专利名称：一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。
背景技术：
植物在受到高盐、低温及干旱等逆境胁迫时，会引起细胞缺水。缺水信号经过一系列传递，从而引发许多与植物抗性相关基因的表达。Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在对逆境应答基因rd29A基因的启动子区域的研究中，发现了一个逆境胁迫应答顺势作用元件，即干旱应答元件(DRE，drought-responsive element)。此后，发现许多逆境应答基因启动子区域含有DRE元件。刘强等运用酵母单杂交方法(yeast one-hybrid method)又克隆出与DRE元件结合的反式作用因子编码基因，即转录因子干旱应答元件结合蛋白(DREB，drought-responsive element bindingprotein)基因。该DREB基因表达的产物与顺式作用元件DRE(普遍存在于植物体中)结合后，可激活一系列与植物抗性相关基因的表达。自从对DREB转录因子的研究工作开展以来，对其结构和功能的研究已成为生物化学及分子生物学等领域研究的热点。现已从拟南芥、棉花、玉米、小麦、水稻、油菜、番茄和大豆中分离到类似于DREB的基因，且这些基因都具有类似的功能，但是对草坪草有关DREB基因的研究鲜为报道。
DREB类转录因子是AP2家族中EREBP-like亚家族中的一个成员。DREB类转录因子含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。EREBP/AP2结构域的第14位氨基酸是缬氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，这两个氨基酸被认为是DREB转录因子与DRE顺式作用元件特异性结合的关键位点。
近年来，我国草坪业发展迅速，其中，西部大开发的计划之一就是改善西部恶劣的生态环境，因而更加迫切需要抗旱、抗寒、耐盐碱的优良草种。高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)是近年来广泛种植的优良草坪草，但其抗寒性和耐盐碱性较低限制了其在环境较恶劣的西部的推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的高羊茅干旱应答元件结合蛋白，名称为FaDREB2，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质。
其中，序列表中的SEQ ID №1由264个氨基酸残基组成，自氨基端第62-119位为AP2/EREBP保守结构域的氨基酸残基序列，其中自氨基端第75位和第80位氨基酸分别为缬氨酸和谷氨酸。
上述高羊茅干旱应答元件结合蛋白的编码基因(FaDREB2)也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由1087个碱基组成，其编码序列为自5’端第29到第823位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第212到第385位碱基为AP2/EREBP保守结构域的编码序列，编码58个氨基酸，自5’端第251到第253位碱基为缬氨酸的编码序列，自5’端第266到第268位碱基为谷氨酸的编码序列。
含有所述高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因的植物表达载体，细胞系，宿主菌以及扩增本发明所述基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明的干旱应答元件结合蛋白FaDREB2序列具有DREB转录因子家族共有的特征具有一个含有58个氨基酸的AP2/EREBP保守区，其中第14位和第19位的氨基酸序列分别为缬氨酸和谷氨酸。酵母单杂交实验证明该DREB转录因子具有转录激活功能。此外，用Real time RT-PCR方法，分析了的FaDREB2基因在低温、干旱、高盐及脱落酸ABA处理下的表达模式，结果表明FaDREB2基因明显受高盐和低温诱导表达，对干旱和ABA处理没有明显反应。
本发明的高羊茅干旱应答元件结合蛋白FaDREB2是一个受高盐、低温特异诱导的转录因子，可与多个逆境应答基因启动子共有的DRE调控元件特异结合，诱导这些基因表达，从而激活植物体内的多条逆境胁迫途径，提高抗逆能力。在实际应用中，可将本发明的含有高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因的表达载体导入植物(如高羊茅)中，调控植物(如高羊茅)的抗逆性(如抗寒耐盐碱特性)。
本发明的干旱应答元件结合蛋白FaDREB2可同时激活一系列抗性相关基因的表达，克服了传统植物抗逆基因工程中用单个功能基因提高抗逆性的局限性，使植物抗逆特性的大幅度提高成为可能。因此FaDREB2为基因工程改良植物耐逆性提供了一条全新的技术途径，尤其在草坪草抗逆性的综合改良过程中具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。
图1为冷处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果图2为盐处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果图3为干旱处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果图4为ABA处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果图5为冷处理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图5a为冷处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图6为盐处理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图6a为盐处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图7为干旱处理