专利名称：用于检测氨肽酶的活性和/或从革兰氏阴性菌中区分革兰氏阳性菌的酶底物，含有该酶底 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的用于检测氨肽酶活性的显色酶底物。该底物可用于包括酶水解步骤的应用中，该酶水解步骤特别是在微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中产生物理化学信号。本发明也涉及含有该底物的培养基，涉及使用该底物或培养基检测氨肽酶活性和/或从革兰氏阴性菌中区分革兰氏阳性菌，并涉及使用方法。
与现有的大多数发荧光的底物相比，上述新的底物特别能用于凝胶化培养基以检测微生物，因为它们能产生不会在反应介质中扩散的颜色，并且该颜色集中在菌落中。
已经描述了不会扩散的用于检测氨肽酶活性的显色酶底物，这在本领域已经是公知的。因此上述底物被本申请人提交的专利申请WO-A-98/04735和WO-A-99/38995所包括。然而，这些底物有各种缺点它们很难合成，纯度低并且产量低。另外，为了用于培养基，需要明确规定非常准确的培养基组成以观察颜色。目前描述的其它底物不能用于固体培养基中以检测混合培养物中的微生物。
此外，已知基于吖啶的分子。可使用它们，因为它们的染色性质，参见，例如，S.Rapposch等人，J.DairySci.2000 Dec；83(12)2753-2758，或其它，例如，A.Giorgio等人，Microbiologica 1989 Jan；12(1)97-100，它们的化学治疗性质，例如N.Costes等人，J.Med.Chem.2000Jun 15；43(12)2395-2402，或对DNA具有嵌插作用，例如O.Okwumabua等人，Res.Microbiol.1992 Feb；143(2)183-189，或者，例如，T.Schelhorn等人，Cell.Mol.Biol.1992 Jul；38(4)345-365。
专利EP-B-0.270.946提出了基于吖啶酮的显色酶底物，其是吖啶的衍生物。可以被酶切割的基团位于吖啶基团的7位上。它的结构只可能观察下面的酶活性酯酶和糖苷酶。
根据本发明，提出了根据其颜色用于检测微生物中氨肽酶活性或用于确定至少一种细菌是否属于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的新的显色酶底物。本发明也涉及含有上述底物的培养基，涉及该底物或培养基用于检测氨肽酶活性和/或区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的应用，以及其使用方法。
为了达到这种作用，本发明涉及根据其颜色用于检测微生物中的氨肽酶活性或用于确定至少一种细菌是否属于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的显色酶底物。它们具有下式(I) 其中R1不存在或为烷基，烯丙基或芳基，R2由至少一种氨基酸组成，优选为丙氨酸，R3，R4，R5和R6彼此互相独立，由H-或-O-烷基，优选-O-CH3组成，R7由H，O-CH3，烷基或卤素组成，R8由H或Cl组成，以及n为整数，等于0或1。
根据本发明，术语“芳基”特别指的是C6-C10芳香环，特别是苯基，苯甲基，1-萘基或2-萘基。
术语“烷基”指的是C1-C6烷基，即具有1到6个碳原子的直链或支链烷基。例如为甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，戊基，异戊基和己基。
术语“卤素原子”指的是氯，溴，碘和氟。
本发明中使用的氨基酸可以是本领域技术人员已知的任何氨基酸。
措辞“至少一种氨基酸”指的是一种或几种氨基酸。
根据本发明的一实施方案，R2表示氨基酸或至多具有10个氨基酸的肽，其中氨基酸可以是相同的或可以是不同的。优选，由于底物价格的原因，A表示氨基酸或至多具有4个氨基酸的肽，其中氨基酸可以相同或可以不同，优选是相同的。
氨基酸R2能被连接到一封端剂上，这就构成了本发明的另一实施方案。
这些封端剂包括本领域技术人员已知的能保护胺的任何封端剂。为了举例，可以提及叔丁氧羰基(N-tBOC)，9-芴氧-羰基，增溶剂例如琥珀酰，或非-代谢，即非天然氨基酸例如哌啶酸。
根据本发明的一实施方案，底物具有下式(Ia) 或具有下式(Ib)
根据本发明的另一实施方案，底物与上式(I)相应，其中R1为甲基或烯丙基。
而根据本发明的另一实施方案，底物与上式(I)相应，其中R1为烷基，优选甲基或烯丙基，R2为至少一种氨基酸，任选由封端剂所保护，优选为至少一种丙氨酸，R3，R4，R5，R6，R7和R8为H，n为0或1。
而根据另一实施方案，底物具有下式(Ic) 或具有下式(Id)
