模块式载体，其两侧为促进TRS和载体中的异源基因交换的克隆序列。以下结构获得最佳表达(约10μg/106细胞)PRRSV(猪呼吸及生殖综合征病毒)的ORF 5，其5’末端侧为最小IGS共有序列(CUAAAC)，共有序列之前为病毒核衣壳基因(N)侧翼-88个核苷酸；其3’末端侧为限制性位点SalI(GTCGAC)和类似于Kozak(AC)GACC的序列。原则上，这样的异源基因表达水平高于诱导免疫应答需要的水平。异源基因插入先前由病毒非必需基因3a和3b占据的位置。
1.7在猪体内诱导对所述cDNA源性病毒载体表达的抗原的免疫应答使用得自上述cDNA和TRS的相同类型的病毒载体，高水平表达编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因(20μg蛋白/106猪睾丸细胞、ST细胞)。在细胞培养物中表达水平稳定20代以上。此外，经口、鼻内和胃内途径给予活病毒载体免疫一组猪，检测到对所述病毒载体和GFP二者的强体液免疫应答。有趣的是，给予3剂所述病毒载体后，没有在接种的猪观测到继发效应。
1.8构建表达外源基因而不产生感染性病毒的安全病毒载体对于人类载体设计，生物安全性是优先考虑的因素。为了达到此目的，需要在载体内工程操作3种类型的安全保证措施。其中2种操作的基础是缺失病毒复制必需的2种病毒组分，这2种病毒组分作图在病毒基因组的不同位置。包装细胞系反式提供这些组分。这种细胞(幼苍鼠肾脏，BHK)表达缺失的编码所述病毒必需的结构蛋白(包膜E蛋白和膜M蛋白)的基因。第三种安全保证是使病毒基因组的包装信号改变位置，这样防止重组恢复产生感染性病毒，从而产生有效表达异源基因但是甚至不能感染最近的相邻细胞的自杀载体。
关于设计用于人类的新型载体，我们还不能生产可在人类繁殖的新型病毒，因为这种载体不能在人体内细胞之间传递。所述载体基于复制缺陷型病毒。它通过利用互补所述病毒缺失的包装细胞而仅在疫苗工厂内生长。这些安全保证是工程冠形病毒的新措施。具有新的向性的重组病毒至少可在猫细胞中复制，因为猫细胞可复制人、猪、犬和猫冠形病毒。
微生物保藏携带含有本发明感染性克隆的质粒的大肠杆菌鉴定为大肠杆菌pBAC-TcDNAFL，已经于1999年11月24日保藏于西班牙典型保藏物中心(CECT)(Burjassot(Valencia)，其保藏号为CECT 5265。
文献目录Ahlquist，P.，R. French，M.Janda和L.S.Loesch-Fries.(1984)，源于克隆病毒cDNA的多组分RNA植物病毒的感染，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.817066-7070。
Almazan，F.，J.M.Gonzalez，Z.Penzes，A.Izeta，E.Calvo，J.Plana-Duran和L.Enjuanes.(2000)，最大RNA病毒基因组工程为感染性细菌人工染色体，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.975516-5521。
Ballesteros，M.L.，C.M.Sanchez和L.Enjuanes.(1997)，传染性胃肠炎冠形病毒刺突蛋白N末端两个氨基酸改变导致肠向性丧失，Virology.227378-388。
Baron，M.D.和T.Barrett.(1997)，从克隆cDNA拯救牛瘟病毒，J.Virol.711265-1271。
Boyer，J.C.，A.L.和Haenni.(1994)，RNA病毒的感染性转录物和cDNA克隆，Virology.198415-426。
Chang，R.Y.，M.A.Hofmann，P.B.Sethna和D.A.Brian.(1994)，冠形病毒前导序列在干扰缺损性RNA复制中的顺式作用，J.Virol.688223-8231。
Collins，P.L.，M.G.Hill，E.Camargo，H.Grosfeld，R.M.Chanock和B.R.Murphy.(1995)，用克隆dCNA产生感染性人呼吸道合胞病毒证实M2mRNA 5’近端可读框的转录延长因子在基因表达中的基本作用而且提供了开发疫苗的可能性，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9211563-11567。
Davis，N.L.，L.V.Willis，J.F.Smith和R.E.Johnston.(1989)，由cDNA克隆体外合成感染性委内瑞拉马脑炎病毒RNA分析存活缺失突变体，Virology.171189-204。
Dubensky，J.，T.W.，D.A.Driver，J.M.Polo，B.A.Belli，E.M.Latham，C.E.Ibanez，S.Chada，D.Brumm，T.A.Banks，S.J.Mento，D.J.Jolly和S.M.W.Chang.(1996)，新培斯病毒DNA型病毒载体体外和体内基因转移的应用，J.Virol.70508-519。
