专利名称：一种分离裸子植物花粉粒原生质体的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离植物花粉粒原生质体的方法，特别涉及一种分离裸子植物花粉粒原生质体的方法。
背景技术：
由于花粉粒具有结构简单、群体数量大、易于离体操作等特征，因而被认为是生物技术领域理想的细胞体系。植物花粉粒的壁通常由纤维素、果胶质等组成的内壁和孢粉素组成的外壁构成，其中内壁可通过酶解的方法去除，而外壁中的孢粉素则缺乏有效的可使之降解的酶。
花粉粒原生质体是指去掉花粉壁的由质膜包围的原生质，不仅是外源基因的良好受体，还具有原生质体及单倍体的特点以及能够与体细胞原生质体融合等性质，使得研究者对其产生极大兴趣，但是迄今为止还没有分离裸子植物花粉原生质体的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的生物学研究相对被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是提供一种较快速分离裸子植物花粉粒原生质体的方法。
本发明所提供的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法是用含1.5％-3％纤维素酶和0.8％-2％离析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒5-7小时，得到裸子植物花粉粒原生质体；所述百分数为质量百分含量。
为了获得更好的酶解效果，所述酶解液是以含0.01％硼酸和0.01％-0.03％氯化钙的10％-15％蔗糖溶液配制的。
所述裸子植物花粉粒与酶解液的质量比可为1/20-1/5。
所述酶解的温度可为24-27℃。
为了加快酶解速度可将加入裸子植物花粉粒的酶解液在60-150rpm的摇床上振荡。
酶解5-7小时后，通过离心法收集得到的沉淀即为裸子植物花粉粒原生质体。所述离心的转速可为1000-2000r/min。
所述纤维素酶可为市售的各种纤维素酶(尤以cellulase R-10(Yakult Honsha Co.Ltd)效果最佳)，所述离析酶可为市售的各种离析酶(尤以macerozyme R-10(Yakult Honsha Co.Ltd)效果最佳)。
本发明特别适用于松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的裸子植物，其中松杉纲中效果较突出的有白皮松、青扦、红松、油松、云杉、冷杉等松科裸子植物，银杏纲的代表是银杏，苏铁纲的代表为苏铁。
上述百分比浓度均为质量百分比浓度。
本发明的方法利用纤维素酶酶解花粉内壁的纤维素成分，利用离析酶降解花粉内壁中的果胶质等组分，利用蔗糖维持溶液的渗透压，利用硼酸及氯化钙保护原生质体膜的稳定性，并使得所得到的原生质体在较长时间内保持活性状态。该方法快速、简单易行，可获得大量具有活性的裸子植物的花粉粒原生质体，具有较大的实际应用价值。
说明书附1为分离到的白皮松花粉粒原生质体在荧光显微镜下的观察结果图2为分离到的青扦花粉粒原生质体在荧光显微镜下的观察结果具体实施方式
如无特别指明，以下实施例中的百分比浓度均为质量百分比浓度。
实施例1、分离白皮松花粉粒原生质体包括以下步骤1)将成熟的白皮松花粉粒室温下进行干燥后，-20℃保存备用；2)配制含0.01％硼酸(H3BO3)和0.01％氯化钙(CaCl2)的15％蔗糖溶液；3)用步骤2)的溶液配制含2％纤维素酶(cellulase R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)和1.5％离析酶(macerozyme R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液；4)将步骤1)的白皮松花粉粒500μg在室温下回温后，置于步骤3)的酶解液20ml中，25℃ 120rpm的摇床上振荡酶解6小时；5)1000-2000r/min离心收集沉淀，得到180μg沉淀，该沉淀即为白皮松花粉粒原生质体，将该沉淀悬浮于10ml步骤2)的蔗糖溶液中，得到含有白皮松花粉粒原生质体的悬浮液；6)镜检向步骤5)的悬浮液中加入0.5ml浓度为0.1g/l的FDA溶液(该FDA溶液是由丙酮按质量体积比配制成浓度为0.1g/l的母液)，用荧光显微镜进行镜检，结果如
图1所示。白皮松花粉原生质体的分离率高达70％，而且有活性的原生质体占90％以上，说明该方法可快速有效分离得到白皮松花粉粒原生质体。
实施例2、分离青扦花粉粒原生质体包括以下步骤1)将成熟的青扦花粉粒室温下进行干燥后，-20℃保存备用；
2)配制含0.01％硼酸(H3BO3)和0.03％氯化钙(CaCl2)的12％蔗糖溶液；3)用步骤2)的溶液配制含3％纤维素酶(cellulase R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)和2％离析酶(macerozyme R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液；4)将步骤1)的青扦花粉粒500μg在室温下回温后，置于步骤3)的酶解液20ml中，25℃ 120rpm的摇床上振荡酶解6.5小时；5)1500-2000r/min离心收集沉淀，得到210μg沉淀，该沉淀即为青扦花粉粒原生质体，将该沉淀悬浮于10ml步骤2)的蔗糖溶液中，得到含有青扦花粉粒原生质体的悬浮液；6)镜检向步骤5)的悬浮液中加入0.5ml浓度为0.1g/l的FDA溶液，用荧光显微镜进行镜检，结果如图2所示。青扦花粉原生质体的分离率高达65％，而且有活性的原生质体在总原生质体中占92％以上，说明该方法可快速有效分离得到有活性的青扦花粉粒原生质体。
权利要求
1.一种分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，是用含1.5％-3％纤维素酶和0.8％-2％离析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒5-7小时，得到裸子植物花粉粒原生质体；所述百分数为质量百分含量。
2.根据权利要求1所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于所述酶解液是以含0.01％硼酸和0.01％-0.03％CaCl2的10％-15％蔗糖溶液配制的；所述百分数为质量百分含量。
3.根据权利要求1或2所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于所述裸子植物花粉粒与酶解液的质量比为1/20-1/5。
4.根据权利要求1或2所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于所述酶解温度为24-27℃。
5.根据权利要求1或2所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于酶解5-7小时后，通过离心法收集得到的沉淀即为裸子植物花粉粒原生质体；所述离心的转速为1000-2000r/min。
6.根据权利要求1或2所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于所述裸子植物为松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的裸子植物。
7.根据权利要求6所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于所述松杉纲为松科裸子植物；所述银杏纲裸子植物为银杏；所述苏铁纲裸子植物为苏铁。
8.根据权利要求7所述的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其特征在于述松科裸子植物为白皮松、青扦、红松、油松、云杉、冷杉。
全文摘要
本发明公开了一种分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，其目的是提供一种较快速分离裸子植物花粉粒原生质体的方法。本发明的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法，是用含1.5％－3％纤维素酶和0.8％－2％离析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒5－7小时，得到裸子植物花粉粒原生质体。本发明的分离裸子植物花粉粒原生质体的方法快速、简单易行，可获得大量具有活性的裸子植物花粉粒原生质体，具有较大的实际应用价值。
文档编号C12N5/04GK1763179SQ200410083788
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月22日 优先权日2004年10月22日
发明者林金星, 房克凤 申请人:中国科学院植物研究所