专利名称：蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物化学和蛋白技术领域且涉及尤其是由转基因植物材料分离和纯化异源蛋白的改进方法。此外，本发明提供了融合蛋白的蛋白水解裂解的改进的和经济的方式。
背景技术：
基于生物制药的蛋白在提供抗严重疾病的更特异性和组织特异性或细胞特异性药物治疗中显示出重要的前景(参见综述“RecombinantProtein Drugs”Ed.P.Buckel 2001)。
现有技术中的很多实例已显示利用微生物诸如细菌，和动物细胞生产这种生物药物；其中胰岛素是重要的实例。
在文献中许多实例已显示利用转基因植物或植物细胞培养物用于表达和生产高价值的异源多肽或生物药物。这种基于植物的生产方法可称作分子耕作。
有价值的蛋白的生产可通过利用植物作为生产生物更经济的产生。与基于生物反应器的大多数生产系统诸如原核生产系统、动物细胞培养物等相比，使用植物作为宿主生物用于蛋白生产的培养成本可显著地降低。然而，对于上述所有生产系统而言，异源蛋白的纯化仍然是必须且昂贵的任务。因此，对于基于植物的生产系统而言，在高价值异源蛋白的生产中下游加工消耗了大部分的生产成本。
蛋白纯化和分离是通过利用基因技术在各种宿主生物中累积和产生的蛋白的下游加工中的关键过程。由宿主生物纯化蛋白可能是十分费力、复杂和昂贵的。各种色谱分析策略被商业地使用用于由生产宿主生物分离和纯化目的蛋白。色谱分析策略可依赖于污染的或内源蛋白和目的异源蛋白之间的物理化学差异，诸如在大小、溶解度、电荷、疏水性和亲合性方面的不同。
色谱分析策略的组合包括多重步骤，需要若干昂贵的层析基质和必要的硬件包括柱，控制单位等等，且在每一步骤中伴随产物产率的损失，且因此导致经济的损失。除包括色谱分析步骤之外，下游加工通常包括多重过滤和离心步骤。结果，纯化和下游加工的成本可能成为纯化基于生物技术产物的蛋白的限制。作为用于大量基于蛋白的较低价值的产物，诸如工业蛋白，下游加工的成本可能限制它们的使用和销售，导致产生粗糙的和不适的产物。对于大多数生物技术产物而言，纯化成本无疑是生产成本的主要部分。
影响由分离污染物分离目的特定层析基质的成本由于它们的生产涉及复杂的结合化学作用是昂贵的。这些基质的化学复杂度可导致在纯化方法过程中由基质中进行配体及其它物质的不必要的沥滤，其中必要的预防测定，监控或由目的蛋白中去除沥出物增加了已经昂贵的下游加工的成本。
亲和层析最有功效的纯化方法，因为其基于试剂和特异性配体之间的特异性亲合性，通常模拟天然蛋白-配体的相互作用。可利用一些不同类型的亲合性吸附剂，某些对特定蛋白是高度特异性，其它的结合于除特定蛋白之外的蛋白类型。
多数情况下，亲和层析依赖于通过重组基因技术连接于目的异源蛋白的特异性标记的存在。当这些标记用于目的异源产物的纯化时，需要被裂解掉。该裂解通过利用在特异性切割位点切割蛋白的氨基酸主链的高度特异性蛋白酶来实现，也即在克隆阶段导入到标记和目的蛋白之间。有效地分离蛋白酶的需要和彼此产生的裂解产物增加了所涉及的纯化步骤的复杂性、数目以及利用这种位点特异性蛋白水解裂解的加工成本。与利用这种特异性蛋白酶有关的成本常常限制基于标记的亲和层析的工业应用，因此限制了这些有效纯化技术的利用。更经济和有效利用特异性蛋白酶的方式使得生物工艺工业成为可能且通常可能降低纯化重组蛋白的生产成本。
在很多情况下，亲和层析意味将固定配体用于特异性选择结合于配体的蛋白的吸收剂。配体与亲合性吸附剂的结合包括利用结合化学作用诸如吸附剂的溴化氰-，甲苯磺酰-，或乙烯砜(vinylsulfone)-激活。结合于柱基质的配体可能是或可能不是蛋白来源的。前者的实例为，但不限于，具有γ-球蛋白亲和性的固定化蛋白A或蛋白G，因此对抗体纯化是有用的，以及对糖蛋白具有亲合性的凝集素。作为后者的实例，结合于基质的固定化谷胱甘肽结合包含谷胱甘肤S-转移酶结构域的融合蛋白。固定的金属亲和层析(IMAC)基于金属-螯合配体与基质固定化并且依赖于固定在柱上的金属离子和蛋白上的碱性基团(主要是组氨酸残基)之间的微弱配价键的形成。市售的克隆载体提供了在框中克隆具有一系列组氨酸残基-His-标记的cDNA的可能性，其能够用IMAC纯化生成的融合蛋白。尽管广泛地用于蛋白的小规模的纯化，IMAC是非特异性的但是选择性的方法，因为在污染蛋白中的天然组氨酸残基可能在IMAC中导致结合(Scopes 1993)。一些不同类型的标记或结合结构域在产生融合蛋白的市售表达载体中是有用的，其中标记/结合结构域将融合蛋白结合于结合到柱基质上的配体。
可用这些基质-配体系统获得蛋白结合的高度特异性。在上述情况中，包括复杂的结合化学作用将配体固定到惰性基质上。因此，亲合性基质的成本通常成为这些有效技术的工业规模应用的限制。
此外，由于对大多数其它类型的层析方法而言，配体结合于基质的稳定性成为难题且沥滤是尤其考虑的问题。在许多敏感的生物活性蛋白纯化过程中，IMAC中的重金属沥滤可导致不能接受的和严重的污染，且可能使被纯化的蛋白失活(Scopes 1993)。
通常，蛋白与其配体的结合亲合性是如此强烈使得破坏配体-蛋白结合的洗脱条件需要使被纯化的有价值的蛋白部分变性的激烈条件。这些的非-限制性实例是需要在低pH处变性来由柱释放抗体由蛋白A-亲合性基质洗脱抗体。由于纯化蛋白活性丧失的风险，并不希望在蛋白纯化过程中包括变性步骤，增加蛋白再折叠的额外步骤，以及对于折叠蛋白产物所需的随后活性分析，以及增加成本。
为了能利用基于亲合性的层析由植物进行大规模纯化，非常希望发展比目前的商用方法更简单和更经济的纯化过程，其应具有较少的结合化学作用并与制药工业标准的质量要求不矛盾。
多糖和多糖结合蛋白可结合使用用于亲和层析步骤的设计(参见，例如，Boraston等，2001)。
Shani等人的美国专利6,331,416描述了表达具有结合于宿主植物细胞壁中纤维素的多糖结合结构域的重组蛋白的方法，以及利用此蛋白没有不充分定义的宿主植物纤维素的亲合性进行的蛋白纯化过程，产生可与可溶性污染蛋白分离的细胞壁-蛋白复合物。结合的强度可使得由纤维素宿主植物材料中释放蛋白可能需要激烈的蛋白变性条件，所述条件对被纯化的重组蛋白的活性具有负作用。涉及的复杂性与上述的抗体-蛋白A洗脱类似。