根据n值，制备本发明的化合物，如下所述(1)当n＝0时，适当的盐酸吖啶(R8为H或Cl)与适当的苯胺(R3，R4，R5，R6如上述定义)和硫进行反应，得到适当的9-(4-氨基苯基)吖啶。接着后者与至少一种连接到封端剂上的氨基酸进行反应，得到的化合物可选择地去保护从而将封端剂从本发明的化合物中分开。如果想要得到10位上的氮被季铵化的化合物，将得到的化合物与XR1进行反应，其中X为卤素，R1如上述定义，和(2)当n＝1时，根据Campbell等人的方法(1958，见上面)制备的9-甲基吖啶，或根据Lehmstedt和Schrader的方法(Albert，1966，见上面)制备的9-氯吖啶与适当的硝基苯甲醛(R3，R4，R5，R6如上述限定)和氯化锌反应，从而制备适当的9-(4-硝基苯乙烯基)吖啶。接着使用氯化锡(II)在乙酸乙酯和乙醇的混合物中还原硝基，或者使用硼氢化钠和乙酰丙酮酸铜还原硝基，从而得到9-(4-氨基苯乙烯)吖啶。接着后者与至少一种连接到封端剂上的氨基酸进行反应，得到的化合物可选择地去保护从而将封端剂从本发明的化合物中分开。如果想要得到10位上的氮被季铵化的化合物，将得到的化合物与XR1进行反应，其中X为卤素，R1如上述定义。
本发明也涉及单独使用至少一种如上所述的显色酶底物或与至少一种其它的对酶活性具有特异性的酶底物联用的培养基，所述酶活性不是由根据本发明的底物所检测的活性。
结果，当表达肽酶活性的微生物接种到含有本发明化合物的反应介质中，产生不扩散入反应介质的显色，并且该显色集中于菌落中。
措辞“根据本发明的反应介质”指的是允许发展至少一种微生物的至少一种酶活性的介质。
上述反应介质可以只用作显示介质，或者作为培养基和显示介质。在第一种情况下，在接种之前完成微生物的培养，而在第二种情况下，反应介质也构成培养基。
反应介质可以是固体，半固体或液体。术语“固体介质”指的是，例如凝胶化介质。
优选，上述介质由凝胶化介质构成。
微生物学上琼脂是传统用于培养微生物的胶凝剂，但也可能使用明胶或琼脂糖。很多制剂是可以商购的，例如Columbia琼脂，Trypcase-soy琼脂，MacConkey琼脂，Sabouraud琼脂或更一般来说，微生物培养基手册(CRC Press)中描述的那些。
反应介质中琼脂的数量为2到40g/l，优选为9到25g/l。
本发明的酶底物可以在广泛的pH范围内使用，特别是在pH5.5和10之间。
反应介质中本发明的酶底物的浓度在0.025和1.0g/l之间，有利地为0.3g/l。特别的是，在这一底物浓度，能得到较好的显色对比度。
反应介质可以包含至少一种其它的对酶活性具有特异性的底物，所述酶活性不是由本发明的底物检测的酶活性。其它底物的酶水解产生可检测信号，该检测信号与本发明的底物所检测的信号不同，例如不同颜色或荧光产物，从而证明，例如检测和/或识别和/或定量一种或几种微生物。
可以使用微生物检测中通常使用的任何其它底物作为另一种特异性底物。
其它特异性酶底物的浓度通常在0.01和2g/l之间。根据使用的底物，本领域技术人员能容易确定这样的浓度。
反应介质中也可以组合含有一种或几种成分，例如氨基酸，胨，碳水化合物，核苷酸，矿物，维生素，抗生素，表面活性剂，缓冲剂，磷酸盐，铵盐，钠盐或金属盐。本申请人的专利申请EP656421和WO99/09207中描述了介质的实例。
因此，本发明的酶底物和反应介质能用于鉴定具有肽酶活性的微生物。
因此，本发明也涉及上述显色酶底物的应用，或也是上面描述的培养基的应用，用于检测微生物中至少一种氨肽酶的活性。
本发明的一个主题仍是上述显色酶底物的应用，或者是上面也描述的培养基的应用，用于将革兰氏阳性染色的细菌与革兰氏阴性染色的细菌分开。
最后，本发明涉及检测微生物中至少一种氨肽酶活性的方法，该方法包括提供上述培养基，用待测生物样品接种该培养基，放置进行培养，以及只显示至少一种氨肽酶活性的存在，或者也显示至少一种其它的不同酶活性。
根据它们是否属于革兰氏阳性微生物或属于革兰氏阴性微生物，本发明也涉及另一种用于区分细菌的方法，该方法包括提供上述培养基，用待测生物样品接种该培养基，放置进行培养，以及显示至少一种颜色，该颜色代表微生物或革兰氏阴性微生物的存在。
不管使用什么方法，当吖啶基10位上的氮没有被季铵化时，通过向培养基中加入酸，优选盐酸，乙酸，显示至少一种氨肽酶活性的存在。术语“季铵化”指的是吖啶基10位上的氮是四价的，也就是它通过三个普通键(conventional bond)与苯环相连接并通过一个辅助键(supplementary bond)与一基团相连接，从而所述的氮原子带有正电荷，因此是正离子。在这种情况下，分子是一种盐的形式，例如氯化物，溴化物或三氟醋酸盐。
下面实施例中描述的所有的反应都通过薄层色谱法(TLC)进行监控，产物的结构通过质谱法(MS)和核磁共振(NMR)进行确定。