Durbin，A.P.，S.L.Hall，J.W.Siew，S.S.whitehead，P.L.Collins和B.R.Murphy.(1997)，用cDNA回收感染性人3型副流感病毒，Virology.235323-332。
Enjuanes，L.，S.G.Siddell和W.J.Spaan.1998.Coronaviruses andArteriviruses.Plenum Press，New York。
Enjuanes，L.和B.A.M.Van der Zeijst.1995，传染性胃肠炎冠形病毒流行病学的分子基础，载于Coronaviridae，S.G.Siddell编著，PlenumPress，New York。
Frolov，I.，T.A.Hoffman，B.M.Pragai，S.A.Dryga，H.V.Huang，S.Schlesinger和C.M.Rice.(1996)，甲病毒型表达载体策略与应用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9311371-11377。
Garcin，D.，T.Pelet，P.Calain，L.Roux，J.Curran和D.Kolakofsky.(1995)，用于由cDNA回收感染性仙台副粘病毒的高度重组系统新一代重组系统，EMBO J.146087-6094。
Geigenmuller，U.，N.H.Ginzton和S.M.Matsui.(1997)，构建人1血清型星状病毒的基因组长度cDNA克隆以及合成感染性RNA转录物，J.Virol 711713-1717。
Izeta，A.，C.Smerdou，S.Alonso，Z.Penzes，A.Mendez，J.Plana-Durna和L.Enjuanes.(1999)，传染性胃肠炎冠形病毒来源的合成微小基因组的复制和包装，J.Virol.731535-1545。
Kim，U.-J.，H.Shizuya，P.de Jong，B.W.Birren和M.I.Simon.(1992)，在F因子型载体中稳定繁殖粘粒大小的人DNA插入物，Nucleic AcidsRes.201083-1085。
Lai，C.-J.，B.Zhao，H.Hori和M.Bray.(1991)，从4型登革病毒稳定克隆的全长cDNA转录感染性RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.885139-5143。
Lai，M.M.C.和D.Cavanagh.(1997)，冠形病毒的分子生物学，Adv.VirusRes.481-100。
Lai，M.M.C.，C.-L.Liao，Y.-J.Lin和X.Zhang.(1994)，冠形病毒大RNA病毒基因组如何复制和转录，Infect.Agents Dis.398-105。
Liljestrom，P.(1994)，甲病毒表达系统，Curr.Opin.Biotech.5495-500。
Liljestrom，P.和H.Garoff.(1991)，基于无名森林病毒复制子的新一代动物细胞表达载体，Bio/Technology.91356-1361。
Luytjes，W.，M.Krystal，M.Enami，J.D.Parvin和P.Palese.(1989)，流感病毒对外源基因的扩增、表达和包装，Cell.591107-1113。
Mandl，C.W.，M.Ecker，H.Holzmann，C.Kunz，F.X.Heinz.(1997)，蜱传脑炎病毒欧洲亚型原型株Neudoerfl和高毒力株Hypr的感染性cDNA克隆，J.Gen.Virol.781049-1057。
Maniatis，T.，E.F.Fritsh和J.Sambrook，(1989)，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York。
Mendez，A.，C.Smerdou，A.Izeta，F.Gebauer和L.Enjuanes.(1996)，传染性胃肠炎冠形病毒缺陷干扰基因组的分子特征包装和异质性，Virology.217495-507。
Penzes，Z.，A.Izeta，C.Smerdou，A.Mendez，M.L.Ballesteros和L.Enjuanes.(1999)，传染性胃肠炎冠形病毒株PUR46-MAD的完整核苷酸序列，提交出版中。
Pushko，P.，M.Parker，G.V.Ludwing，N.L.Davis，R.E.Johnston和J.F.Smith.(1997)，减毒委内瑞拉马脑炎病毒的复制辅助系统异源基因的体外表达和体内抗异源病原体的免疫，Virology，239389-410。
Racaniello，V.R.和D.Baltimore.(1981)，克隆的脊髓灰质炎病毒cDNA在哺乳动物细胞中是感染性的，Science.214916-919。
