移植排斥中cd20的检测的制作方法

文档序号:551655阅读:442来源:国知局
专利名称:移植排斥中cd20的检测的制作方法
技术领域
本发明涉及在其样品中检出CD20的患者中治疗移植排斥的方法。
背景技术
淋巴细胞是在造血过程中在骨髓中生成的多种类型白细胞中的一种。有两种主要的淋巴细胞群B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文特别感兴趣的淋巴细胞是B细胞。
B细胞在骨髓中成熟,然后离开骨髓并在它们的细胞表面表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遇到其膜结合抗体对其具有特异性的抗原后,细胞开始快速分裂,且其后代分化成为记忆B细胞和称做“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命,并继续表达与最初的亲代细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体,但改为生成可分泌的抗体形式。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。
CD20抗原(也称做人B淋巴细胞限制分化抗原,Bp35)是位于前B淋巴细胞(pre-B)和成熟B淋巴细胞上、具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白质(Valentine等,J.Biol.Chem.,264(19)11282-11287,1989;和Einfeld等,EMBO J.,7(3)711-717,1988)。该抗原也在超过90%的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等,Blood,63(6)1424-1433,1984),但在造血干细胞、原B细胞(pro-B)、正常浆细胞或其他正常组织上没有发现(Tedder等,J.Immunol.,135(2)973-979,1985)。CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程中的早期步骤(Tedder等,如上所述),并可能作为钙离子通道发挥作用(Tedder等,J.Cell.Biochem.,14D195,1990)。
如果CD20在B细胞淋巴瘤中表达,则该抗原可用做“靶向”这种淋巴瘤的候选者。本质上,这种靶向作用可概括如下对患者施用对B细胞CD20表面抗原特异的抗体,这些抗CD20抗体特异结合正常和恶性B细胞的CD20抗原(在表面上);抗体与CD20表面抗原结合可导致肿瘤B细胞的破坏和消减。此外,可将具有破坏肿瘤潜力的化学试剂或放射性标记物与抗CD20抗体偶联,使得试剂特异“投递”至肿瘤B细胞。不考虑方法,首要目标是破坏肿瘤;具体方法可根据所使用的具体抗CD20抗体来决定,因此可利用的靶向CD20抗原的方法可能变化相当大。
Rituximab(RITUXAN)抗体是针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体。Rituximab是在1998年4月7日批准的美国专利5,736,137中称为“C2B8”的抗体(Anderson等)。RITUXAN指示用于治疗患有复发的或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用机制的体外研究表明RITUXAN结合人补体并通过补体依赖性细胞毒性(CDC)溶解淋巴样B细胞系(Reff等,Blood,83(2)435-445,1994)。此外,它在抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)试验中具有显著活性。最近,RITUXAN在氚标记胸苷掺入试验中显示出具有抗增殖作用,并直接诱导凋亡,而其它抗CD19和CD20抗体不显示这些作用(Maloney等,Blood,88(10)637a,1996)。在试验中还观察到RITUXAN与化学疗法和毒素之间的协同作用。具体地说,RITUXAN可使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对阿霉素、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒性作用敏感(Demidem等,Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals,12(3)177-186,1997)。体内临床前研究显示RITUXAN可能通过补体和细胞介导的作用从猕猴的外周血、淋巴结和骨髓中消减B细胞(Reff等,Blood,83(2)435-445,1994)。
涉及CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利5,776,456、5,736,137、6,399,061和5,843,439,以及美国专利申请US 2002/0197255 A1、US2003/0021781 A1、US 2003/0082172 A1、US 2003/0095963 A1、US2003/0147885 A1(Anderson等);美国专利6,455,043 B1和WO 00/09160(Grillo-Lopez,A.);WO 00/27428(Grillo-Lopez和White);WO 00/27433(Grillo-Lopez和Leonard);WO 00/44788(Braslawsky等);WO 01/10462(Rastetter,W.);WO 01/10461(Rastetter和White);WO 01/10460(White和Grillo-Lopez);美国专利申请US 2002/0006404和WO 02/04021(Hanna和Hariharan);美国专利申请US 2002/0012665 A1和WO 01/74388(Hanna,N.);美国专利申请US 2002/0058029 A1(Hanna,N.);美国专利申请US2003/0103971 A1(Hariharan和Hanna);美国专利申请US 2002/0009444 A1和WO 01/80884(Grillo-Lopez,A.);WO 01/97858(White,C.);美国专利申请US 2002/0128488 A1和WO 02/34790(Reff,M.);WO 02/060955(Braslawsky等);WO 02/096948(Braslawsky等);WO 02/079255(Reff和Davies);美国专利6,171,586 B1和WO 98/56418(Lam等);WO 98/58964(Raju,S.);WO 99/22764(Raju,S.);WO 99/51642、美国专利6,194,551 B1、美国专利6,242,195 B1、美国专利6,528,624 B1和美国专利6,538,124(Idusogie等);WO 00/42072(Presta,L.);WO 00/67796(Curd等);WO 01/03734(Grillo-Lopez等);美国专利申请US 2002/0004587 A1和WO 01/77342(Miller和Presta);美国专利申请US 2002/0197256(Grewal,I.);美国专利申请US 2003/0157108A1(Presta,L.);美国专利6,090,365 B1、6,287,537 B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等);美国专利5,500,362、5,677,180、5,721,108和6,120,767(Robinson等);美国专利6,410,391 B1(Raubitschek等);美国专利6,224,866 