碳水化合物结合结构域cbm9-2来自海栖热袍菌(Thermotogamaritime)木聚糖酶10A(Winterhalter等，1995Mol.Microbiol，15(3)，431-444)。CBM9-2基因组DNA序列可获自GenBank登录号Z46264且其属于CBM-s的IX家族并具有许多用于高分辨率的亲和纯化的吸引人的特性，包括利用1M葡萄糖作为洗脱液的非-变性洗脱条件，以及用于无定形和结晶纤维素的高度特异性亲合性(Boraston等，2001Biochemistry 40，6240-6247)。
基于植物生产蛋白显示了以经济的方式大规模生产蛋白的重要前景，如已被在文献中的实例所显示(综述参见Hammond 1999)。
与用植物分子耕作有关的培养成本比用传统的基于生物反应器的方法相比显著地降低。
广泛公认需要一种有效、简单和经济地由转基因植物材料纯化异源蛋白的下游加工方法。此外，这种下游加工需要包括用于目的蛋白的温和、非-变性条件(尤其是，具有温和洗脱条件的特异性亲和纯化方法)以确保目的蛋白的生物活性并提高产率。不受上述限制的蛋白纯化过程可显著地降低与由植物生产生物药物有关的生产成本，并能够用于纯化其下游加工被限制且是复杂和昂贵并且有价值的异源蛋白。
发明概述和目的本发明的主要目的是提供植物、获自植物的组织或植物细胞中产生高度有价值的异源蛋白的改进蛋白纯化方法，以及由融合的亲和标记诸如例如与蛋白融合的CBM分离目的异源蛋白的有效且经济的蛋白水解方法。
本发明目的在于减少成本和改进在植物中产生的异源蛋白的下游加工的质量。
纯化过程的重要特征是由细胞壁片段及得自其它没有充分定义的植物的固形物内在分离目的蛋白作为CBM-融合蛋白，因为本发明的CBM-融合蛋白不结合于这些组分。这可以在亲和层析之前单独进行或与亲和层析步骤同时进行。
在第一个方面，本发明提供了用于由表达所述融合蛋白的转基因植物或转基因植物细胞生产和纯化包含纤维素结合组件(CBM)的可溶性异源融合蛋白的方法，该方法包括破碎转基因植物材料；将提取液体添加于植物材料，由此产生可溶性和不溶性植物材料的混合物，以便由所述破碎的植物材料提取可溶性融合蛋白至液相中来获得蛋白提取物；由包含所述目的融合蛋白的所述蛋白提取物分离包括细胞-壁物质和固形物的不溶性植物材料；将所述蛋白提取物与结合于所述融合蛋白的多糖基质接触；用一种或者多种合适的水溶液诸如一或多种缓冲液冲洗具有结合的融合蛋白的基质，即，可利用梯度或一系列不同洗涤液在一个步骤中进行冲洗；和通过调整影响所述融合蛋白由基质释放的条件由所述多糖基质洗脱融合蛋白。
通常，转基因植物或植物细胞选自双子叶植物和单子叶植物，且在优选的实施方案中，所述植物细胞或转基因植物来自烟草、油菜籽、大豆、苜蓿、莴苣、大麦、玉米、小麦、燕麦和水稻。
在某些实施方案中分离步骤包括选自膨胀床吸附(EBA)，填充式层析，沉淀，过滤，离心或其任意组合的方法。
将融合蛋白结合于多糖基质的亲合性结合步骤优选地包括层析步骤。
然而，在特定有用的实施方案中，所述由目的蛋白CBM融合蛋白分离细胞-壁片段及其它没有充分定义植物来源的固形物，以及CBM融合蛋白亲合性与多糖基质的亲和结合可以利用具有合适的，廉价的多糖基质的膨胀床吸附色谱法(EBA)在单个有效的纯化步骤中进行。这些特征革新并改进了下游加工的经济性。
在本发明有益的实施方案中，多糖基质包括纤维素，且优选地包括药学上相容的纤维素。这种CBM-融合蛋白结合的明确限定的药物级纤维素可以允许纯化异源蛋白的各种高端应用。用作多糖基质的有用的药学上相容的纤维素物质包括AvicelTM(FMC Corporation，PA，美国)。
用于本发明亲和层析的多糖基质不需要复杂的结合化学作用或潜在沥滤配体的固定化。多糖基质当构成亲和吸附剂本身时提供了结构的支持和刚性。因此，更经济的和安全的蛋白纯化能够用于获自植物的异源蛋白。
本发明的又一优点是所述加工能根据纯化的异源蛋白的不同最终用途用于不同质量的不同多糖基质，例如用在例如农业、化学工业或制药工业中。由药物级的多糖制成的亲和吸附剂是制药工业内的散装材料且价格显著地低于任何市售的亲和层析介质。因此，可利用本发明所述的加工经济地制备非常高质量的亲合性基质，能够更经济地下游加工来自植物材料的高价值蛋白。
本发明的进一步优点为一旦获自植物的CBM-融合蛋白结合于多糖层析基质，且冲洗基质除去所有污染的内源植物蛋白后，可利用非-变性，温和条件通常为中性的或酸性条件且优选地添加可溶性碳水化合物(糖)由柱洗脱融合蛋白，所述条件保持了任何连接于CBM的融合伴侣蛋白的活性和结构。糖与纤维素竞争CBM的结合位点且合适的浓度将基本上释放所有结合CBM的融合蛋白。
用于本发明方法且融合于目的异源蛋白的优选的CBM-s是具有目的结合特性允许充分地强烈结合于合适的多糖基质来获得高产率的结合CBM融合蛋白，并且通过如上所述的温和条件释放的CBM-s。CBM9-2已被发现具有这些目的特性。利用其它具有这种特性的CBM-s也在本发明的范围内。这种CBM-s可通过检索可获得的基因数据库中的编码具有目的特性的CBM的序列，例如被认为与对于结合特性是重要的CBM9-2中的基序类似的基序来发现。同时，存在的CBM-s可用本领域众所周知的点突变技术修饰来修饰其结合特性以获得本发明合适的CBM-s。
融合蛋白由多糖亲合性基质洗脱后，其可以任选地进行一或多个进一步的纯化或分离步骤，取决于所需的形式和使用的蛋白。
在有用的实施方案中，转基因植物或植物细胞包括编码CBM的核酸序列，优选CBM是热稳定的且在高温下保持可溶性。术语热稳定的在这里表示蛋白在高温也即约25℃以上的温度，且通常约37℃以上，包括40℃-100℃范围温度下保持可溶性、正确折叠和活性。
编码这种优选的CBM的基因可获自嗜热生物，包括嗜热细菌，藻类和真菌且以表达包含所述CBM的融合蛋白的方式导入到宿主植物或植物细胞中。术语嗜热在这里是指生物的最佳生长温度超过40℃。优选CBM通过来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的木聚糖酶10A基因编码，优选编码CBM的宿主植物或植物细胞内的区域是所述基因的区域。所述编码CBM的区域可在特定的实施方案中包含序列SEQ IDNO1，或编码相同氨基酸序列的核酸序列，或编码与所述氨基酸序列具有基本上的序列同一性的氨基酸序列的序列。