Radecke，F.，P.Spielhofer，H.Schneider，K.Kaelin，M.Huber，C.Dotsch，G.Christiansen和M.A.Billeter.(1995)，用克隆DNA拯救麻疹病毒，EMBO J.145773-5784。
Rice，C.M.，A.Grakoui，R.Galler和T.J.Chambers.(1989)，用体外连接制备的全长cDNA模板转录感染性黄热RNA，New Biologist.1285-296。
Rice，C.M.，R.Levis，J.H.Strauss和HV.Huang.(1987)，应用新培斯病毒cDNA克隆产生感染性RNA转录物作图致死突变、拯救温度敏感型标记和体外诱变产生限定突变体，J.Virol.613809-3819。
Rice，C.M.和J.H.Strauss.(1981)，合成、切割和序列分析与新培斯病毒26S信使RNA互补的DNA，J.Mol.Biol.150315-340。
Ruggli，N.，J.D.Tratschin，C.Mittelholzer，M.A.Hofmann.(1996)，典型猪热病毒株Alfort/187的核苷酸序列以及由稳定克隆的全长cDNA转录感染性RNA，J.Virol.703479-3487。
Sanchez，C.M.，G.Jimenez，M.D.Laviada，I.Correa，C.Sune，M.J.Bullido，F.Gebauer，C.Smerdou，P.Callebaut，J.M.Escribano和L.Enjuanes.(1990)，与传染性胃肠炎病毒有关的冠形病毒之间的抗原同源性，Virology.174410-417。
Sanchez，C.M.，F.Gebauer，C.Suen，A.Mendez，J.Dopazo和L.Enjuanes.(1992)，传染性胃肠炎冠形病毒的遗传进化和向性，Virology.19092-105。
Sanchez，C.M.，A.Izeta，J.M.Sanchez-Morgado，S.Alonso，I.Sola，M.Balasch，J.Plana-Duran和L.Enjuanes.(1999)，定向重组证实传染性胃肠炎冠形病毒的刺突基因是其肠向性和毒力的决定因素，J.Virol.737607-7618。
Sawicki，S.G.和D.L.Sawicki(1990)，冠形病毒转录亚基因组小鼠肝炎病毒复制中间体在RNA合成中的作用，J.Virol.641050-1056。
Schnell，M.J.，T.Mebatsion和K.-K.Conzelmann.(1994)，得自克隆cDNA的感染性狂犬病毒，EMBO J.134195-4203。
Sethna，P.B.，S.-L.Hung和D.A.Brian.(1989)，冠形病毒亚基因组负链RNA和mRNA复制子的潜在作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.865626-5630。
Shizuya，H.，B.Birren，U.-J.Kim，V.Mancino，T.Slepak，Y.Tachiiri和M.Simon.(1992)，使用F因子型载体在大肠杆菌中克隆和稳定维持300kbp人DNA片段，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.898794-8797。
Siddell，S.G.1995，The Coronaviridae.Plenum Press，New York，第418页。
Smerdou，C.和P.Liljestrom.(1999)，用于基因转移的非病毒扩增系统基于甲病毒的载体，Curr.Opin.Mol.Therap.1244-251。
Taniguchi，M.和F.A.P.Miller.(1978)，用富集抑制T细胞和AT淋巴瘤细胞系融合物获得的杂交瘤产生特异性抑制因子，J.Exp.Med.148373-382。
van der Most，R.G.和W.J.M.Spaan.1995，冠形病毒复制、转录和RNA重组，载于The Coronaviridae.S.G.Siddell编著，Plenum Press，NewYork.11-31。
Wang，K.，C.Boysen，H.Shizuya，M.I.Simon和L.Hood.(1997)，两代细菌人工染色体克隆载体的完整核苷酸序列，BioTechniques.23992-994。
Woo，S.-S.，J.Jiang，B.S.Gill，A.H.Paterson和R.A.Wing.(1994)，构建和表征Sorghum bicolor的细菌人二染色体文库，Nucleic Acids Res.224922-4931。
Zhang，X.，C.L.Liao和M.M.C.Lai.(1994)，冠形病毒前导RNA反式和顺式调节和起始亚基因组mRNA转录，J.Virol.684738-4746。