实施例1使用没有季铵化的底物，显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性1.1使用的分子进行两个基于吖啶的底物的对照研究，这些底物是L-丙氨酰基-9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶，下文中称作L-Ala-4-ASA，以及L-丙氨酰基-氨基苯基吖啶(非季铵化的底物)，下文中称作L-Ala-APA，分别具有式 L-丙氨酰-氨基苯基吖啶 L-丙氨酰-9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶1.2合成底物1.2.1合成L-Ala-4-ASA分几步完成上述合成。
制备9-氯吖啶使用Lehmstedt和Schrader方法完成该制备，可参考Albert的书“The Acridines”，Arnold，第二版，(1966)，33页。
制备9-甲基吖啶使用了Campbell，Franklin，Morgan和Tivey(ref.J.Chem.Soc.，1958，1145)的方法。收率达到90％。
通过熔化制备9-(4-硝基苯乙烯基)吖啶使用油浴将9-甲基吖啶(4.83g，25.0mmol)，4-硝基苯甲醛(4.23g，31.25mmol)和氯化锌(5.06g，31.25mmol)的混合物在130℃加热3小时，为了除去过量的醛，将回收得到的固体在偏亚硫酸氢钠溶液中进行加热，将热混合物进行过滤。将得到的沉淀物在最小量的四氢呋喃中溶解，向溶液中加入水，从而得到沉淀物形式的产物。通过过滤和干燥回收所述沉淀物。用乙醇可对所述产物进行再结晶。收率为35％。
制备9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶将9-(4-硝基苯乙烯基)吖啶产物(2.86g，10.0mmol)溶解在乙酸乙酯(250ml)中，接着进行回流。将热乙醇(150ml)的无水氯化锡(II)(9.0g，40mmol)溶液进行冷却，加入到9-(4-硝基苯乙烯基)吖啶溶液中。回流搅拌反应混合物5小时。冷却后，将9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶进行沉淀，真空过滤进行分离。蒸发干燥滤液，边搅拌边用水进行吸收(500ml)。用氢氧化钠溶液将溶液碱化(pH13-14)。先前分离的9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶级分，其含有大部分锡盐，也被碱化。通过过滤分离出9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶，用水冲洗并干燥。对下面的步骤来说其是足够纯的。
制备t-Boc-丙氨酰-9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶将t-Boc-丙氨酸产物(3.79g，20.0mmol)溶解在最小量的无水四氢呋喃(THF)中，通过浴中乙二醇/干冰的混合物将溶液冷却到-15℃。将N-甲基吗啉(NMM)(2.02g，20mmol)逐滴加入混合物中。接着将氯甲酸异丁酯(IBCF)(2.53g，20.0mmol)逐滴加入到反应混合物中。温度必须低于-10℃。大约3分钟后，加入溶解在最小量的无水四氢呋喃(THF)中并冷却到-15℃的9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶(5.4g，20mmol)。搅拌反应混合物并恢复到环境温度。采用含有过滤板的漏斗通过过滤除去N-甲基-吗啉盐。使用旋转蒸发器使混合物蒸发到原有体积的四分之一。边搅拌边逐滴将滤液加入大量的水/冰混合物中。通过过滤回收形成的黄色沉淀物，用水冲洗并干燥。产物可用甲醇再结晶。收率基本上为75％。
其它的t-Boc-保护的氨基酸类似物也用于形成新的产物。氨基酸为脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸和β-丙氨酸。这些产物的收率在60到80％的范围内，通常最好的结果是β-丙氨酸类似物，最坏的结果通常是丝氨酸类似物。
1.2.2合成L-Ala-APA采用两种不同的方法，通过熔化的硫的反应进行9-(4-氨基苯基)吖啶的制备。
方法A充分混合盐酸吖啶(9.7g，45.0mmol)，苯胺(8.37g，90.0mmol)以及10g硫，在足够的通风橱下于130℃加热4小时。将圆底烧瓶中的反应介质冷却到环境温度并溶解在热甲醇中，从而得到血红色的溶液。冷却上述溶液，过滤除去硫。使用浓缩的氨水溶液将滤液碱化。过滤形成的浅黄色沉淀物，接着用冷甲醇冲洗。收率为65％。
方法B充分混合吖啶(8.06g，45.0mmol)，盐酸苯胺(11.61g，90mmol)和10g硫，130℃加热4小时。接着如上述方法A处理反应介质。接着在上述两种方法中的一种和/或另一种的基础上完成制备。