本发明的某些实施方案中加工过程中需要加热包含可溶性融合蛋白的蛋白提取物到37℃和100℃范围内的温度，例如，50-80℃范围内的温度，诸如由1分钟到120分钟的范围内的一段时间。对于此目的而言，热稳定的CBM诸如来自嗜热来源的是尤其有用的。在此种加热过程中，内源性植物蛋白的一部分可能失活和/或变性且可因此容易地与蛋白提取物分离。所述加热提取可能优选进行包括用多糖基质的膨胀床吸附由加热的提取物同时分离固形物和亲合性结合所述CBM融合蛋白的加工步骤。
在本发明特定的实施方案中，所述异源融合蛋白包括蛋白酶(表示蛋白分解活性的多肽)，其在特定有用的实施方案中为哺乳动物肠激酶(EK)或其肠激酶-活性部分，例如，牛EK或牛EK催化结构域(EKc)。用于此目的的有用的EKc由SEQ ID NO2所示的核酸序列编码。
在本发明高度有用的实施方案中，所述融合蛋白包括CBM和通过包含蛋白水解切割位点，优选被特异性蛋白酶识别和裂解的蛋白水解的切割位点的氨基酸伸出物截断的目的异源多肽。由于具有这种位点，CBM可被容易地与融合蛋白中的融合伴侣裂解掉来获得没有伴随CBM的目的异源蛋白。
因此，在相关的方面，本发明提供了纯化目的异源蛋白的方法，该方法包括(a)提供了包含如以上定义的融合于由蛋白水解切割位点截断的CBM的融合蛋白，(b)在通过所述蛋白酶促进蛋白水解裂解的条件下，所述融合蛋白与融合于CBM的功能性蛋白酶接触，来从目的异源蛋白裂解融合的CBM，(c)在其中CBM-蛋白酶和游离的CBM结合于所述多糖基质且其中目的异源蛋白不保持在所述多糖基质上的条件下，如在这里限定的，将CBM-蛋白酶，游离的CBM和目的异源蛋白的溶液与多糖基质接触，(d)由多糖基质分离未-结合的目的异源蛋白，(e)用一或多种合适的水溶液冲洗具有结合的CBM-蛋白酶和CBM的多糖基质，(f)通过调整影响所述CBM-蛋白酶由基质释放的条件由基质洗脱CBM-蛋白酶；和(g)任选地复原所述洗脱的CBM-蛋白酶，来保持其与所述多糖基质的亲合性，使得复原的CBM-蛋白酶可再用于随后方法的重复。
结合融合蛋白、冲洗和洗脱的步骤优选地如上所述进行。
在优选的实施方案中，融合于CBM的蛋白酶为肠激酶，优选地如上所述。此种CBM-融合蛋白酶，EK或其它类型可通过在这里所述的方法适当地产生和纯化。
应能理解如上所述的方法可有益地与上述方法结合来制备和纯化可溶性异源融合蛋白，从而获得不含融合CBM的纯化形式的最初作为CBM融合蛋白表达和分离的目的异源蛋白。
方法的其它优点为复原所用蛋白酶的可能性，即利用重复用于表达为CBM融合蛋白的目的蛋白的批量生产的相同蛋白酶，使得在这里所述的方法更加经济。这些很容易被实现，因为CBM-融合蛋白酶被设计不具有蛋白水解切割位点，使得阻碍CBM由CBM蛋白酶本身裂解。此外，如上文所述，这种复原通过用于洗脱的温和条件使其成为可能，由此不损害洗脱的蛋白酶的活性。
由此，本发明进一步的优点是其提供了能够复原昂贵的、特异性蛋白水解酶的方法，由此额外降低了异源蛋白诸如尤其是，但不限于获自基因修饰植物、植物材料和植物细胞的蛋白的下游加工中的亲和纯化的成本。
本发明成功地克服了与用于诸如但不限于农业、化学工业和基于蛋白的药物生产的大规模异源蛋白生产有关的下游加工的缺点。尤其是，提供了用较少的加工步骤由诸如植物纤维素材料的生物材料分离CBM-融合蛋白的新方法，所述加工步骤利用了可用于制药工业的安全和更加经济的亲和层析原则，维持高价值异源蛋白的活性的温和洗脱条件，且包括能够复原方法中的特异性高价值蛋白酶的加工步骤。
图1是CBM蛋白酶纯化方法以及CBM融合蛋白的蛋白水解裂解的优选实施方案的示意图。
图2显示了获自实施例1的SDS-PAGE的分析结果。泳道1分子量大小标记，泳道2纯化的CBM9-2，泳道3来自碾磨的大麦种子的冲洗的固形物，泳道4生物材料相互作用后的上清液，泳道5用低盐缓冲液进行的第一次冲洗，泳道6用高盐缓冲液进行的第5次冲洗。
图3显示根据本发明方法由碾磨的大麦种子提取物成功纯化CBM9-2，如在实施例2中的详述。该图显示了具有200mL纤维素的膨胀床吸收(EBA)柱的洗脱图。
图4显示获自实施例3的结果。该图示显示了对照样品的ELISA读数以及包含融合于CBM9-2以及根据在这里所述的纯化过程的小规模纯化的目的异源蛋白的样品的最小读数。该柱显示了(a)洗脱缓冲液，(b)来自转基因种子的融合蛋白提取物，以及(c)由非-转基因种子提取的蛋白测定的ELISA值。
发明详述下面将具体描述本发明。
除非另有定义，在这里使用的所有技术和科学名词具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解以及使用的含义相同。
术语“多肽”在这里是指任何氨基酸的聚合物，单体的或多聚体，且不涉及特定长度的氨基酸的聚合物。由此，例如，术语肽，寡肽，蛋白，和酶被包括在多肽的定义内。此术语也包括具有表达后修饰诸如例如，糖基化，乙酰化，磷酸化等的多肽。
术语“目的异源多肽”或“目的多肽”在这里是指用于在植物-细胞或植物组织中利用本发明的方法或组合物表达的任意多肽。作为非-限制的实例，药用多肽(例如，用于药物用途)或工业多肽(例如，酶)可根据本发明来制备。
术语“下游加工”是指将生物技术产物分离和纯化形成为适于其目的用途的形式。
术语“融合伴侣”在这里是指与CBM连接的异源蛋白。
术语“CBM融合蛋白”是指包括连接于异源蛋白的CBM的分子，且在上下文中其被理解为没有蛋白水解切割位点的分子，除非另有所述。
术语“可操作连接”是指启动子(核酸表达控制序列，或系列转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中启动子指导对应于第二序列的核酸的转录。
术语“变性”是指蛋白的天然结构以及随后蛋白活性被破坏的状态，且蛋白被展开或不正确地折叠改变了其天然的三维结构。
术语“表达”和“生产”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和翻译。
“分子耕作”是指利用露天或在封闭设备中的任何种类植物的操作来在它们的组织中表达和产生异源蛋白。
术语“转基因”是指已导入非天然核酸序列且因此改变了其基因型的任何细胞，细胞系，组织植物部分，器官或生物及其存在非天然的核酸的子代。通常，通过遗传工程方法将非天然核酸序列导入到基因型中或通过这种方法导入到父本细胞或植物的基因型中且随后通过有性杂交或无性繁殖传入到子代中。