B1和WO 00/20864(Barbera-Guillem,E.);WO 01/13945(Barbera-Guillem,E.);WO 00/67795(Goldenberg);美国专利申请US2003/01339301 A1和WO 00/74718(Goldenberg和Hansen);WO 00/76542(Golay等);WO 01/72333(Wolin和Rosenblatt);美国专利6,368,596 B1(Ghetie等);美国专利申请US 2002/0041847 A1(Goldenberg,D.);美国专利申请US 2003/0026801 A1(Weiner和Hartmann);WO 02/102312(Engleman,E.);美国专利申请US 2003/0068664(Albitar等);WO 03/002607(Leung,S.);WO 03/049694和US 2003/0185796 A1(Wolin等);WO03/061694(Sing和Siegall);US 2003/0219818 A1(Bohen等);US2003/0219433 A1和WO 03/068821(Hansen等),上述每一篇文章都清楚地引入本文作为参考。还可见美国专利5,849,898和欧洲专利申请330,191(Seed等);美国专利4,861,579和EP 332,865 A2(Meyer和Weiss);USP 4,861,579(Meyer等)和WO 95/03770(Bhat等)。
涉及用Rituximab进行治疗的出版物包括Perotta和Abuel,″Response ofchronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab″,摘要#3360,Blood,10(1)(1-2部分)88B,1998;Stashi等,″Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopemc purpura″,Blood,98(4)952-957,2001;Matthews,R.,″MedicalHeretics″,New Scientist,2001年4月7日;Leandro等,″Clinical outcome in22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion″,Ann.Rheum.Dis.,61833-888,2002;Leandro等,″Lymphocyte depletion inrheumatoid arthritisearly evidence for safety,efficacy and dose response.″,Arthritis and Rheumatism,44(9)S370,2001;Leandro等,″An open study ofB lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus″,Arthritis &Rheumatism,46(1)2673-2677,2002;Edwards和Cambridge,″Sustainedimprovement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete Blymphocytes″,Rhematology,40205-211,2001;Edwards等,″B-lymphocytedepletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders″,Biochem.Soc.Trans.,30(4)824-828,2002;Edwards等,″Efficacy and safetyof Rituximab,a B-cell targeted chimeric monoclonal antibodyA randomized,placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.″,Arthritis andRheumatism,46(9)S197,2002;Levine和Pestronk,″IgM antibody-relatedpolyneuropathiesB-cell depletion chemotherapy using Rituximab″,Neurology,521701-1704,1999;DeVita等,″Efficacy of selective B cell blockade in thetreatment of rheumatoid arthritis″,Arthritis & Rheum.,462029-2033,2002;Hidashida等,″Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis withrituximab.″,出现在美国风湿病学学会科学年会(Annual Scientific Meeting ofthe American College of Rheumatology),2002年10月24-29日,New Orleans,LA;Tuscano,J.,″Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoidarthritis with rituximab″,出现在美国风湿病学学会科学年会(Annual ScientificMeeting of the American College of Rheumatology),2002年10月24-29日,New Orleans,LA。
Sarwal等,N.Eng.J.Med.,349(2)125-138,2003年7月10日报道了通过DNA微阵识别谱鉴定的急性同种异体肾移植排异中的分子异质性。
发明概述本发明涉及这样一种认识,即可以根据取自患者的样品中存在CD20来选择患有或怀疑患有移植排斥的患者进行治疗。因此,本发明提供了治疗患者的移植排斥的方法,该方法包含(a)对取自患者的样品检测CD20;和(b)如果在该样品中检出CD20,则对该患者施用治疗移植排斥有效量的CD20拮抗剂。
优选实施方案的详细描述I.定义术语“移植”及其变化指将移植物置于宿主体内,不管是同种同基因移植(捐献者和接受者在遗传上相同)、同种异体移植(捐献者和接受者具有不同遗传起源但属于同一物种)、或是异种移植(捐献者和接受者来自不同物种)。由此,在典型的情况中,宿主是人,而移植物是来自具有相同或不同遗传起源的人的同种移植物。在另一种情况中,移植物来自与移植接受者不同的物种,诸如将狒狒的心脏移植给人接受者宿主,而且包括来自在系统发生上相隔很远的物种的动物,例如将猪的心脏瓣膜或者动物的β胰岛细胞或神经细胞移植给人宿主。
术语“移植物”在用于本文时指来自捐献者、用于移植给接受者的生物学物质。移植物包括多种多样的物质,诸如例如分离的细胞,诸如胰岛细胞;组织,诸如新生儿的羊膜、骨髓、造血前体细胞、和眼组织诸如角膜组织;及器官,诸如皮肤、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺叶、肺、肾脏、管状器官(如肠道、血管或食管),等等。管状器官可用于替换食管、血管或胆管的受损部分。皮肤移植物不仅可用于烧伤,还可用作受损肠道的敷料或用于使某些缺损诸如隔疝闭合。移植物可来自任何哺乳动物来源,包括人,无论生死。优选的是,移植物是骨髓或诸如心脏等器官,而且移植物的捐献者和宿主在II型HLA抗原方面是匹配的。
术语“哺乳动物宿主”在用于本文时指任何相容的移植接受者。“相容的”是指哺乳动物宿主将会接受捐献的移植物。优选的是,宿主是人。如果移植物的捐献者和宿主都是人,那么为了提高组织相容性,优选的是,他们在II型HLA抗原方面是匹配的。