制备t-Boc-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)吖啶将t-Boc-丙氨酸产物(3.79g，20.0mmol)溶解在最小量的无水四氢呋喃(THF)中，通过浴中乙二醇/干冰的混合物将溶液冷却到-15℃。将N-甲基吗啉(NMM)(2.02g，20mmol)逐滴加入混合物中。接着将氯甲酸异丁酯(IBCF)(2.53g，20.0mmol)逐滴加入到反应混合物中。温度必须低于-10℃。大约3分钟后，加入溶解在最小量的无水四氢呋喃(THF)中并冷却到-15℃的9-(4-氨基苯基)吖啶(5.4g，20mmol)。搅拌反应混合物并恢复到环境温度。采用含有过滤板的漏斗通过过滤除去N-甲基-吗啉盐。使用旋转蒸发器使混合物蒸发到原有体积的四分之一。边搅拌边逐滴将滤液加入大量的水/冰混合物中。通过过滤回收形成的黄色沉淀物，用水冲洗并干燥。产物可用甲醇再结晶。收率为75％。
其它的t-Boc-保护的氨基酸类似物也用于形成新的产物。氨基酸为脯氨酸，甘氨酸，丝氨酸和β-丙氨酸。这些产物的收率在60到80％的范围内，通常最好的结果是β-丙氨酸类似物，最坏的结果通常是丝氨酸类似物。
1.3制备介质如下制备凝胶化介质，该介质含有L-丙氨酰基-9-(4-氨基苯乙烯基)吖啶(下文中称作L-Ala-4-ASA)或L-丙氨酰基-氨基苯基吖啶(下文中称作L-Ala-APA)46.37g Columbia琼脂加入1升蒸馏水中，接着高压灭菌。将反应介质分为两个相同体积的介质。每份介质分别包含DMSO的储备溶液提供的0.3g/l L-Ala-4-ASA，以及DMSO的储备溶液提供的0.3g/l L-Ala-APA。
将得自申请人采集的微生物接种到每份介质中，使用0.5的McFarland悬浮液划线三次，平皿于37℃培养24小时。培养24小时后目测检查形成的菌落。在加入一滴盐酸之前以及之后记录这些菌落的颜色。
1.4结果下面的表1给出了结果。当没有盐酸时，两底物没有产生自发的显色。当存在一滴盐酸后，具有L-丙氨酸-氨肽酶活性的菌落在颜色上是灰-紫红色变成紫红色。不具有上述活性的菌落保持无色。因此所述底物是敏感和特异性的。在混合有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的情况下，它们可能分开这两种类型的微生物。
表1通过凝胶化介质中的L-Ala-4-ASA或L-Ala-APA，显示出微生物中L-丙氨酸-氨肽酶的活性。
实施例2采用季铵化的底物显示出凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性2.1所用的分子使用L-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-烯丙基吖啶鎓(acridinium)氯化物(季铵化的底物)，下文中表示为L-Ala-4-AP-10-AA，具有式 L-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-烯丙基吖啶鎓氯化物来确定凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸氨肽酶活性2.2合成L-Ala-4-AP-10-AA起始化合物为t-Boc-丙氨酰基-9-(4-氨基苯基)吖啶，其合成方法已经在1.2.2段(合成L-Ala-APA)中公开。将t-Boc-丙氨酰基-9-(4-氨基苯基)吖啶(0.88g，2.0mmol)加入10ml烧瓶中的无水四氢呋喃(4.0ml)中，该烧瓶可以是密闭的，将混合物加热至沸腾从而得到部分溶液。冷却溶液/悬浮液，加入烯丙基溴(2.0ml)。接着将烧瓶回流8小时，用薄层色谱法(TLC)定期监测反应。冷却并除去溶剂后，用二乙醚冲洗季盐并干燥。
将产物溶解在最小量的乙醇中，用盐酸饱和的乙酸乙酯(10ml)进行搅拌。几个小时后形成沉淀物，减压过滤回收沉淀物。将乙醚加入滤液中，可能回收另外的产物。用乙醚冲洗合并的产物级分，迅速干燥从而防止吸收水分。
2.3制备介质如下制备含有L-Ala-4-AP-10-AA作为底物的凝胶化介质46.37gColumbia琼脂加入1升蒸馏水中，接着高压灭菌。将反应介质分成三份相同体积的介质。每份介质分别包含DMSO的储备溶液提供的0.1g/l，0.2g/l，0.4g/l L-Ala-4-AP-10-AA。
将来自申请人采集的微生物接种到每份介质中，使用0.5的McFarland悬浮液划线三次。将平皿于37℃培养48小时。培养24小时和48小时后肉眼检查形成的菌落。记录这些菌落的颜色以及上述颜色的亮度。
2.4结果使用从0到4的人工标度范围作为基础，用颜色亮度来表示结果。这些结果在下面表2中给出。
通过自发地集中在菌落中的颜色(没有加入酸)，所述底物可能显示出革兰氏阴性菌中的L-丙氨酸-氨肽酶活性。不具有上述活性的菌落保持无色。因此上述底物是敏感和特异性的。在混合有革兰氏阳性和革兰氏阴性培养物的情况下，可能分开两种类型的微生物。与实施例1中描述的没有季铵化的相同分子相比，吖啶基10位上的氮“季铵化”使不加入酸而得到自发的反应成为可能。
表2通过被称作L-Ala-4-AP-从的底物对微生物中的L-丙氨酸-氨肽酶活性显示时底物浓度的影响。