瞬时表达是指通过瞬间导入的基因在生物中表达，没有插入到生物的基因组中。因此，瞬时表达常常受时间的限制，且瞬时基因不传递给下一子代。
“基本上的序列同一性”在上下文中表示至少50％序列同一性，且更优选地至少60％诸如至少70序列同一性，诸如至少80％和优选地至少90％的序列同一性，诸如至少95％或99％的序列同一性。用于序列分析的算法是本领域已知的，诸如BLAST，Altschul等在J.Mol.Biol.(1990)215403-10中描述。通常，相对于，例如，“得分矩阵”和“缺口罚分”的默认值设置将用于比对。
术语“转化”或“转化的”是指将核酸序列导入到宿主生物的DNA基因组中，而与将核酸片段导入到宿主细胞中使用的技术无关。
“嗜热的”是指生物的最佳生长温度超过45℃。
术语“GMP”(优质生产标准)是指产生生物药物及其它药物和医疗器材的方式。GMP要求包括标准操作规程，无菌条件，物质和设备以及专业人员的确认。
可遗传操作的单子叶和双子叶植物可用于本发明。优选植物为单子叶植物，更优选地为大麦，且最优选地为大麦(Hordeum vulgaris)。可遗传转化的植物为可导入，表达，稳定维持，以及传递到随后产生的子代中非天然DNA序列的植物，非天然DNA序列包括编码区的DNA序列。遗传操作和转化方法已经用于利用除草剂包括例如除草肽或basta或抗生素，诸如潮霉素作为选择性标记产生大麦植物。
方法本发明其它的目的，优点，和新特征对于本领域普通技术人员来说依据下列实施例是显而易见的，其并非用于限制的目的。另外，本发明如在上文描述的每一不同的实施方案和方面以及如在权利要求部分所要求的在下列实施例中发现实验性的支持。
尽管仅仅具体描述了本发明优选的实施方案，对本领域技术人员来说可预料能产生本发明上述实施例所述的大量的改进和变化，只要不背离本发明的精神和范围。
图1说明了CBM-蛋白酶纯化过程的示意图，或在这方面，任何CBM-融合蛋白，该方法描述如下(1)用于该方法的起始材料是转基因植物，获自转基因植物或转基因植物细胞的材料，包括但不限于，植物细胞的悬浮培养物以及愈伤组织的未分化细胞。在本发明的多种实施方案中，所述材料可以是瞬间表达异源蛋白的植物组织来源。该材料是以调控的方式表达可操作地连接于CBM开放阅读框架的异源基因的转基因材料，其已通过本领域技术人员公知的方法被导入到植物细胞中，诸如，但不限于，农杆菌-介导的转化或粒子轰击-介导的转化或植物病毒载体-介导的转化。起始材料优选地基于融合蛋白的令人满意的表达水平来选择，在启动本发明所述方法之前由通过本领域的技术人员进行RNA或蛋白水平的分析判断。
(2)通过本领域技术人员公知的方法实现破碎转基因材料，其产生干燥或润湿的状态的均化植物组织和植物细胞。可选自各种适合植物材料来源的方法。因此，对于种子而言，碾磨是破碎转基因植物组织的良好方法，而对于叶和软的绿色组织而言可采用诸如，但不限于韦林搅拌器，Sorvall Omnimixer或Poltron匀浆器的设备来实现。叶和较软的组织还可以被冷冻干燥且随后用于均化碾磨。用于破碎植物组织和植物细胞的设备是市售的且容易根据需要按比例放大。由植物来源提取蛋白的常规方法描述在S.Roe编辑出版的G.Paul Powell等，Protein purification applications，第2版，(2001)中。由植物来源提取可溶性蛋白的简单且成功的方法是添加简单的缓冲液类低盐缓冲液到破碎的，搅匀的植物组织中，充分混合。为了抗氧化褐华，诸如添加聚乙烯吡咯烷(1％w/v)通常足以优化由大多数植物组织纯化以便由植物组织中螯合酚醛树脂，否则可对待纯化的异源蛋白有副作用。蛋白水解并非总是导致植物来源具有的问题。如果，然而，考虑蛋白水解，可将蛋白酶抑制因子，诸如，例如，丝氨酸-，半胱氨酸-和金属蛋白酶抑制因子添加于提取缓冲液中。植物材料的破碎可在存在或缺少缓冲溶液的情况下进行。提取溶液可包含或不包含还原剂诸如，但不限于2-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。可溶性植物蛋白和CBM-融合蛋白一起存在于液相中(3)液体与植物材料的混合对于提取液相中的水溶性融合蛋白是必需的。添加的液体可包含或不包含调节优选在约5.2至8.3范围内的pH的缓冲剂，其可包含或不包含任何(2)中所述目的蛋白的还原剂或螯合剂。以其简单的形式，液体可以是水。液体与破碎和搅匀的植物材料充分混合后，液相现在包含CBM-融合蛋白。
(4)(A)在某种程度上取决于均化水平，破碎的植物材料和提取液体的混合物可以直接应用于膨胀床吸附(EBA)柱。在此方法中，混合物被用于柱作为液体流流经多糖特性的亲合性吸附基质的膨胀床。在液体流流经柱的过程中，液相中的融合蛋白暴露于多糖基质且通过CBM与多糖吸收剂介质的选择性亲和力被选择性吸附。粒子诸如，但不限于，细胞壁片段及其它固形物，与任何可溶性植物蛋白一起在流动液体中流经EBA柱。
4(B)任选地，混合物中的大部分固体粒子可利用通过本领域技术人员公知的各种方法在亲合性结合步骤之前与液体分离，这些方法包括，但不限于沉淀，过滤，离心和沉降。如上文所述，丢弃固体且将包含CBM-融合蛋白的液体用于任选的加热步骤4(C)或直接应用于亲合性结合步骤(5)。
4(C)在亲合性步骤(5)之前任选加热混合物或液体，但在其中CBM-融合蛋白在增加的温度下保持可溶性的情况下可作为附加的纯化步骤，而可溶性植物蛋白可能变性和沉淀且单子叶植物蛋白酶可能通过加热被失活。为达到此目的，考虑CBM-融合蛋白的特性的加热方法，可包括在加工过程中50℃到100℃的范围内加热2分钟至60分钟范围内的一段时间。在这些实施方案中，嗜热来源的CBM是尤其有益的。
(5)基质结合亲合性。包含植物来源的CBM-融合蛋白的液体蛋白提取物与和CBM具有亲合性的多糖基质接触。接触可以多种方式实现，诸如，但不限于，用多糖基质填充的层析柱，其中液体以填充或膨胀的方式流经柱，其是指多糖基质的密度，或其可以批量方式实现，其中多糖基质与液体在合适的容器中混合，随后回收基质和吸附的CBM-融合蛋白。多糖基质可以是纤维素来源，诸如，但不限于，Avicel，或其可以是xylanoic来源，诸如不溶性木聚糖。CBM9-2的结合特异性和热力学已在Boraston等(2001)的最新出版物中具体地研究。然而本发明人令人惊讶地发现，与现有技术相比，按照本发明在这里描述的方法，CBM9-2不结合于植物细胞壁组分但很容易溶解，而保持对于诸如在亲合性吸附步骤(5)使用的多糖基质的良好的结合特异性。如在这里描述的，这种令人惊讶的特性给植物来源的CBM-融合蛋白的下游加工引入了几个优点，从而提供了大大改进了下游加工的方法。