CPCH0462629D 说明书的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>康斯乔最高科学研究公司(Consejo Superior de Investigaciones Cientificas)<120>
<130>
<150>ES 9902673<151>1999-12-03<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>28588<212>DNA<213>猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissable Gastroentertitis V)<400>1acttttaaag taaagtgagt gtagcgtggc tatatctctt cttttacttt aactagcctt 60gtgctagatt ttgtcttcgg acaccaactc gaactaaacg aaatatttgt ctttctatga 120aatcatagag gacaagcgtt gattatttcc attcagtttg gcaatcactc cttggaacgg 180ggttgagcga acggtgcagt agggttccgt ccctatttcg taagtcgcct agtagtagcg 240agtgcggttc cgcccgtaca acgttgggta gaccgggttc cgtcctgtga tctccctcgc 300cggccgccag gagaatgagt tccaaacaat tcaagatcct tgttaatgag gactatcaag 360tcaacgtgcc tagtcttcct attcgtgacg tgttacagga aattaagtac tgctaccgta 420atggatttga gggctatgtt ttcgtaccag aatactgtcg tgacctagtt gattgcgatc 480gtaaggatca ctacgtcatt ggtgttcttg gtaacggagt aagtgatctt aaacctgttc 540ttcttaccga accctccgtc atgttgcaag gctttattgt tagagctaac tgcaatggcg 600ttcttgagga ctttgacctt aaaattgctc gcactggcag aggtgccata tatgttgatc 660aatacatgtg tggtgctgat ggaaaaccag tcattgaagg cgattttaag gactacttcg 720gtgatgaaga catcattgaa tttgaaggag aggagtacca ttgcgcttgg acaactgtgc 780gcgatgagaa accgctgaat cagcaaactc tctttaccat tcaggaaatc caatacaatc 840tggacattcc tcataaattg ccaaactgtg ctactagaca tgtagcacca ccagtcaaaa 900agaactctaa aatagttctg tctgaagatt acaagaagct ttatgatatc ttcggatcac 960cctttatggg aaatggtgac tgtcttagca aatgctttga cactcttcat tttatcgctg 1020ctactcttag atgcccgtgt ggttctgaaa gtagcggcgt tggagattgg actggtttta 1080agactgcctg ttgtggtctt tctggcaaag ttaagggtgt cactttgggt gatattaagc 1140ctggtgatgc tgttgtcact agtatgagcg caggtaaggg agttaagttc tttgccaatt 1200gtgttcttca atatgctggt gatgttgaag gtgtctccat ctggaaagtt attaaaactt 1260ttacagttga tgagactgta tgcacccctg gttttgaagg cgaattgaac gacttcatca 1320aacctgagag caaatcacta gttgcatgca gcgttaaaag agcattcatt actggtgata 1380ttgatgatgc tgtacatgat tgtatcatta caggaaaatt ggatcttagt accaaccttt 1440ttggtaatgt tggtctatta ttcaagaaga ctccatggtt tgtacaaaag tgtggtgcac 1500