实施例3使用其它季铵化的底物，显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性3.1使用的分子使用称作L-丙氨酰基-9-(4-氨基-苯基)-10-甲基吖啶鎓氯化物的底物(季铵化的底物)，下文中称作L-Ala-4-AP-10-MA，其式如下
L-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶鎓氯化物显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶活性。
3.2合成L-Ala-4-AP-10-MA在2.2段中已经完成上述合成，在所述合成中，烯丙基溴被甲基碘所代替。其可作为合成L-Ala-4-AP-10-MA的参考。
3.3制备介质如下制备含有300mg/l L-Ala-4-AP-10-MA的凝胶化介质46.37gColumbia琼脂加入1升蒸馏水中，接着高压灭菌。接着加入底物的DMSO储备溶液。将申请人采集的微生物接种到介质中，使用0.5的McFarland悬浮液划线三次。平皿于37℃培养48小时。培养24小时和48小时后目测检查形成的菌落。记录上述菌落的颜色以及上述颜色的亮度。
3.4结果下面的表3给出上述结果
表3通过L-Ala-4-AP-10-AA显示微生物中L-丙氨酸-氨肽酶的活性，其中对于L-Ala-4-AP-10-AA，将底物浓度最优化。
通过自发的出现集中在菌落的(没有加入酸)粉红-橙色，上述底物使检测革兰氏阴性菌中L-丙氨酸-氨肽酶的活性成为可能。不具有上述活性的菌落保持无色。因此上述底物是敏感和特异性的。这使得可能在混合有革兰氏+/革兰氏-培养物的情况下，分开两种类型的微生物。与实施例2中描述的底物相比，显示出对阳性菌可能得到更大的颜色亮度。这两种底物的不同在于吖啶环的氮10位上的基团的类型。
实施例4使用其它非季胺化的底物显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性。
4.1使用的分子通过使用两种底物显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性，即L-丙氨酰-2-甲氧基-氨基苯基吖啶(以下称作L-Ala-2-MeOAPA)，以及L-丙氨酰-2，5-二甲氧基氨基苯基吖啶(以下称作L-Ala-2，5-diMeOAPA)，其各自的分子式如下
L-丙氨酰-2-甲氧基氨基-苯基吖啶L-丙氨酰-2，5-二甲氧基氨基-苯基吖啶4.2底物的合成4.2.1L-Ala-2-MeOAPA的合成基于上述1.2.2所描述的那样，其它苯胺类似物也用来生成新的产物，如茴香胺(3-甲氧基苯胺)，可以生成9-(4-氨基-2-甲氧基苯基)吖啶。
4.2.2L-Ala-2，5-diMeOAPA的合成基于上述1.2.2所描述的那样，其它苯胺类似物也用来生成新的产物，如2，5-二甲氧基苯胺，可以生成9-(4-氨基-2，5-二甲氧基苯基)吖啶。
4.3介质的配制如下配制含有L-Ala-2-MeOAPA或L-Ala-2，5-diMeOAPA的凝胶化介质将46.37g Columbia琼脂加入1升蒸馏水中，然后高压灭菌。将反应介质分成等体积的两份。每份介质分别加入不同底物的DMSO储备液，即0.3g/l的L-Ala-2-MeOAPA以及0.3g/l的L-Ala-2，5-diMeOAPA。将来自申请人采集的微生物接种到介质中，使用0.5的McFarland悬浮液划线三次。平皿于37℃培养24小时。加入盐酸后记录菌落的颜色和颜色的亮度。
4.4结果
下面表4中给出上述结果
*非常差的生长表4通过L-Ala-2-MeOAPA和L-Ala-2，5-diMeOAPA，显示微生物中L-丙氨酸-氨肽酶的活性当加入一滴盐酸后，上述两种底物使显示革兰氏阳性菌中L-丙氨酸-氨肽酶的活性成为可能。另外，特别是对于革兰氏阳性菌，加入(甲氧-)取代基至苯基可能降低底物的毒性，但是这种繁殖的增加损害了特异性；特别是，当培养48小时后，粪肠球菌用L-Ala-2，5-diMeOAPA显示了活性。
实施例5使用β-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶鎓氯化物(季铵化的底物)，显示凝胶化介质中微生物的β-丙氨酸-氨肽酶的活性。
5.1使用的分子使用称作β-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶鎓氯化物的底物(季铵化的底物)，下文中称作β-Ala-4-AP-10-MA，其式如下
β-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶鎓氯化物显示凝胶化介质中微生物的β-丙氨酸-氨肽酶的活性5.2合成β-Ala-4-AP-10-MA起始化合物为t-Boc-丙氨酰-9-(4-氨基-苯基)吖啶，其合成方法已经在1.2.2段落(合成L-Ala-APA)中公开。t-Boc-丙氨酰-9-(4-氨基-苯基)吖啶(0.67g，1.5mmol)溶解在乙腈(最小体积)中，用甲基碘(4.0ml)进行回流。接着密闭烧瓶，于40℃孵育超过100小时。在反应进行中固体反应物溶解，形成橙色溶液。在上述溶液中出现橙-黑色晶体。