(6)冲洗基质。结合于CBM-融合蛋白的多糖亲和吸附剂可以用几个柱体积(如果亲合性基质置于层析柱中，相对量的术语)的水溶液(例如水)或缓冲液，诸如，但不限于磷酸盐缓冲盐水或基于Tris-的缓冲液进行冲洗。为提高冲洗步骤的效率，冲洗缓冲液的组合物可通过诸如但不限于，逐步改变解各柱体积的逐步改变或盐浓度或去污剂的梯度的方式进行调节，用于由基质释放微弱但非特异性结合的污染蛋白。
(7)由基质释放融合蛋白。通过利用具有在这里描述的目的结合特性的CBM-s，由亲合性基质洗脱CBM-融合蛋白可以通过将CBM-融合蛋白暴露于竞争糖诸如，但不限于葡萄糖，半乳糖，乳糖，麦芽糖和纤维二糖得以实现。任一这些或其它类似的糖或其组合可以合适的量，诸如在1mM至1M浓度的范围内添加到洗脱缓冲液中诸如例如，磷酸盐缓冲盐水或基于Tris-的缓冲液以进行洗脱步骤。糖浓度可以是例如在25mM至1M的范围内，诸如50-500mM的范围内。这些糖是市售的低价散装化学制品，进一步降低了本发明下游加工的总体成本。
(8)融合蛋白的分离/纯化。进一步纯化/分离CBM-蛋白酶在某些实例中是有益的或所需要的。这种进一步的分离可用任一通常本领域技术人员公知的色谱分析法来实现，诸如，但不限于离子交换层析法或空间排阻层析。
(9)最终产物。这种情况下最终产物为是高度纯化形式的CBM-蛋白酶，准备用于必要时其最终形式的配制和包装。
(10)包含蛋白水解切割位点的融合蛋白的分离。(1-9)描述的纯化CBM-蛋白酶的方法可以是用于纯化连接于CBM的任何异源蛋白的优选方法。这种CBM-融合蛋白在CBM和目的异源蛋白之间可能含有或可能不含有蛋白水解切割位点。在本发明上文描述的优选实施方案中，纯化方法可连同CBM-蛋白酶用于裂解CBM-融合蛋白并由CBM-蛋白酶和裂解的CBM有效地分离目的异源蛋白。在蛋白水解裂解步骤(11)之前进一步分离含有蛋白水解切割位点的CBM-融合蛋白可能需要是或可能不需要，或在有些情况下可能是有益的。这些融合蛋白的分离可能对于改变含有具有蛋白水解切割位点的CBM-融合蛋白的缓冲液有用，使得调整其至有利于步骤(11)的蛋白水解裂解反应的条件。这些分离可以用任一通常本领域技术人员公知的色谱分析法来实现，诸如，但不限于，离子交换层析法或空间排阻层析。
(11)由异源蛋白融合伴侣来蛋白水解分离CBM。在该方法的这个阶段，将含有蛋白水解切割位点的CBM-融合蛋白暴露于融合于CBM但没有切割位点的特异性蛋白酶，该蛋白酶能够识别切割位点且由目的异源蛋白分离CBM。连接CBM的特异性蛋白酶优选选自切割位点-特异性蛋白酶的组，诸如肠激酶，因子Xa，凝血酶等等。裂解反应完成后反应溶液包括释放的CBM，残留的未裂解的CBM-融合蛋白，CBM-蛋白酶(例如，CBM-EK)，以及释放的目的异源蛋白。
(12)CBM-蛋白酶和游离CBM与基质的结合亲合性。如上文步骤(5)中所述将含有所有这些组分的溶液与和CBM具有亲合性的多糖基质接触。所有含有CBM的组分将吸附至亲合性基质上而释放的高度纯化的目的异源蛋白回收在液流中。
(13)异源蛋白的进一步分离。尽管目的异源蛋白已经高度纯化，在有些情况下进一步纯化/分离可能是需要的或是有益的。这些进一步的分离可以是层析步骤，诸如，例如，离子交换层析法或空间排阻层析。
(14)最终产物。最终产物为是高度纯化形式的CBM异源蛋白，准备用于必要时其最终形式的配制(例如，冷冻干燥)和包装。
(15)冲洗基质此步骤可以如步骤(6)所述来进行。
(16)CBM-蛋白酶和CBM的释放。利用上述步骤(7)所描述的洗脱条件，从溶液中回收CBM-蛋白酶。这些溶液的复原包括条件的中和和/或除去试剂(例如糖)，其影响由多糖亲合性基质释放CBM。所述试剂可以由具有CBM蛋白酶的溶液中例如用超滤，透析，空间排阻层析以及在一定条件下的离子交换层析除去。如果需要，诸如空间排阻层析的某些这些方法还可以由残留的CBM和CBM-融合蛋白纯化CBM-蛋白酶。
(17)CBM-蛋白酶的复原。一旦CBM-蛋白酶复原回复到对所述多糖基质重获亲合性的状态，其可以被再次引入该方法中来如步骤(11)用于含有蛋白水解切割位点的CBM-融合蛋白的新一轮的蛋白水解裂解。尽管重构的CBM-蛋白酶溶液可能含有来自前一反应的残留CBM和痕量的未裂解CBM-融合蛋白，它们将不干扰裂解的异源蛋白融合伴侣的纯化，因为它们将与CBM-蛋白酶一起共-纯化。因此，高价值特异性CBM-蛋白酶的有效复原提高了本发明的新方法的效率和经济性且能够大规模生产和纯化重组产生的蛋白，由此限制了以前下游加工的过高成本。
本发明其它的目的，优点，和新特征对于本领域普通技术人员来说依据下列实施例是显而易见的，其并非用于限制的目的。另外，本发明如在上文描述的每一不同的实施方案和方面以及如在权利要求部分所要求的在下列实施例中发现实验性的支持。
实施例实施例1生物材料相互作用研究CBM9-2和碾磨的大麦种子在Retsch磨中将干燥的大麦种子细致地研磨成细粉末。将1g的碾磨种子用于通过5ml的低盐缓冲液(pH7.02的50mM磷酸钾缓冲液)从种子中提取水溶性组分，作为除去样品的所有水溶性组分的方法，所述水溶性组分可能干扰生物材料相互作用的研究。涡旋混合物且翻转5分钟来确保液体和碾磨的大麦种子材料的充分混合。
混合之后，在5000×g离心样品4分钟来对固形物造粒。离心后，丢弃上清液。此过程用低盐缓冲液重复3次，每次离心后丢弃上清液。然后用高盐缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.02，1M NaCl)重复冲洗过程3次，如前所述丢弃上清液。产生的冲洗固形物为大部分的植物细胞-壁片段和不溶性淀粉。用低盐缓冲液如上所述进行3次冲洗平衡冲洗的固形物，来获得有助于亲和层析中CBM9-2亲合性结合于纤维素基质的相同条件。将生物材料相互作用研究之前的固形物的典型样本用于SDS-PAGE分析(泳道3)。将通过纤维素(AvicelTM)-亲和柱(O.D.@280nm 0,394)纯化的10μl细菌产生的CBM9-2，用于随后的SDS-PAGE(泳道2)。将纯化的CBM9-2预先重复(4x)稀释且在超滤组件浓缩作为从CBM9-2脱附任何结合的葡萄糖的证明方法，以便恢复蛋白的纤维素结合亲合特性。