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图7a为干旱处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图8为脱落酸ABA处理下高羊茅FaDREB2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图8a为脱落酸ABA处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果图9为0mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB2酵母单杂交功能鉴定结果图10为20mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB2酵母单杂交功能鉴定结果图11为30mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB2酵母单杂交功能鉴定结果图12为40mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB2酵母单杂交功能鉴定结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，详见《分子克隆实验指南》(第三版)。
实施例1、从受盐诱导的高羊茅cDNA文库中钓取FaDREB包括如下步骤1、高羊茅盐诱导cDNA文库的构建1)将禾本科植物高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的种子浸泡于1％次氯酸钠溶液中消毒20分钟后，用无菌水洗三遍；
2)将消毒后的高羊茅种子播种于1/2 MS固体培养基(pH5.8)中，在25℃、16小时/8小时(光/暗)的条件下培养14天，取幼苗洗净，将其根部置于250mM NaCl溶液中处理5小时，然后将经过处理的幼苗立即用液氮速冻，-80℃保存用于提取总RNA。
3)用Trizol法(Trizol液购于GIBCO公司)提取步骤2)保存的受盐诱导5小时的高羊茅植株的总RNA，用PolyATtract mRNA Isolation Systems(Promega公司)从上述高羊茅植株的总RNA中分离出mRNA；再以此mRNA为模板，用ZAP Express cDNASynthesis Kit(Stratagene公司)合成其cDNA；最后，将获得的cDNA两端分别加上EcoR I和Xho I接头后，将其插入到λ-ZAP载体(Stratagene)的EcoR I和Xho I酶切位点之间，再用ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene公司，参见试剂盒说明书中的Gigapack III Gold封装混合法)构建出受盐诱导的高羊茅cDNA文库。
2、从受盐诱导的高羊茅cDNA文库中钓取FaDREB21)根据已报道的DREB基因序列设计一对特异性兼并引物，引物序列为引物1(正向引物)5’-TGC(t)AAGTACCGA(c/t)GGTGTG-3’；引物2(反向引物)5’-CGAGAAGTTGACACGTGC-3’；2)以步骤1中受盐诱导5小时的5ug高羊茅幼苗总RNA为模板，在引物1和引物2的引导下，用RT-PCR的方法(RT-PCR Kit，TaKaRa)扩增得到高羊茅DREB基因AP2保守区的cDNA片段；其中， 3)以步骤2)获得的AP2保守区的cDNA片段作探针，用常规方法从步骤1构建的盐诱导cDNA文库中筛选出多个阳性克隆，用377 DNA Sequencer(ABI PRISM)对获得的多个阳性克隆进行序列测定，与已报道的DREB基因序列进行序列比对，从中得到高羊茅DREB的cDNA序列，该cDNA序列全长为1087bp，具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，5’端的非翻译区长度为28bp，3’端的非翻译区长度为264bp，其编码序列(开放阅读框架)长度为795 bp，是自SEQ ID №2的5’端的第29-823位碱基，其编码序列编码具有序列表中SEQ ID №1(264个氨基酸残基)的氨基酸残基序列的蛋白质。将高羊茅的DREB基因命名为FaDREB2，编码蛋白命名为FaDREB2。对FaDREB2进行生物信息学分析，结果表明FaDREB2具有DREB蛋白家族的特征。其中自N端第62-119位为AP2/EREBP保守结构域；自N端第75位(AP2/EREBP保守结构域中的第14位)为缬氨酸；自N端第80位(AP2/EREBP保守结构域中的第19位)为谷氨酸。表明FaDREB2是一个DREB蛋白。
实施例2、冷、盐、干旱和脱落酸ABA诱导处理下FaDREB2的表达模式实验过程包括如下步骤1、分别对实施例1培养的高羊茅幼苗进行冷诱导、盐诱导、干旱诱导及脱落酸ABA诱导处理，处理方法如下1)盐诱导处理高羊茅幼苗的根部置于250mM NaCl溶液中进行处理；2)冷诱导处理高羊茅幼苗置于4℃光照培养箱处理，其根部置于蒸馏水中；3)干旱诱导处理高羊茅幼苗置于超净工作台上风干处理，湿度为50％；4)脱落酸ABA诱导处理高羊茅幼苗的根部置于100μM ABA溶液中进行处理；分别于处理后0、1、2、4、8、12和24小时对经上述不同方法诱导处理的高羊茅幼苗间隔取样，然后将样品立即用液氮速冻，-80℃保存用于提取总RNA。用Trizol法(Trizol液购于GIBCO公司)提取上述不同样品的总RNA，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳对不同样品的总RNA进行检测，检测结果如图1-4所示(泳道0、1、2、4、8、12和24分别表示第0、1、2、4、8、12和24小时采集的样品的总RNA)。
