专利名称：酵母菌株CGMCC No.1189、培养方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个微生物菌株、培养方法以及由于其能同化内醚糖而具备的用途。
随着热解技术在美国和加拿大等少数发达国家取得重大进展，特别是采用快速热解工艺使得从生物质获得的热解产物，内醚糖(levoglucosan，1，6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖)产量的大副提高(接近40％左右)，利用热解产物代替粮食作为微生物发酵碳源和能源的研究越来越具有吸引力。
内醚糖在自然界中十分稀少，发现能同化它的微生物也存在一定的难度。到目前为止，国外仅发现三个研究者(Nakagawa、Prosen和Nakahara)从事这方面的研究，他们发现有霉菌、酵母和节细菌能同化内醚糖。并在此基础上，阐明了内醚糖在微生物细胞内的代谢机制。所有能在内醚糖上生长的真核微生物都具有内醚糖激酶，并通过它将内醚糖催化水解成6-磷酸葡萄糖而进入糖酵解途径。原核微生物在利用内醚糖时与真核微生物有明显的不同，它先通过三步酶促反应，将内醚糖转化成葡萄糖，然后进入糖酵解途径。这三步酶促反应包括内醚糖的脱氢、水解和依赖辅酶NAD的还原反应。然而，迄今为止，国内还没有人以内醚糖为唯一碳源和能源测试过菌种库内保存的微生物菌种，也没有从自然界筛选和分离过这样的微生物。
本发明的目的是提供一支高效同化内醚糖的酵母菌株。
本发明目的还提供了一种培养上述菌株的方法。本发明的另一个目的是提供一种上述菌株的用途，即作为同化内醚糖的菌种和基因资源。
本发明所提供的同化内醚糖的酵母菌株是斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi，该菌株已于2004年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1189，该普通微生物中心地址在北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。该菌株系从全国各地的土壤中分离到的上百个菌株中经大量筛选获得的一支纯的酵母菌株。在显微镜下观察，该菌细胞球形、卵形，大小为(3.0-4.8)×(3.0-4.8)μm。在液体培养基里，该菌形成菌环。在固体培养基里，该菌菌落粘稠状，淡琥珀色，表面光滑，有光泽，边缘整齐，无假菌丝产生。
本发明培养上述酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi的方法，通常可用下面所描述的步骤进行。用接种环挑取该菌菌体接到斜面上，在25-30℃下，斜面培养基上生长1-3天，挑取菌体在25-30℃下，培养液中培养1-3天，所述的培养基组成为内醚糖2％、(NH4)2SO4 0.5％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％，pH5.0，琼脂2％，液体培养基不加琼脂。
本发明中所述斜面培养基中内醚糖推荐使用作为碳源，氮源用(NH4)2SO4。所述斜面培养基和培养液中推荐pH为5.0，可用无机酸如稀硫酸和无机碱如氢氧化钠调节pH至5。
本发明的酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi是一株具有极高活力，对内醚糖具有极高同化能力的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变异。可以用作以内醚糖为主要碳源，生产菌体蛋白。也可以从该菌株克隆同化内醚糖的基因，如内醚糖激酶基因，构建以内醚糖为碳源，并具有其它工业用途的工程菌株。由于前已述及内醚糖可以从生物质经快速热解而大量获得，因此，该菌株具有潜在的工业化应用前景。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。
实施例1 菌体的培养用接种环挑取酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi接到上述斜面上，在温度设置为28℃的培养箱里，培养1-3天，就会出现白色的菌体。然后，用接种环从斜面上挑取生长良好的菌体接到装有培养液的三角瓶中，在温度设置为28℃、转速为200rmp的摇床上培养1-3天，所得菌体离心(9000rmp)10min，菌体用无菌生理盐水(0.8％)和无菌水洗涤，再离心，反复2-3次，即可获得白色无污染的该酵母细胞。
如前所述，培养该菌株的培养基组成为内醚糖2％、(NH4)2SO40.5％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.05％，pH5.0，琼脂2％，液体培养基不加琼脂。
上述培养基和培养液均在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