将2ml的纯化的CBM9-2添加于获自碾磨大麦种子的冲洗、平衡的固形物且混合物在室温下振荡温育60分钟。温育后，以5000×g旋转混合物10分钟，且随后以13.000×g离心澄清上清液5分钟。将来自生物材料相互作用的10μL澄清上清液用于SDS-PAGE分析(泳道4)。随后将包括碾磨的大麦种子固形物的沉淀如上所述用低盐缓冲液冲洗5次以及随后用高盐缓冲液冲洗5次。10μL的第1次低盐缓冲液冲洗(泳道5)和第5次低盐缓冲液冲洗(泳道6)，用于随后的SDS-PAGE分析。为了由碾磨大麦种子固形物洗脱所有结合的CBM9-2，在以5000×g离心5分钟和除去上清液(洗脱物)之前将1ml的洗脱缓冲液(50mMKPO4中的1M葡萄糖的，pH7.02)添加于固形物且混合温育15分钟。准备10μl的洗脱物样品用于SDS-PAGE分析(泳道7)。将生物材料相互作用研究和洗脱后的固形物的典型样本用于SDS-PAGE分析(泳道8)。将制备用于SDS-PAGE的生物材料相互作用测定的样品在12.5％SDS-PAGE凝胶(PhastGels同质的12，5)上利用PhastSystem(AmershamPharmacia Biotech)进行SDS-PAGE。电泳完成后用考马斯蓝R-250对凝胶染色，以及脱色。结果显示于图2。
这些结果显示CBM9-2没有显著地结合于获自植物的细胞-壁或其它来自碾磨的大麦种子的不溶性固形物。
实施例2来自碾磨大麦种子的提取物的CBM9-2的纯化利用市售的研磨机(Aarslev Maskinfabrik，Erhvervsvangen 11，5792Aarslev，DK)将大麦种子碾磨成精细的粉末。将产生的大麦粉以大麦粉∶缓冲液分别为2∶3的体积比在低盐缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.02)中浸湿。将液体与粉末在容器中彻底混合并允许在4℃过夜沉淀。由细菌纯化的CBM9-2添加至大麦种子-上清液中。第二天，将含有CBM9-2峰值的上清液(100ml)提供给含有纤维素(AvicelTM)的Streamline 25(Amersham Biotech)层析柱。以184cm/h的流速，膨胀床的方式进料，然后用5柱体积高盐缓冲液(1MNaCl的50mM KPO4溶液，pH7.02)，然后5柱体积的低盐缓冲液(50mM KPO4，pH7.02)进行冲洗。允许膨胀柱床沉淀(沉淀床＝20cm)并以92cm/h的300ml洗脱缓冲液(1M葡萄糖的50mM KPO4溶液，pH7.02)进行洗脱。洗脱条件产生含有CBM9-2蛋白的小峰(参见图3)。
这表明利用上文描述的方法；首先，CBM9-2保持在溶液中与来自碾磨大麦种子的细胞-壁片段及其它未充分定义的固形物脱吸附，其次；利用本发明所述的多糖亲和层析由碾磨的大麦种子提取物捕获CBM9-2是可能的，第三；可通过利用较好限定的药物级纤维素(Avicel)作为基质来进行，和第四；可通过本发明所述的膨胀床方式进行亲和层析步骤，第五；由大麦种子-提取物纯化的CBM9-2可在本发明所述的温和条件下由基质洗脱而避免任何变性步骤。与如上文所述完全相同的条件和方法可用于由转基因碾磨种子纯化CBM9-2-融合蛋白。合适的方法描述在申请人同时申请的悬而未决的“由植物纯化重组蛋白的非-变性方法”且在这里全文引入作为参考。
所述的多糖亲和层析也有效的用于在如本发明所述的蛋白水解裂解反应后由目的蛋白分离蛋白酶-CBM和切割的CBM。
实施例3从碾磨的，单一的大麦种子提取物纯化连接于CBM9-2的异源蛋白。
在上文所述纯化方法的小规模形式中，将表达连接于CBM9-2的目的异源蛋白的转基因大麦植物的单一种子分别地均质化为精细粉末。将产生的种子粉末以大麦粉末∶缓冲液分别为1∶7的体积比在低盐萃取缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.02，0,01％聚乙烯吡咯烷)中浸湿。液体与单一种子粉末彻底混合1小时，且在室温下以5分钟的间隔振荡将水溶性蛋白提取到液相中。
在离心机中以6000rpm旋转提取物混合物10分钟。收集来自个体种子的上清液(提取物)并应用到充满纤维素(AvicelTM)的微孔滤板(MSHVN45，MilliporeTM)上。将提取物添加于相应微孔的纤维素中在室温下以每3分钟间隔搅拌持续15分钟。15分钟后，通过真空歧管(Multiscreen resist vacuum manifold-MAVM0960R，MilliporeTM)将真空将应用于微孔板以排出每一孔中的来自纤维素(流经)的液体。如上文所描述的将纤维素进行冲洗步骤5柱(即填充纤维素的微孔)体积高盐缓冲液(1M NaCl的50mM KPO4溶液，pH7.02)，然后5柱体积的低盐缓冲液(50mM KPO4，pH7.02)。用250μl的洗脱缓冲液(1M葡萄糖的50mM KPO4溶液，pH7.02)进行洗脱。通过应用真空到新鲜微孔板的微孔上来收集洗脱物。将洗脱物用于高度特异性ELISA CBM9-2分析，也即基于抗CBM9-2的特异性多克隆抗体。ELISA如下进行；将50μL适当稀释的抗原溶液(0.1-5ng蛋白)应用于Nunc-Immuno 96微孔板的每一孔(Cat.no.442404)。微孔用透明胶带覆盖并在37℃温育1小时。将抗原溶液移出微孔并用100μl TBS冲洗3次。用100μl每孔的封闭溶液封闭微孔，用透明胶带覆盖微孔并在37℃温育1小时。丢弃封闭溶液后，用含有0.01％吐温的100μlTBS冲洗微孔5次。将抗CBM9-2的初级抗体适当地稀释添加(例如1/3000)在1％BSA的TBS(每孔50μL)中并用透明胶带覆盖且在37℃进一步温育1小时。移出抗体溶液并用含有0.01％吐温的TBS冲洗微孔10次。次级抗体(与辣根过氧化酶结合的)在1％BSA的TBS(50μl每孔)中1/3000稀释。微孔用透明胶带覆盖并在37℃温育1小时。弃去溶液后并用100μl含有0.01％吐温的TBS冲洗8x以及用无吐温的TBS冲洗2x，将100μl TMB One溶液(PromegaTM)添加至每孔并在室温下温育微孔板30秒-5分钟。当蓝颜色展开时，添加100μl的0.2M硫酸。颜色变黄，并在微孔板读数器中450nm处测定吸光度。