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<400>5gctagcccag gcgcgcggta cc 2权利要求
1.一种制备DNA的多步骤方法，其中将一种下列DNA克隆入细菌人工染色体(BAC)中(a)包含全长拷贝RNA病毒基因组RNA(gRNA)的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一个或多个gRNA片段的DNA，所述片段编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白；或者(c)与(a)或(b)序列的同源性至少为60％的DNA。
2.权利要求1的方法，其中克隆入BAC的DNA还包含编码除了一种病毒结构蛋白或病毒非结构蛋白以外的若干或所有蛋白的序列。
3.权利要求1或2的方法，其中克隆入BAC的DNA还包含编码一种或若干种异源基因的序列。
4.权利要求3的方法，其中所述异源基因编码至少一种适合诱导抗感染因子的免疫应答的抗原、至少一种干扰感染因子复制的分子、抗感染因子的保护抗体、免疫调节蛋白、细胞因子、免疫增强剂或抗炎化合物。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少为5Kb。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少为15Kb。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中克隆入BAC的DNA大小至少为25Kb。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述BAC包含控制克隆入BAC的DNA转录的序列。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中一种所述病毒基因通过取代、缺失或加入核苷酸进行了修饰。
10.权利要求9的方法，其中所述病毒向性控制基因已经进行了修饰。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述病毒向性控制基因已经被另一种病毒的相应基因取代。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中克隆入BAC的DNA能够转录为可装配成病毒体的RNA。
13.权利要求12的方法，其中所述病毒体是感染性、减毒、复制缺陷型或灭活病毒。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述病毒天然存在正链基因组。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述病毒为微小RNA病毒、黄病毒、披膜病毒、冠形病毒、torovirus、arterivurs、calcivirus、弹状病毒、副粘病毒、线状病毒、博尔纳病毒(bornavirus)、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒或呼肠孤病毒。
16.一种制备病毒RNA的多步骤方法，其中按照权利要求1-15任一项制备DNA，使制得的DNA在合适宿主细胞中表达或者使所述DNA与化学物质、生物试剂和/或细胞提取物在允许所述DNA转录的条件下混合，最后分离出所述病毒RNA。
17.一种制备病毒体的多步骤方法，其中按照权利要求1-15任一项制备DNA，使制得的DNA在合适宿主细胞中表达或者使所述DNA与化学物质、生物试剂和/或细胞提取物在允许所述DNA转录和翻译的条件下混合，最后分离出所述病毒体。
18.权利要求17的方法，其中所述病毒体随后被灭活或杀死。
19.一种制备药用组合物的多步骤方法，其中按照权利要求1-15任一项制备DNA、按照权利要求16制备病毒RNA或者按照权利要求17或18制备病毒体，然后使其与药学上可接受的佐剂或载体混合。
20.权利要求19的方法，其中所述药物为保护人类或动物抗感染性疾病的疫苗。
21.权利要求19的方法，其中所述药物用于人类或动物的基因治疗。
22.一种包含得自冠形病毒基因组RNA(gRNA)的序列的DNA，所述序列与所述冠形病毒天然序列的同源性至少为60％，而且编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白，其中所述DNA的一个片段能够转录为可装配为病毒体的RNA。
23.权利要求22的DNA，它还包含编码异源基因的序列。
24.权利要求23的DNA，其中所述异源基因编码至少一种适合诱导抗感染性因子免疫应答的抗原、至少一种干扰感染性因子复制的分子、抗感染性因子的保护抗体、免疫调节蛋白、细胞因子、免疫增强剂或抗炎化合物。
25.权利要求22或24的DNA，其中所述片段的大小至少为25Kb
26.权利要求22-25任一项的DNA，它还包含来源于冠形病毒、编码除了一种病毒结构蛋白或一种病毒非结构蛋白以外的若干或所有蛋白的序列。