实施例2 内醚糖的同化酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi按实施例1的方法培养至对数期，用移液器在无菌条件下，移取培养液，并按10％(v/v)的比例加到测试内醚糖同化能力的培养基中，在温度设置为28℃、转速为200rmp的摇床上培养两天。将培养液离心(9000rmp)10min，去除细胞，用高效液湘色谱(HPLC)测定培养基在培养前后内醚糖的含量，计算内醚糖的利用率。利用率(％)＝(培养前内醚糖含量-培养后内醚糖含量)/培养前内醚糖含量×100。在该培养条件下，酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi对内醚糖的利用率为64.1％。测试同化能力的培养基为内醚糖4％，(NH4)2SO41％，KH2PO40.2％，MgSO4.7H2O 0.1％，Yeast extract 0.3％，Peptone 0.2％，pH5.0。上述培养基和培养液均在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
实施例3 利用原生质体融合技术构建转化内醚糖为乙醇的工程菌株酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi可以作为构建其它工程菌的亲本菌株。按实施例1的培养方法，培养该菌株至对数期，并离心获得菌体细胞。用2％蜗牛酶+2％纤维素酶酶解4h，获得原生质体。同时将另一酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae 2.399(CGMCC No.2.399，该菌株不能利用内醚糖)在完全培养基上培养至对数期，收获的菌体细胞用1％蜗牛酶培养10min，获得该菌的原生质体。将这两个酵母细胞的原生质体在30％PEG诱导作用下融合，并将融合完的产品涂布到再生培养基上，在37℃下培养3-7天，得到融合子的菌落。从这些菌落中，经连续传代培养，分离筛选，可以得到能发酵内醚糖为酒精的工程菌株。
完全培养基(YPD)蛋白胨2％，葡萄糖2％，酵母粉1％，pH5.5；再生基础培养基(RMM)YNB(无氨基酸酵母氮源，Difco)0.67％，内醚糖2％，CaCl20.01mol/l，甘露醇0.8mol/l或者山梨醇0.8mol/l；发酵培养基(FMM)YNB(无氨基酸酵母氮源，Difco)0.67％，内醚糖2％。
上述培养基和培养液均在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
权利要求
1.一株能为同化内醚糖提供菌种和基因资源的酵母菌株，其特征是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的登记编号为CGMCC No.1189的酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi。在显微镜下观察，该菌细胞球形、卵形，大小为(3.0-4.8)×(3.0-4.8)μm。在液体培养基里，该菌形成菌环。在固体培养基里，该菌菌落粘稠状，淡琥珀色，表面光滑，有光泽，边缘整齐，无假菌丝产生。
2.权利要求书1所述酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi的培养方法，其特征是将该菌菌体接到斜面上，在25-30℃下，斜面培养基上生长1-3天，挑取菌体在25-30℃下，培养液中培养2-3天，经离心可以获得该菌株的纯细胞。所述的培养基组成为内醚糖(Levoglucosan)2％、(NH4)2SO40.5％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.05％，pH 5.0，琼脂2％，液体培养基不加琼脂。
3.权利要求书2所述的培养方法，其特征是所述的同化碳源是内醚糖(Levoglucosan)。
4.权利要求书1所述酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi的用途，其特征是用作同化内醚糖的菌种和基因资源。
5.权利要求书4所述的用途，其特征是以该菌为菌种，用内醚糖为碳源，生产菌体蛋白。
6.权利要求书4所述的用途，其特征是从该菌克隆同化内醚糖的基因或直接以该菌为亲本菌株构建可以将内醚糖转化为其它产物如燃料乙醇的工程菌株。
全文摘要
本发明是一种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的登记编号为CGMCC No.1189的酵母菌株斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi。此菌株系从土壤中大量筛选得到的一支纯的菌株。它在以内醚糖为碳源的培养基和培养液中生长良好。该菌可以内醚糖为碳源生产菌体蛋白，也可以为构建利用内醚糖的工程菌株提供菌种和基因资源。由于内醚糖可从纤维素物质经热解大量获得，因此该菌株的获得和专利保藏对纤维素物质的利用具有潜在意义。
文档编号C12N1/16GK1624104SQ20041008404
公开日2005年6月8日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者张洪勋, 余志晟 申请人:中国科学院生态环境研究中心