术语“捐献者”在用于本文时指提供移植物的哺乳动物,无论生死。优选的是,捐献者是人。优选的是,人捐献者是具有血缘关系的自愿捐献者,他们体检正常且属于相同的主要ABO血型,因为跨越主要血型屏障可能不利于同种异体移植物的存活。但是,有可能例如将O型捐献者的肾脏移植给A、B或AB型接受者。
“B细胞”是在骨髓中成熟的淋巴细胞,包括幼稚B细胞、记忆B细胞或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的B细胞。
“CD20”抗原是在超过90%来自外周血或淋巴器官的B细胞表面发现的一种约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育过程中表达,并保持到浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。例如,Clark等,PNAS(USA),821766,1985中描述了CD20抗原。
“检测CD20”是指评估样品是否含有CD20。通常检测CD20蛋白质,但是检测CD20核酸也包含在本文这一短语中。
本文中“CD20核酸”指编码至少部分CD20蛋白质的核酸,包括mRNA和DNA,和/或互补核酸。
“CD20阳性B细胞”指通常在其细胞表面表达CD20的B细胞。
“致病性”细胞指引起疾病或异常且可能存在于患病组织或细胞中间或周围的细胞。
“拮抗剂”指在结合B细胞上的CD20后破坏或消减哺乳动物B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能(例如通过减少或阻止由B细胞引发的体液反应)的分子。优选的是,拮抗剂能够在用其治疗的哺乳动物中消减B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种消减可通过各种机制来实现,诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。本发明范围内的拮抗剂包括抗体、合成或天然序列肽、以及与CD20结合的小分子拮抗剂,任选与细胞毒性剂偶联或融合。优选的拮抗剂包括抗体。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体,随后促使靶细胞溶解。介导ADCC的初级细胞NK细胞只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9457-92,1991中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于这些测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes等,PNAS(USA),95652-656,1998中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。优选的是,该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞;优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且,优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体),包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于它们的胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(见Daron,Annu.Rev.Immunol.,15203-234,1997)。FcR的综述见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9457-492,1991;Capel等,Immunomethods,425-34,1994;和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.,126330-341,1995。本文中术语“FcR”涵盖其它FcR,包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn,它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等,J.Immunol.,117587,1976和Kim等,J.Immunol.,24249,1994)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体的情况下分子溶解靶细胞的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods,202163,1996中所描述的。
“生长抑制性”拮抗剂指那些阻止或减少表达与拮抗剂结合的抗原的细胞增殖的拮抗剂。例如,拮抗剂可在体外和/或在体内阻止或减少B细胞增殖。
“诱导凋亡”的拮抗剂指根据标准凋亡测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定,诱导例如B细胞的程序性细胞死亡的拮抗剂。
本文中术语“抗体”使用其最广泛的含义,具体覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、以及抗体片段,只要它们显示所需生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
为了本文的目的,“完整抗体”指包含重链和轻链可变区以及Fc区的抗体。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的分子量为约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键的数目在具有不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(VH),接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL),而另一端是一个恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起,而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成了界面。
术语“可变”指可变区中的某些部分在不同抗体的序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区都包含四个FR,它们大多采取β-折叠构象,通过形成环状连接的三个高变区连接,而且在某些情况中形成部分β-折叠结构。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起,并与其它链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等,《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合,但显示出多种效应子功能,诸如抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,各自具有一个抗原结合位点,和一个残余“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段,它具有两个抗原结合位点,并且还能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中,各个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的,在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”,根据其恒定区的氨基酸序列,可归入两种截然不同类型中的一种(分型),称作κ和λ。