在接近100小时时，边搅拌边将反应混合物转移到乙酸乙酯(100ml)中。经过一段时间后，过滤季铵盐，用二乙醚进行冲洗。
将产物溶解在最小量的乙醇中，搅拌加入盐酸饱和的乙酸乙酯(10ml)。几个小时后形成沉淀物，减压过滤回收上述沉淀物。向滤液中加入二乙醚，可能进一步回收产物。用二乙醚冲洗合并的产物级分，并迅速干燥从而防止吸收水分。
去保护和上述描述的相同。
5.3制备介质如下配制含有300mg/l β-Ala-4-AP-10-MA的凝胶化介质将46.37g Columbia琼脂加入1升蒸馏水中，然后高压灭菌。接着加入底物的DMSO储备液。将来自申请人采集的微生物接种到介质中，使用0.5的McFarland悬浮液划线三次。平皿于37℃培养48小时。培养24和48小时后肉眼观察形成的菌落。记录上述菌落的颜色和上述颜色的深度。
5.4结果下面的表5给出上述结果。
通过自发的出现(没有加入酸)集中在菌落中的橙色，上述底物使检测革兰氏阴性菌中β-丙氨酸-氨肽酶的活性成为可能。不具有上述活性的菌落保持无色。因此上述底物是敏感和特异性的。这使得可能鉴别出铜绿假单孢菌，特别是从其它细菌中区分出它们。
表5通过β-Ala-4-AP-10-MA显示微生物中β-丙氨酸-氨肽酶的活性。
实施例6使用基于脯氨酸的非季铵化的底物，显示凝胶化介质中微生物的L-脯氨酸-氨肽酶的活性。
6.1使用的分子使用称作L-脯氨酰-9-(4-氨基-苯基)吖啶的底物(非季铵化的底物)，下文中称作L-Pro-4-APA，其式如下
L-脯氨酰-9-(4-氨基苯基)吖啶检测凝胶化介质中微生物的L-脯氨酸-氨肽酶的活性6.2合成L-Pro-4-APA根据两种方法A和B，上述1.2段中已经完成了上述合成，在上述方法中丙氨酸已经被氨基酸脯氨酸所代替。其可作为合成L-Pro-4-APA的参考。
6.3制备介质如下配制含有L-脯氨酰-9-(4-氨基-苯基)吖啶(下文中称作L-Pro-4-APA)的凝胶化介质将45g Sabouraud琼脂加入1升蒸馏水中，然后高压灭菌。上述反应介质含有通过DMSO储备液引入的0.3g/lL-Pro-4-APA。
将来自申请人采集的微生物接种到介质中，使用0.5的McFarland悬浮液划线三次。平皿于37℃培养24小时。培养24小时后肉眼检察形成的菌落。在加入一滴乙酸之前和之后，记录上述菌落的颜色，下文中将乙酸称作GAA(冰醋酸)。
6.4结果下面的表6给出上述结果
表6通过L-Pro-4-APA，显示微生物中L-脯氨酸-氨肽酶的活性，对其来讲，将底物浓度最优化。
对于某些假丝酵母菌株，证明了底物的抑制特性。然而，没有加入酸时，一些酵母产生黄色。对一些菌株来说上述颜色更强烈，特别是白色假丝酵母，也比没有培养时更强烈。这清楚地证明我们的含有脯氨酸作为氨基酸的底物使显示酵母中的L-脯氨酸-氨肽酶的活性成为可能。
实施例7使用基于丝氨酸的非季铵化的底物，显示凝胶化介质上微生物中L-丝氨酸-氨肽酶的活性。
7.1使用的分子使用称作L-丝氨酰-9-(4-氨基-苯基)吖啶的底物(非季铵化的底物)，下文中称作L-Ser-4-APA，其式如下
L-丝氨酰-9-(4-氨基苯基)吖啶检测凝胶化介质中微生物的L-丝氨酸-氨肽酶的活性7.2合成L-Ser-4-APA与L-Pro-4-APA公开的内容相似(上述6.2段)，根据两种方法A和B，上述1.2段已经公开了上述合成，在上述方法中丙氨酸被丝氨酸所替代。其可作为合成L-Ser-4-APA的参考。
7.3制备介质如下配制含有L-丝氨酰-9-(4-氨基-苯基)吖啶(下文中称作L-Ser-4-APA)的凝胶化介质将30毫克L-Ser-4-APA加入4克Columbia琼脂中，将它们加入0.1升蒸馏水中，然后高压灭菌。反应介质于116℃高压灭菌20分钟。大部分底物在溶液中，没有残余的显色。
使用0.5的McFarland悬浮液，将申请人采集的微生物接种到该介质中。平皿于37℃培养24小时。培养每份10ul悬浮液样品，从而产生菌落。培养18至24小时后，目测检查形成的菌落。
在加入一滴乙酸之前和之后，记录上述菌落的颜色，乙酸在下文中被称作GAA(冰醋酸)。
7.4结果下面表7给出结果
表7使用L-Ser-4-APA显示微生物中L-丝氨酸-氨肽酶的活性，对L-Ser-4-APA来说，最优化底物浓度。
再一次，用基于吖啶的底物部分抑制某些菌株。加入乙酸后，检测的三种革兰氏阴性菌产生了特别的反应色。
实施例8使用基于一个，两个或三个L-丙氨酸的季铵化底物，显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性。