27.权利要求22-26任一项的DNA，它还包含来源于冠形病毒、编码冠形病毒所有结构蛋白或非结构蛋白的序列。
28.权利要求22-27任一项的DNA，它还包含控制所述病毒gRNA转录的序列。
29.权利要求22-28任一项的DNA，其中所述控制病毒gRNA转录的序列是巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)启动子。
30.权利要求22-29任一项的DNA，其中所述序列的3’末端侧为聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生长激素(BGH)的终止序列和聚腺苷酸化序列。
31.权利要求22-30任一项的DNA，其中所述病毒序列得自以下病毒分离株猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、牛冠形病毒(BoCV)、犬冠形病毒(CCoV)、猫病毒(FCoV)、人冠形病毒(HCoV)、toroviruses或arterivurses。
32.权利要求22-31任一项的DNA，其中所述病毒体是感染性病毒、非感染性病毒或复制缺陷型病毒。
33.权利要求22-32任一项的DNA，其中来源于冠形病毒的结构或非结构基因序列已经通过对天然基因序列取代、缺失或添加一个或多个核苷酸进行了修饰。
34.权利要求22-33任一项的DNA，其中所述S、N或M基因序列已经进行了修饰。
35.权利要求22-34任一项的DNA，其中已经修饰了冠形病毒来源的S基因序列，从而获得减毒病毒体。
36.权利要求22-35任一项的DNA，其中已经修饰了冠形病毒来源的S基因序列，从而获得向性不同于所述冠形病毒的病毒体。
37.一种载体，它包含权利要求22-36任一项的核酸。
38.权利要求37的载体，其中所述载体是质粒或细菌人工染色体(BAC)。
39.一种宿主细胞，它包含权利要求22-38任一项的核酸。
40.一种大肠杆菌菌株，它保藏于西班牙典型培养物保藏中心，保藏号为CECT 5265。
41.一种制备重组病毒体或重组病毒RNA的多步骤方法，其中将权利要求22-38任一项的DNA导入宿主细胞中，在允许表达所述DNA的条件下培养包含所述DNA的宿主细胞，最后回收所述重组病毒体或重组病毒RNA。
42.一种制备重组病毒体或重组病毒RNA的方法，其中使权利要求22-38任一项的DNA与化学物质、生物试剂和/或细胞提取物在允许所述DNA转录的条件下混合，最后回收所述重组病毒体或重组病毒RNA。
43.权利要求41或42的方法，其中所述DNA是权利要求23-38任一项的DNA。
44.一种病毒体，它是应用权利要求41-43任一项的方法获得的病毒体。
45.权利要求44的病毒体，其中所述病毒体是感染性、减毒、复制缺陷型或灭活病毒。
46.权利要求44或45的病毒体，其中所述病毒体包含修饰的S、M或N基因。
47.权利要求46的病毒体，其中对所述S基因修饰获得减毒病毒
48.权利要求46的病毒体，其中对所述S基因修饰获得向性不同的病毒体。
49.一种病毒RNA，它是应用权利要求41-43的方法获得的病毒RNA。
50.一种药用制剂，它包含权利要求22-38任一项的核酸、权利要求39或40的宿主细胞、权利要求41-48任一项的病毒体或权利要求49的病毒RNA。
51.一种能够保护动物或人类抗感染性因子引起的疾病的疫苗，该疫苗包含权利要求22-38任一项的核酸、权利要求39或40的宿主细胞、权利要求41-48任一项的病毒体或权利要求49的病毒RNA。
52.权利要求51的疫苗，其中所述核酸包含编码至少一种适合诱导抗所述感染性因子的免疫应答的抗原的序列、编码至少一种干扰所述感染性因子复制的基因的序列或者编码抗所述感染性因子的保护抗体的序列。
53.权利要求51或52的疫苗，其中所述病毒体载体表达至少一种复制干扰分子、能够诱导抗在呼吸道粘膜或肠道粘膜或其它组织中繁殖的不同感染性因子的系统免疫应答和/或粘膜免疫应答的抗原。
54.一种能够保护动物或人类抗一种以上感染性因子引起的感染的多价疫苗，它包含一种以上权利要求22-38任一项的核酸、权利要求39或40的宿主细胞、权利要求41-48任一项的病毒体或者权利要求49的病毒RNA，其中每一种表达一种适合诱导抗各所述感染性因子的免疫应答的抗原、一种干扰分子或一种抗各所述感染性因子的保护抗体。
55.权利要求51-54任一项的疫苗，它还包含药学上可接受的载体或稀释剂。
56.一种制备权利要求22-38任一项的DNA的多步骤方法，其中在表达启动子下将来源于冠形病毒的干扰缺陷型基因组克隆入BAC载体，然后再在所述缺陷型基因组中插入缺失的序列。
57.权利要求56制备DNA的方法，其中在重新插入所述DNA之前鉴定所述病毒基因组中的毒性序列。
58.权利要求56或57制备DNA的方法，其中所述病毒基因组中的毒性序列是完成所述基因组时重新插入的最后序列。