来自个体转基因大麦种子的单一种子提取物的ELISA分析结果显示于图4中。以前用于证明CBM9-2特异性的ELISA分析表明，首先；可获得和证明个体种子中异源融合蛋白的累积；上文所述的分离的具有切割位点的异源融合蛋白的工作，甚至小规模时依然支持了纯化过程的规模能力；其表明异源融合蛋白在层析方法过程中没有暴露于变性作用，由于洗脱后被特异性抗体识别而没有涉及任何复性步骤，突出了如在上文讨论的本发明相对于一些其它苛刻亲和层析方法的优点；在上文描述的纯化方法适用于任何连接于CBM9-2的异源融合蛋白且不局限于捕获CBM-蛋白酶。
实施例4CBM-蛋白酶的纯化和活性测定为了产生具有连接CBM9-2标记的位点特异性蛋白酶，方法如下构建根癌农杆菌菌株AGLO，使其含有携带由肠激酶cDNA之前的组成性启动子，靶向内质网(ER)的信号序列以及将蛋白维持在ER中的保留信号组成的表达构建体的二元质粒，其中肠激酶cDNA被连接相当于CBM9-2的cDNA。此农杆菌菌株在选择条件下培养在YEB培养基中，首先在10ml中28℃培养2天直至OD600为0.8。在28℃2-3天将少量的培养物1∶50稀释为含有20μM乙酰丁香酮的500ml培养物并强烈振荡至OD600nm为2.5。以6000rpm旋转细菌10分钟并再悬浮在MS-溶液中(含有55g/l蔗糖)至OD600为2.5。添加乙酰丁香酮(10mM)，终浓度为20uM。细菌悬液维持在室温1小时并添加吐温-20(10％)，终浓度为0.005％。
为了在莴苣植物中瞬时表达CBM-蛋白酶，将莴苣植物浸没到含有农杆菌细菌悬液的碗中15秒。随后植物置于真空并施加0.4大气压力20分钟，开放进气口迅速地补偿压力。通过连续浸渍到装有自来水的碗中来洗掉叶面上的过量细菌。莴苣植物置于培养箱中22℃以白天16小时/夜间8小时培养4天。
通过切除叶组织收获植物并且随后冷冻并保持在-86℃。利用研钵和液氮均化植物直至获得非常精细的粉末。通过分别添加1.2∶1(体积∶体积)低-盐萃取缓冲液和莴苣粉末提取粉状莴苣叶材料，蛋白提取物在室温下间或搅拌30分钟。
提取物随后以6000rpm离心20分钟由液相分离固体物质和细胞壁片段。丢弃上清液并如上所述再次旋转。如上所述将澄清上清液填充到含有纤维素基质(AvicelTM)的填充床柱上。CBM-蛋白酶特异性连接于纤维素基质并且用5柱体积的高盐和低盐冲洗缓冲液分别冲洗后，在温和，非-变性条件下用单一峰值的1M葡萄糖溶液由柱洗脱CBM-蛋白酶。
随后利用微孔浓缩器(Ultrafree-15-Biomax-5)浓缩峰产物。
利用特定合成的底物根据标准方法(Grant & Hermon-Taylor，1979)测定肠激酶活性合成的底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘酰胺(GD4K-na)；测定条件37℃。反应体积为1.5ml。反应混合物包括25μl 10mM GD4K-na(0.5mM)，125μl的100mMTris-HCl，pH8.4(25mM)，50μl 100％DMSO(10％)，50μl的100mM CaCl2(10mM)，(20-100)μl肠激酶，250μl蒸馏水-(20-100)μl。由λex＝337nm和λem＝420nm之间的荧光的增加测定β-萘胺形成的速率。连续地监控5分钟。
活性测定的结果表明所述产生和纯化的CBM-肠激酶是活性的；肠激酶活性与空白0,0001cps/min/μg比较被测定为442,7cps/min/μg。
该实施例表明首先；CMB-蛋白酶可在植物中产生，在情况下在莴苣中瞬间产生，而且可利用上述所述纯化方法成功地分离和纯化CBM-蛋白酶。其进一步表明融合蛋白的CBM9-2亲和性标记具有完全的功能性；CBM-蛋白酶有效连接于纤维素基质且其可以在本发明描述的温和洗脱条件下由基质洗脱下来，并且洗脱的蛋白酶被证明是具有完全活性的。酶促活性的纯化产物本身提供了纯化过程的非-变性特性的证据，如对部分或完全变性作用尤其敏感的酶活性，其容易导致活性的损失。此有效地表明本发明的所有组件是功能性的且它们的特性和性能使其可被容易地以本发明上述的方法应用，产生改进了主要特异性、任何来源的异源蛋白的下游加工经济性和效率的方法。
参考文献Altschul等，J.Mol，Biol.(1990)215403-10.
Boraston等，(2001)Biochemistry 40，pp.6240-6247.
Contributors(2001)的″Recombinant Protein Drugs″Ed.P.Buckel-from series-Milestones in Drug Therapy，Birkhauser Verlag，Basel2001.
Grant D.A.，Hermon-Taylor J.，Biochim.Biophys.Acta 567(1979)，207-15.
Hammond(1999)的″Plant bioechnology；new products andapplications″Eds.Hammond，McGarvey & Yusibov，Springer Verlag，NY1999.
IEX，Principles and Methods Series，nr.18-1114-21-AmershamPharmacia Biotech.
Kalyanpur M.(2000)的″Downstream processing ofproteins″Ed.M.A.DesaiHumana Press N.J.
Paul G.PaulPowell G.的Proteinpurificatioh applications″，Ed.by S.Roe，第二版(2001).
R.K.Scopes R.K.(1993)的″Protein PurificationPrinciples andPractice″3rd ed.Springer-Verlag NY.
Shani等，美国专利6,331,416.