根据其重链恒定区的氨基酸序列,可将抗体归入不同的类别(分类)。完整抗体有五种主要的类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。各种类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是,该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头,使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun,《(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,269-315,1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使结构域与另一条链的互补结构域配对,并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097;WO 93/11161;和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,906444-6448,1993。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由基本上同质的抗体群获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位,除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体外,这种变体通常以极少量存在。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同,每个单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性以外,单克隆抗体的优越性体现在它们未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征,并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如,依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等,Nature,256495,1975描述的杂交瘤方法来制备,或者通过重组DNA方法来制备(见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等,Nature,352624-628,1991和Marks等,J.Mol.Biol.,222581-597,1991中描述的技术由噬菌体抗体库分离。
本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及这种抗体的片段,只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利4,816,567;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,816851-6855,1984)。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey),诸如狒狒、恒河猴或恒河猴)的可变区抗原结合序列以及人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基(供体抗体)替换的免疫球蛋白。在某些情况中,将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。而且,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常,人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个这样的可变区,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR,除了上文所述的FR替代。任选的是,人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区,通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,Nature,321522-525,1986;Riechmann等,Nature,332323-329,1988;和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2593-596,1992。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等,《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196901-917,1987)。“框架”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
结合CD20抗原的抗体的例子包括现在称作“Rituximab”(“RITUXAN”)的“C2B8”(美国专利5,736,137,明确引入本文作为参考);称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN的钇[90]标记2B8鼠抗体(美国专利5,736,137,明确引入本文作为参考);鼠IgG2a“B1”,也称作“Tositumomab”,任选用131I标记以产生“131I-B1”抗体(碘I131 Tositumomab,BEXXARTM)(美国专利5,595,721,明确引入本文作为参考);鼠单克隆抗体“1F5″(Press等,Blood,69(2)584-591,1987和“框架修补”或人源化1F5(WO 03/002607,Leung,S.);ATCC保藏物HB-96450);鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180,明确引入本文作为参考);人源化2H7;huMax-CD20(Genmab,丹麦);AME-133(Applied Molecular Evolution);和可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等,《LeukocyteTyping III》,McMichael编,第440页,牛津大学出版社,1987)。
本文中术语“Rituximab”或“RITUXAN”指针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体,在美国专利5,736,137(明确引入本文作为参考)中称作“C2B8”,包括该抗体保持结合CD20能力的片段。
纯粹为了本发明的目的,“人源化2H7”指包含如下可变轻链序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKR(SEQ ID NO1);和如下可变重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO2)的完整抗体或抗体片段。
当人源化2H7抗体是完整抗体时,优选的是它包含如下轻链氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO3);和如下重链氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO4)。