59.一种得自冠形病毒的感染性克隆，它包含在转录调节序列下克隆的冠形病毒基因组RNA(gRNA)的全长拷贝互补DNA(cDNA)。
60.权利要求59的感染性克隆，其中所述冠形病毒为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的分离株。
61.权利要求59或60的感染性克隆，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)表达启动子。
62.权利要求59-61任一项的感染性克隆，其中所述全长cDNA的3’末端侧为聚腺苷酸尾、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生长激素(BGH)的终止序列和聚腺苷酸化序列。
63.权利要求59-62任一项的感染性克隆，其中用细菌人工染色体(BAC)克隆所述感染性cDNA。
64.一种获得权利要求59-63任一项的感染性克隆的方法，该方法包括用冠形病毒gRNA构建全长cDNA以及装配转录调节元件。
65.权利要求64的方法，其中构建冠形病毒gRNA的全长cDNA包括(i)用BAC在表达启动子下克隆得自所述冠形病毒的干扰缺陷型基因组；(ii)完成缺失所述干扰缺陷型基因组，重建相对于所述感染性gRNA的缺失序列；(iii)鉴定对在其中进行克隆的细菌具有毒性的序列，取出毒性序列，恰好转染真核细胞之前插入所述毒性序列以获得相当于冠形病毒gRNA的cDNA克隆。
66.一种重组病毒载体，它包含权利要求59-63任一项的感染性克隆或者按照权利要求58或59任一项的方法获得的感染性克隆，所述感染性克隆经修饰含有一种异源核酸，所述异源核酸在允许其表达的条件下插入所述感染性克隆。
67.权利要求60的载体，其中在编码目的基因产物的基因和基因片段之间选择所述异源核酸。
68.一种制备目的产物的方法，该方法包括在允许所述异源核酸表达和目的产物回收的条件下培养包含权利要求60或61任一项的病毒载体的宿主细胞。
69.一种制备修饰重组冠形病毒的方法，所述修饰重组冠形病毒在相当于冠形病毒基因组的cDNA序列中包含异源核酸，所述方法包括将权利要求60或61任一项的病毒载体导入宿主细胞中，在允许所述病毒载体表达和复制以及允许由所述修饰重组冠形病毒获得的病毒体回收的条件下培养包含所述病毒载体的所述宿主细胞。
70.一种能够保护动物抗感染性因子引起的感染的疫苗，它包含(i)至少一种权利要求60或61的病毒载体，该病毒载体表达至少一种适合诱导抗所述感染性因子的免疫应答的抗原、或者表达一种抗所述感染性因子的保护抗体，以及任选包含(ii)药学上可接受的赋形剂。
71.权利要求64的疫苗，其中所述病毒载体表达至少一种能够诱导抗不同感染性因子的系统免疫应答和/或粘膜免疫应答的抗原，所述感染性因子在呼吸道粘膜或肠道粘膜中繁殖。
72.一种能够保护动物抗一种以上感染性因子引起的感染的多价疫苗，它包括(i)权利要求60或61的病毒载体，该病毒载体表达适合诱导抗所述感染因子的免疫应答的抗原、或抗所述感染性因子的保护抗体，以及任选包含(ii)药学上可接受的赋形剂。
73.一种能够保护动物抗一种以上感染性因子引起的感染的多价疫苗，它包含(i)一种以上权利要求60或61的病毒载体，其中每种病毒载体表达适合诱导抗各所述感染性因子的免疫应答的抗原或者抗各所述感染性因子的保护抗体，以及任选包含(ii)药学上可接受的赋形剂。
74.一种制备重组冠形病毒的方法，该方法包括将权利要求59-63任一项的感染性克隆或者按照权利要求64或65任一项方法获得的感染性克隆导入宿主细胞中，在允许所述感染性克隆表达和复制的条件下培养包含所述感染性克隆的所述宿主细胞，最后回收由包含所述冠形病毒完整基因组的重组冠形病毒获得的病毒体。
全文摘要
本发明涉及多步骤制备DNA的方法，该方法包括将一种下列DNA克隆入细菌人工染色体(BAC)(a)包含基因组RNA (gRNA)或RNA病毒的全长拷贝的DNA；或者(b)包含RNA病毒的一个或若干个gRNA片段的DNA，所述gRNA片段编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一种结构蛋白或非结构蛋白；或者(c)与(a)或(b)的序列具有至少60％同源性的DNA。此外，本发明还提供包含冠形病毒基因组RNA(gRNA)来源的序列的DNA，所述序列与冠形病毒天然序列的同源性至少为60％，而且编码RNA依赖性RNA聚合酶和至少一个结构蛋白或非结构蛋白，其中所述DNA的一个片段能够转录为可装配为病毒体的RNA。本发明进一步公开了应用所述核酸制备病毒RNA或病毒体以及包含所述DNA、病毒RNA或病毒体的药用制剂。
文档编号C12N1/21GK1616670SQ200410078978
公开日2005年5月18日 申请日期2000年11月30日 优先权日1999年12月3日
发明者桑切斯 L·恩朱尔尼斯 申请人:康斯乔最高科学研究公司