2、用RT-PCR法分析冷、盐、干旱和脱落酸ABA诱导条件下FaDREB2的表达模式分别以步骤1提取的不同样品的总RNA为模板，在引物3(正向引物)5’-GTCTGGCTTTGTGACATGAATTTC-3’和引物4(反向引物)5’-CCCTCATATCATAACTAAGCCCTAA-3’的引导下，用One-step realtime RT-PCR kit(TaKaRa)进行RT-PCR反应检测在冷、盐、干旱和脱落酸ABA诱导条件下FaDREB2的表达模式，并在引物5(正向引物)5’-CAACTGGGATGAC(t)ATGGAGA-3’和引物6(反向引物)5’-CCA(g)ATCCAGACACTGTACTTCC-3’引导下，用同样的参数条件及反应条件下PCR扩增高羊茅的看家基因肌动蛋白actin基因(内参)，RT-PCR反应体系为RNase Free H2O 10.5ul，10×One step RNA PCR缓冲液2.5ul，dNTP混合物(各10mM)2.5ul，MgCl2(25mM)5ul，RNase Inhibitor(40U/ul)0.5ul，M-MLV RTase(25U/ul)0.5ul，TaKaRa Ex Taq HS(5U/ul)0.5ul，引物3和引物4(各10uM)各1ul，总RNA 1ug；反应条件先50℃ 30分钟，94℃ 2分钟；再94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 60秒，进行22个循环；最后72℃ 5分钟。将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5-图8a所示(泳道M为Marker，泳道0、1、2、4、8、12和24分别表示第0、1、2、4、8、12和24小时采集的样品的RT-PCR产物，箭头示目的条带，表明FaDREB2在高盐和低温诱导下可明显表达，但不受干旱和脱落酸ABA的诱导。
实施例3、FaDREB2转录激活载体的构建和FaDREB2蛋白转录激活功能的检测包括如下步骤1、以实施例1的步骤1提取的高羊茅总RNA为模板，经反转录成cDNA后，在引物7(正向引物)5’-ATGTCCAGGAAGAAGAAAGTGC-3’和引物8(反向引物)5’-CTAATATGAGAAAAGACTAAACCCATC-3’的引导下，用高保真Pfu DNA聚合酶(Promega公司)通过PCR法获得FaDREB2的编码区；其中，PCR反应体系为 反应条件 2、将步骤1获得的FaDREB2的编码区片段与载体pGEM-T(Promega公司)用T4DNA连接酶连接，获得重组载体，命名为FaDREB2/pGEM-T，再用限制性内切酶SpeI I和NotI从重组载体FaDREB2/pGEM-T上切下FaDREB2的编码区片段，并将其与用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)连接获得重组载体，命名为FaDREB2/YEpGAP112，经检测无误后，将重组载体FaDREB2/YEpGAP112分别转化到含双报道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株4271和含突变型DRE元件酵母菌株4271(均购自Clontech公司)中，再将转化有重组载体FaDREB2/YEpGAP112的重组酵母菌株涂于含有3-AT(分别加入浓度为0mM，20mM，30mM，40mM 3-AT进行检测)的SD-Agar三缺固体培养基(His-，Trp-，Ura-，Clontech公司)上检测其生长情况。
同时以拟南芥DREB1A(Liu等Plant Cell，1998，10(8)1391-1406)为对照，将DREB1A的编码区片段与载体pGEM-T(Promega公司)用T4DNA连接酶连接，获得重组载体，命名为DREB1A/pGEM-T，再用限制性内切酶SpeI I和NotI从重组载体DREB1A/pGEM-T上切下DREB1A的编码区片段，并将其与用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)连接获得重组载体，命名为DREB1A/YEpGAP112，经检测无误后，将重组载体DREB1A/YEpGAP112分别转化到含双报道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株4271和含突变型DRE元件酵母菌株4271(均购自Clontech公司)中，再将转化有重组载体DREB1A/YEpGAP112的重组酵母菌株涂于含有3-AT(分别加入浓度为0mM，20mM，30mM，40mM 3-AT进行检测)的SD-Agar三缺固体培养基(His-，Trp-，Ura-，Clontech公司)上检测其生长情况。
结果如图9-12所示(1为拟南芥DREB1A在含野生型DRE元件酵母中；2为FaDRBEB2基因在含野生型DRE元件酵母中；3为野生型酵母对照；4为拟南芥DREB1A基因在含突变型DRE元件酵母中；5为FaDRBEB2基因在含突变型DRE元件酵母中；6为突变型酵母对照，结果表明含FaDREB2和野生型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上生长良好，而含FaDREB2和突变型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上不能生长。说明FaDREB2蛋白可特异结合DRE元件，从而激活下游目的基因的表达，具有调控草坪草高羊茅抗逆性应答的功能。
序列表<210>1<211>264<212>PRT<213>高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)<400>1Met Ser Arg Lys Lys Lys Val Arg Arg Arg Ser Thr Gly Pro Asp Ser1 5 10 15Val Ser Glu Ile Ile Lys Lys Trp Lys Glu Gln Asn Gln Lys Leu Gln20 25 30Glu Glu Asn Gly Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly35 40 45Cys Met Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Lys Tyr Arg50 55 60Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu65 70 75 80Pro Asn Arg Gly Asn Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Val85 90 95Glu Ala Ala His Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Ala100 105 110Thr Ala Arg Val Asn Phe Ser Glu Arg Ser Pro Asp Ala Asn Ser Gly115 120 125Cys Thr Ser Ala Pro Pro Val Leu Met Ser Asn Gly Pro Thr Ala Val130 135 140Ser His Leu Ala Asp Gly Lys Asp Glu Ser Glu Ser Pro Pro Ser Leu145 150 155 160Thr Ser Asp Ala Pro Thr Ala Thr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Lys Asp165 170 175Glu Pro Glu Ser Ala Gly Thr Val Val His Glu Val Lys Thr Glu Val
180 185 190Ser Asn Asp Ser Thr Ser Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Val Glu Val195 200 205Phe Gln Pro Glu Gly Lys Ala Leu Arg Lys Glu Glu Lys Val Ser Tyr210 215 220Asp Tyr Phe Asn Val Glu Glu Val Leu Asp Met Ile Ile Val Glu Leu225 230 235 240Ser Ala Asp Arg Lys Met Glu Val His Glu Glu Tyr Gln Asp Gly Asp245 250 255Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser Tyr260<210>2<211>1087<212>DNA<213>高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)<400>2gtctggcttt gtgacatgaa tttccttgat gtccaggaag aagaaagtgc ggaggagaag 60caccggtccc gattcggtgt ctgaaatcat caagaagtgg aaggagcaga accagaagct120ccaggaagag aatggagccc ggaaagcgcc ggccaagggt tcgaagaaag ggtgcatggc180agggaaaggt ggtccggaaa attcaaattg caagtaccga ggtgtgaggc agcggacgtg240gggcaaatgg gtggctgaga tccgcgagcc caaccgcggc aaccggctat ggcttggctc300gttccctact gcggtggaag ctgcacacgc gtacgacgag gcggcaaggg cgatgtatgg360cgccacagca cgtgtcaact tctcggagcg ttcgccggat gccaactctg gctgcacatc420ggcgcctcca gtgctgatgt ctaacgggcc aactgctgtg tcacatctgg ctgatgggaa480ggatgaatcg gaatctcctc cttctcttac gtcagacgcg ccgaccgcta cgttggatcg540gtctgatgcg aaggatgagc ctgaatctgc agggactgtg gtgcatgagg tcaaaacgga600agtgagcaat gactcgacaa gcgtccgtga ggagcgcaag gctgtggaag tatttcaacc660agaagggaaa gctttacgta aagaagagaa agtaagttac gattacttca atgtcgaaga720agttctcgac atgataattg tggaattgag tgctgataga aaaatggaag tacatgaaga780
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1.高羊茅干旱应答元件结合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第62-119位为AP2/EREBP结构域。
3.编码权利要求1所述高羊茅干旱应答元件结合蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因的编码序列为自序列1的5’端第29-823位核苷酸。
6.含有权利要求3或4或5所述高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因的植物表达载体。
7.含有权利要求3或4或5所述高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因的细胞系。
8.含有权利要求3或4或5所述高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因的宿主菌。
9.扩增权利要求3、4或5所述基因中任一片段的引物。
10.权利要求3、4或5所述的高羊茅干旱应答元件结合蛋白基因在培育抗逆性提高的植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白及其编码基因与应用。该结合蛋白为具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质或为将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质。其编码基因为序列表中SEQ ID №2的DNA序列；或编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该蛋白及其编码基因可用于培育抗逆性提高的植物。
文档编号C12N15/29GK1778814SQ200410096050
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者刘敬梅, 阳文龙, 周海梦 申请人:清华大学