“分离的”拮抗剂指由其天然环境的成分鉴别、分离和/或回收的拮抗剂。其天然环境的污染成分指将会干扰拮抗剂的诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,将拮抗剂纯化至(1)根据Lowry方法的测定,拮抗剂重量超过95%,最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式蛋白质测序仪获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列的程度,或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染色的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到同质。既然拮抗剂的天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂。然而,通常,分离的拮抗剂将通过至少一个纯化步骤来制备。
本文中的“患者”指人类患者。
“治疗”指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的人包括已经具有紊乱的人以及要预防紊乱的人。因此,治疗可以是治疗和/或预防移植排斥。
表述“有效量”指有效预防、改善或治疗所讨论紊乱(移植排斥)的拮抗剂数量。
术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助治疗时指承担抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。这种试剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077,本文引用其公开书作为参考);非类固醇抗炎药(NSAID);咪唑硫嘌呤(azathioprine);环磷酰胺;溴隐亭(bromocryptine);达扎唑(danazol);氨苯砜(dapsone);戊二醛(如美国专利4,120,649中所述,它掩盖MHC抗原);针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体;环孢菌素A;类固醇,诸如糖皮质类固醇,如强的松(prednisone)、甲基强的松龙和地塞米松;甲氨蝶呤(口服或皮下);hydroxycloroquine;柳氮磺吡啶(sulfasalazine);来氟米特(leflunomide);细胞因子或细胞因子受体拮抗剂,包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体;抗LFA-1抗体,包括抗CD11a和抗CD18抗体;抗L3T4抗体;异源抗淋巴细胞球蛋白;泛T抗体(pan-T antibodies),优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO 90/08187);链激酶;TGF-β;链道酶;来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T细胞受体(Cohen等,美国专利5,114,721);T细胞受体片段(Offner等,Science,251430-432,1991;WO 90/11294;Ianeway,Nature,341482,1989;和WO 91/01133);和T细胞受体抗体(EP 340,109),诸如T10B9。
术语“细胞毒性剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或促使细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂,诸如噻替哌(thiotepa)和环膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯,诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类,诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa);乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogen mustards),诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥;硝基脲类(nitrosureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素,诸如阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物,诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU;雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸;醋葡内酯;醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基酮戊酸(aminolevulinic acid);氨苯吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);磷胺氮芥(defofamine);秋水仙胺;地吖醌(diaziquone);依洛尼塞(elfomithine);醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲;香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲兰(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸;三亚胺醌;2,2′,2″-三氯三乙胺;乌拉坦(urethan);长春碱酰胺(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥;二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇;哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(″Ara-C″);环磷酰胺;塞替哌(thiotepa);类紫杉醇类(taxoid),如紫杉醇paclitaxel(TAXOL,Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,NJ)和doxetaxel(TAXOTERE,Rhne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;氨甲蝶呤;铂类似物,诸如顺铂和卡铂;长春碱;铂;鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16);异磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞宾(vinorelbine);诺维本(navelbine);诺安托(novantrone);替尼泊甙(teniposide);柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达(xeloda);伊拜膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);维A酸;esperamicins;卡培他滨(capecitabine);以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括承担调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,诸如抗雌激素类,包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(Fareston);以及抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这种细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。