8.1使用的分子使用三种底物，即实施例3中描述的L-Ala-4-AP-10-MA，与L-Ala-4-AP-10-MA 相应并含有另一个L-丙氨酸的L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA，以及再含有一个L-丙氨酸的L-Ala-L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA，显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性。
8.2合成上述底物使用具有一个，两个或三个L-丙氨酸的适宜的起始化合物，如上述3.2点的描述制备这些底物。
8.3制备介质。
制备含有上述三种底物的凝胶化介质，如下将每份30mg底物溶解(加热)在10ml无菌蒸馏水中。接着将l0ml上述溶液加入90ml于50℃保持熔融的Columbia琼脂中。
将来源于NCTC(National Collection of Type Cultures，Colindale，UK)的微生物的各种菌株接种到根据多点接种得到的介质中对于每份菌株，将一滴10ul 0.5McFarland的悬浮液加入每份介质中。
培养24h和48h后肉眼检查形成的菌落。记录上述菌落的颜色和生长。
8.4结果下面表8中给出结果
++表示良好的生长，+表示适中生长，+/-表示不好的生长以及NG表示没有生长在三种介质中，革兰氏阴性菌形成橙色菌落，而革兰氏阳性菌形成无色菌落或没有生长。因此，上述三种介质可能从革兰氏阳性菌中区分出革兰氏阴性菌，并且根据介质，区分所有或部分测试菌株的生长。
实施例9使用焦谷氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶盐酸盐的季铵化底物，显示凝胶化介质中微生物的焦谷氨酰胺-氨肽酶的活性。
9.1使用的分子使用焦谷氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基-吖啶，在下文中称作PG-4-AP-10-MA，显示凝胶化介质中微生物的焦谷氨酰胺-氨肽酶的活性。
9.2合成上述底物除了L-丙氨酸被焦谷氨酰胺所取代，如上述3.2点的描述制备上述底物。
9.3制备介质制备含有上述底物的凝胶化介质，如下将每份30mg底物溶解(加热)在10ml无菌蒸馏水中。接着将10ml上述溶液加入90ml于50℃保持熔融的Columbia琼脂中。
将来源于NCTC(National Collection of Type Cultures，Colindale，UK)的微生物的各种菌株接种到根据上述实施例8描述的多点接种得到的介质中。
培养24h和48h后肉眼检查形成的菌落。记录上述菌落的颜色和生长。
9.4结果下面表9给出结果
++表示良好的生长，+表示适中生长，+/-表示不好的生长以及NG表示没有生长该实施例的介质可以使表达焦谷氨酰-氨肽酶活性的细菌与那些没表达该活性的细菌区分开。
实施例10使用基于甘氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶盐酸盐的季铵化底物，显示凝胶化介质中微生物的甘氨酸-氨肽酶的活性。
10.1使用的分子使用甘氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶，在下文中称作G-4-AP-10-MA，显示凝胶化介质中微生物的甘氨酸-氨肽酶的活性。
10.2合成上述底物除了L-丙氨酸被甘氨酸所取代，如上述3.2点的描述制备上述底物。
10.3制备介质制备含有上述底物的凝胶化介质，如下将30mg底物溶解(加热)在10ml无菌蒸馏水中。接着将10ml上述溶液加入90ml于50℃保持熔融的Columbia琼脂中。
将来源于NCTC(National Collection of Type Cultures，Colindale，UK)的微生物的各种菌株接种到根据上述实施例8描述的多点接种得到的介质中。
培养24h和48h后肉眼检查形成的菌落。记录上述菌落的颜色和生长。
10.4结果下面表10中给出结果
++表示良好的生长，+表示适中生长，+/-表示不好的生长以及NG表示没有生长该实施例的介质可以使表达甘氨酰-氨肽酶活性的细菌与那些没有表达该活性的细菌区分开。
实施例11使用季铵化的底物，其中氨基酸连接到封端剂上，该底物是基于t-BOC-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶盐酸盐，来显示凝胶化介质中微生物的t-BOC-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-肽酶的活性11.1使用的分子使用t-BOC-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶，在下文中被称作t-BOC-L-Ala-4-AP-10-MA，显示凝胶化介质中微生物的L-丙氨酸-氨肽酶的活性。
11.2合成上述底物除了不去除氨基化合物的保护，如上述3.2点的描述制备上述底物。