Winterhalter等，(1995)Mol.Microbiol.15(3)，431-444.
序列表<110>ORF Liftaekni hf.
<120>蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法(A PROCESS FOR PROTEOLYTIC CLEAVAGE AND PURIFICATION OF TO PURIFYRECOMBINANT PROTEINS)<130>SCT060873-66<150>6929<151>2003-08-27<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>564<212>DNA<213>Thermotoga maritima<400>1gtggccaccg ccaagtacgg caccccagtg atcgacgggg agatcgacga gatctggaac 60accaccgagg agatcgagac caaggccgtg gccgtgggga gcctcgacaa gaacgccacc120gccaaggtgc gcgtgctctg ggacgagaac tacctctacg tgctcgccat cgtgaaggac180ccagtgctca acaaggacaa cagcaacccc tgggagcaag acagcgtgga gatcttcatc240gacgagaaca accacaagac cggctactac gaggacgacg acgcccaatt ccgcgtgaac300tacatgaacg agcaaacctt cgggaccggc gggagcccag cccgcttcaa gaccgccgtg360aagctcatcg aggggggcta catcgtggag gccgccatca agtggaagac catcaagcca420accccaaaca ccgtgatcgg cttcaacatc caagtgaacg acgccaacga gaaggggcaa480cgcgtgggga tcatcagctg gagcgaccca accaacaaca gctggcgcga cccaagcaag540ttcgggaacc tccgcctcat caag 564<210>2<211>705<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2atcgtcggcg ggagcgattc cagggagggc gcatggccat gggtcgtggc actctacttc 60
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1.纯化目的异源蛋白的方法，包括(a)提供了包含融合于由蛋白水解切割位点截断的CBM的融合蛋白，(b)在促进所述蛋白酶蛋白水解裂解的条件下，将所述融合蛋白与融合于CBM的功能性蛋白酶接触，从目的异源蛋白裂解CBM，(c)在其中CBM-蛋白酶和游离的CBM结合于所述多糖基质且其中目的异源蛋白不保持在所述多糖基质上的条件下，将CBM-蛋白酶，游离的CBM和目的异源蛋白的溶液与多糖基质接触，(d)由多糖基质分离未-结合的目的异源蛋白，(e)用一或多种合适的水溶液冲洗具有结合的CBM-蛋白酶和CBM的多糖基质，(f)通过调整影响所述CBM-蛋白酶由基质释放的条件由基质洗脱CBM-蛋白酶；和(g)任选地复原所述洗脱的CBM-蛋白酶，来保持其与所述多糖基质的亲合性，使得复原的CBM-蛋白酶可再用于随后步骤(a)-(b)方法的重复。
2.权利要求1的方法，其中所述融合于CBM的蛋白酶来自肠激酶，烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶，因子X和凝血酶。
3.权利要求2的方法，其中所述蛋白酶为哺乳动物肠激酶(EK)或其肠激酶活性部分。
4.权利要求3的方法，其中所述EK包括牛EK的催化结构域(EKc)。
5.权利要求4的方法，其中所述牛EKc由SEQ ID NO2所示的核酸序列编码。
6.权利要求1的方法，其中所述融合于CBM的蛋白酶和所述融合于通过蛋白水解切割位点截断的CBM的异源蛋白单独地通过生产和纯化包含纤维素结合组件(CBM)的可溶性异源融合蛋白的方法由表达所述融合蛋白的转基因植物或转基因植物细胞获得，包括步骤(a)破碎转基因植物材料；(b)将提取液体添加于植物材料，由此产生可溶性和不溶性植物材料的混合物，以便由所述破碎的植物材料提取可溶性的融合蛋白至液相中来获得蛋白提取物；(c)由包含所述目的融合蛋白的所述蛋白提取物中分离不溶性植物材料，包括细胞-壁物质和固形物；(d)将所述蛋白提取物与结合于所述融合蛋白的多糖基质接触；(e)用一或多种合适的水溶液冲洗具有结合的融合蛋白的基质，和(f)通过调整影响所述融合蛋白由基质释放的条件由所述多糖基质洗脱融合蛋白。因此获得大体上纯化的可溶性异源融合蛋白。
7.权利要求6的方法，其中分离步骤(c)包括选自膨胀床吸附(EBA)，填充式层析，沉淀，过滤，离心或其任意组合的方法。
8.权利要求6的方法，其中在步骤(d)中亲和性结合于所述多糖基质包括层析步骤。
9.权利要求6的方法，其中步骤(c)和步骤(d)在组合的单一步骤中同时进行。
10.权利要求6的方法，在包括用多糖基质的膨胀床吸附的工艺步骤中将步骤(c)和(d)结合，作为由所述蛋白提取物同时分离细胞-壁物质和固形物以及将所述CBM-融合蛋白亲和结合到多糖基质上的方法。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述多糖基质包括纤维素。
12.权利要求11的方法，其中所述纤维素是药学上相容的纤维素。
13.权利要求12的方法，其中所述纤维素为AvicelTM。
14.权利要求1-12任一项的方法，其中所述洗脱的CBM-蛋白酶的复原包括中和，和/或由CBM-蛋白酶洗脱液中除去影响CBM从所述多糖基质中释放的试剂。
15.权利要求14的方法，其中所述复原包括中和或从洗脱液除去诸如糖的碳水化合物。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中包含所述目的异源蛋白的所述融合蛋白由转基因植物或植物细胞表达和回收或在植物，植物组织或植物细胞中瞬时表达。
17.权利要求16的方法，其中所述转基因植物或植物细胞选自双子叶植物和单子叶植物。
18.权利要求17的方法，其中所述植物细胞或转基因植物选自烟草，油菜籽，大豆，苜蓿，莴苣，大麦，玉米，小麦，燕麦和水稻。
19.权利要求1的方法，其中融合于所述异源蛋白的所述CBM和融合于所述蛋白酶的所述CBM是热稳定的并且在升高的温度下保持可溶性。
20.权利要求19的方法，其中所述CBMs之一或二者是由来自海栖热袍菌的木聚糖酶10A基因的区域编码的CBM。
21.权利要求20的方法，其中所述CBMs之一或二者是由包含序列SEQ ID NO1的序列，或编码相同氨基酸序列的序列，或编码与所述序列具有基本上的序列同一性的氨基酸序列的序列编码。
全文摘要
本发明涉及通过提供适于亲和纯化的融合蛋白的高价值异源蛋白的蛋白纯化的改进方法以及融合蛋白的蛋白水解裂解的改进和经济的方法。这些方法可用于由植物、获自植物的组织或植物细胞大规模生产纯化的重组蛋白。本发明目的在于减少成本和改进在植物及其它生物生产系统产生的异源蛋白的下游加工的质量。
文档编号C12P21/06GK1842600SQ200480024617
公开日2006年10月4日 申请日期2004年8月27日 优先权日2003年8月27日
发明者埃纳尔·门蒂莱, 比约登·拉鲁斯·奥瓦尔 申请人:奥夫莱夫塔埃克尼公司