生长激素也包括在细胞因子中,诸如人生长激素、N-甲二磺酰人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松驰素;松驰素原;糖蛋白激素类,诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体(生成)激素(LH);肝细胞生长因子;成纤维细胞生长因子;促乳素;胎盘催乳激素;肿瘤坏死因子-α和-β;Mullerian氏抑制性物质(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素(activin);血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素(TPO);神经生长因子,诸如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGF),诸如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductive factor);干扰素,诸如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL),诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;肿瘤坏死因子,诸如TNF-α或TNF-β;和其它多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体和衍生物形式药物活性物质。参见如Wilman,″Prodrugs in Cancer Chemotherapy″,Biochemical Society Transactions,14,375-382,615th Meeting Belfast,1986和Stella等,″ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery″,Directed Drug Delivery,Borchardt等编,247-267,Humana Press,1985。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐(酯)前体药物、含硫代磷酸盐(酯)前体药物、含硫酸盐(酯)前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“B细胞恶性肿瘤”指涉及B细胞的恶性肿瘤。例子包括何杰金氏病,包括淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤;急性淋巴细胞性白血病(ALL);慢性淋巴细胞性白血病(CLL);毛细胞白血病;类浆细胞淋巴细胞性淋巴瘤;套细胞淋巴瘤;AIDS或HIV相关淋巴瘤;多发性骨髓瘤;中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;移植后淋巴增殖紊乱(PTLD);Waldenstrom氏巨球蛋白血症(淋巴浆细胞性淋巴瘤);粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤;和边缘区淋巴瘤/白血病。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)包括但不限于低级/滤泡NHL、复发或难治的NHL、前线低级NHL、阶段III/IV NHL、化疗耐受性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥漫性NHL、弥漫性大细胞淋巴瘤、攻击性(aggressive)NHL(包括攻击性前线NHL(front-line NHL)和攻击性复发NHL)、自体干细胞移植后复发或难治的NHL、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小非分裂细胞NHL、bulky病NHL等。
II.检测CD20本发明提供了在取自患者的样品中检出CD20的患者中治疗移植排斥的方法。根据本方法,从患者获取生物学样品,并进行分析以评估样品中是否存在CD20(蛋白质、DNA、RNA)。可在移植之前、之中或之后从移植接受者(或移植捐献者)获取样品。通常,在移植前从接受者的器官或细胞获取样品,例如在移植的是肺移植物时,在移植前从接受者的肺采集样品。或者/另外,在移植后,采集移植物的一份或多份额外样品(例如活组织检查),并测试其中是否存在CD20。优选的是,评估(致病性)CD20阳性B细胞的存在,但是本文设想检测非细胞抗原,例如循环CD20或其片段。如果检出CD20,则决定患者适于用CD20拮抗剂进行治疗。
可通过各种方法来检测CD20,包括免疫组织化学(IHC)、免疫染色、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫沉淀、蛋白质印迹、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵等。在优选的实施方案中,以合适的测定法形式,优选免疫组织化学法,使用与CD20蛋白结合的抗体或其它配体检测CD20蛋白的存在。然而,本发明特别希望例如通过基因概况分析、FISH或其它方法分析所测样品中的CD20核酸,包括DNA和RNA,从而测定CD20的上调或CD20产量的增加。
可利用结合CD20的各种抗体检测CD20抗原,包括例如C2B8、2B8、B1、1F5、2H7、huMax-CD20、AME-133、L27、G28-2、93-lB3、B-C1或NU-B2、可从Abcam Ltd购得的抗体(小鼠单克隆MEM-97、小鼠单克隆L26、山羊多克隆MS4A1、小鼠单克隆BCA-B/20)等。
本文中测试的生物学样品由待治疗的状况来决定。例如,在实体器官移植排斥的情况中,可以在移植之前和/或之后测试来自接受者和/或捐献者的所讨论器官的活组织检查(例如肺、心脏或肝脏活组织检查)。该样品可以是冷冻的、新鲜的、固定的(例如福尔马林固定的)、离心的和/或包埋的(例如石蜡包埋的)等等。
绝大多数免疫组织化学方法采用细胞或组织固定步骤,该步骤使用甲醛或其它交联固定剂,然后与一抗一起保温。可通过固定保持组织形态,并防止组织抗原降解。可通过将组织切片(例如人活组织检查)浸没于固定剂中来进行固定。由于固定不足或固定过度可降低或消除组织免疫反应性,因此需要将固定条件最佳化。校正固定不足的最简单方法是将组织切片在载玻片上后固定(post-fit),然后再开始免疫组织化学染色。为了恢复固定过度组织中的抗原,推荐使用蛋白酶诱导表位修复(PIER)或热诱导表位修复(HIER)技术。HIER可使用微波炉、高压锅、蔬菜蒸锅、高压灭菌器或水浴来进行。组织固定后,将它们用石蜡包埋或用OCT化合物覆盖,并冷冻用于进一步切片。石蜡包埋的组织可于室温使用切片机切片,而冷冻的组织可于低于0℃的温度使用恒冷切片机切片。发现冷冻的比石蜡包埋的组织对抗原免疫活性的保存更好(Larsson,L.,《ImmunocytochemistryTheory and Practice》,CRC Press,Boca Raton,Florida,1988;和Frost,A.等,Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.,8236,2000)。