11.3制备介质制备含有上述底物的凝胶化介质，如下将30mg底物溶解(加热)在10ml无菌蒸馏水中。接着将10ml上述溶液加入90ml于50℃保持熔融的Columbia琼脂中。
将来源于NCTC(National Collection of Type Cultures，Colindale，UK)的微生物的各种菌株接种到根据上述实施例8描述的多点接种得到的介质中。
培养24h和48h后肉眼检查形成的菌落。记录上述菌落的颜色和生长。
11.4结果下面表11中给出结果
++表示良好的生长，+表示适中生长，+/-表示不好的生长以及NG表示没有生长该实施例的介质可能得到四组微生物·形成不退色的橙色菌落的微生物，·形成淡橙色菌落的微生物，
·形成无色菌落的微生物，·不形成菌落的微生物。
在检测的菌株中，革兰氏阴性菌属于前两组，而革兰氏阳性菌属于后两组。
与使用脱保护的底物(参见上述实施例8)得到的结果相比，封端剂(t-Boc)的存在可以调节活性。
完成的其它实验检测了其它的底物，这验证了这里给出的结果；例如·L-丙氨酰-9-(4-氨基-3-甲氧苯基)-10-甲基-吖啶鎓氯化物，·L-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基-吖啶鎓氯化物盐酸，·L-丙氨酰-9-(4-氨基-2，5-二甲氧苯基)-10-甲基-吖啶鎓氯化物盐酸，·β-丙氨酰-9-(4-氨基苯基)-10-甲基吖啶鎓氯化物盐酸，·β-丙氨酰-9-(4-氨基-2-甲氧氨苯基)吖啶，·β-丙氨酰-9-(4-氨基-2，5二甲氧氨基苯基)吖啶，·β-丙氨酰-9-(4-氨基-3-甲氧苯基)-10-甲基-吖啶鎓氯化物盐酸，·β-丙氨酰-9-(4-氨基-2，5-二甲氧苯基)-10-甲基-吖啶鎓氯化物盐酸，类似的，其它种类的微生物，通常是细菌，也进行了检测，例如·鼠伤寒沙门氏菌，·表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，·粘质沙雷氏菌。
权利要求
1.根据其颜色用于检测微生物中的氨肽酶活性或用于确定至少一种细菌是否属于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的显色酶底物，其特征在于，它具有下式(I) 其中R1不存在或为烷基，烯丙基或芳基，R2由至少一种氨基酸优选为丙氨酸组成，R3，R4，R5和R6彼此互相独立地由H-或-O-烷基，优选-O-CH3组成，R7由H，O-CH3，烷基或卤素组成，R8由H或Cl组成，以及n为整数，等于0或1。
2.根据权利要求1的底物，其特征在于它具有下式(Ia) 或它具有下式(Ib)
3.根据权利要求1的底物，其特征在于R1为甲基或烯丙基。
4.根据权利要求1的底物，其特征在于它具有下式(Ic) 或具有下式(Id)
5.权利要求1至4中任一项的底物，其特征在于R2或L-丙氨酸连接到封端剂上。
6.一种培养基，其单独使用至少一种权利要求1至5任一项的显色酶底物，或组合使用该显色酶底物与至少一种其它的对酶活性具有特异性的酶底物，所述酶活性不是由本发明的底物所检测的酶活性。
7.根据权利要求6的培养基，特征在于它由凝胶化介质构成。
8.权利要求1至5任一项的显色酶底物或权利要求6和7中任一项的培养基用于检测微生物中至少一种氨肽酶活性的应用。
9.权利要求1至5中任一项的显色酶底物或权利要求6和7中任一项的培养基用于区分革兰氏阳性显色的细菌与革兰氏阴性显色的细菌的应用。
10.一种检测微生物中至少一种氨肽酶活性的方法，其特征在于该方法包括·提供权利要求6和7中任一项的培养基，·用待测生物样品接种该培养基，·放置进行培养，以及·仅显示至少一种氨肽酶活性的存在，或显示至少一种氨肽酶活性与至少一种不同于氨肽酶活性的其它酶活性组合的存在。
11.一种在其是否属于革兰氏阳性微生物或属于革兰氏阴性微生物方面区分细菌的方法，该方法包括·提供权利要求6和7中任一项的培养基，·用待测生物样品接种该培养基，·放置进行培养，以及·显示至少一种颜色的存在，该颜色代表微生物或革兰氏阴性微生物的存在。
12.权利要求10和11中任一项的方法，其特征在于，当吖啶基10位上的氮没有被季铵化时，通过向培养物中加入酸，优选盐酸，乙酸或柠檬酸，来显示至少一种氨肽酶活性的存在。
全文摘要
本发明涉及新的显色酶底物，其用于检测微生物中的氨肽酶活性或用于根据其颜色确定至少一种细菌是否属于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。本发明也涉及含有上述底物的培养基，以及上述底物或培养基的用途，用于检测氨肽酶活性和/或从革兰氏阴性菌中区分出革兰氏阳性菌，以及其使用方法。上述新的底物具有下式(I)其中R
文档编号C12Q1/04GK1745066SQ200480003095
公开日2006年3月8日 申请日期2004年1月26日 优先权日2003年1月29日
发明者A·詹姆斯, A·里格比 申请人:拜奥默里克斯公司