如果检测测定法是免疫组织化学法,则可依照制造商的说明书将样品暴露于结合CD20的“一抗”。洗涤后,将样品暴露于“二抗”,它通常与可检测标记物诸如生物素等偶联。再次洗涤后,可依照众所周知的方法检测标记物。
如果发现样品中存在CD20,则确定从其获取样品的患者作为用本文公开的CD20拮抗剂进行治疗的候选者。用于生成CD20拮抗剂的方法描述如下。
III.拮抗剂的生产本发明的方法和产品使用或掺入与CD20结合的拮抗剂。因此,本文将描述用于生成这些拮抗剂的方法。
用于生成或筛选拮抗剂的CD20抗原可以是例如包含所需表位的CD20或其部分的可溶形式。或者/另外,在其表面表达CD20的细胞也可用于生成或筛选拮抗剂。可用于生成拮抗剂的其它形式的CD20对本领域熟练技术人员是显而易见的。
虽然优选的拮抗剂是抗体,本文还考虑了除抗体外的拮抗剂。例如拮抗剂可包括任选融合或偶联了细胞毒性剂(诸如本文描述的那些)的小分子拮抗剂。可针对本文感兴趣的CD20抗原筛选小分子文库,以鉴定与该抗原结合的小分子。还可对小分子筛选其拮抗特性和/或与细胞毒性剂偶联。
拮抗剂还可以是通过理性设计或通过噬菌体展示产生的肽(见例如1998年8月13日出版的WO 98/35036)。在一个实施方案中,选择的分子可以是根据抗体的CDR设计的“CDR模拟物”或抗体类似物。虽然这些肽自身可具有拮抗性,但任选可将该肽与细胞毒性剂融合,以增加或增强肽的拮抗特性。
下面的描述例示了用于生产依照本发明使用的抗体拮抗剂的方法。
(i)多克隆抗体多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生剂,例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR,其中R和R1是不同的烃基,将相关抗原与在免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的,例如匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和,并将溶液皮内注射于多个部位,由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后,通过多个部位的皮下注射,用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行加强。7-14天后,采集动物的血液,并测定血清的抗体效价。对动物进行强化直到效价达到稳定。优选的是,将动物用相同抗原的但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行强化。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。此外,适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫反应。
(ii)单克隆抗体单克隆抗体是由基本上同质的抗体群获得的,即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位,除了在生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体外,这种变体通常以很少量存在。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征即不是分立的或多克隆的抗体的混合物。
例如,单克隆抗体可通过最初由Kohler等,Nature,256495,1975描述的杂交瘤方法来制备,或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中,如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物,诸如仓鼠,以激发生成或能够生成与用于免疫的蛋白质特异结合的抗体的淋巴细胞。或者,可在体外免疫淋巴细胞。然后,使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞(Goding,《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》,59-103,Academic Press,1986)。
将这样制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养,该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如,如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则杂交瘤培养基通常将含有阻止缺乏HGPRT的细胞生长的次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(HAT培养基)。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系,诸如可从Salk Institute CellDistribution Center,San Diege,Califomia USA购得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系,以及可从American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA购得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.,1333001,1984;Brodeur等,《Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications》,51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
可对杂交瘤细胞正在生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是,通过免疫沉淀或通过体外结合测定法,诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.,107220,1980的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆,并使用标准方法进行培养(Goding,《(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》,59-103,Academic Press,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化法,诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析,将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分离。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规方法分离并测序(例如使用能够特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离,可将DNA置于表达载体中,然后将该表达载体转染到宿主细胞中,诸如不另外产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5256-262,1993和Plückthun,Immunol.Revs.,130151-188,1992。
在另一个实施方案中,可从使用McCafferty等,Nature,348552-554,1990中描述的技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature,352624-628,1991和Marks等,J.Mol.Biol.,222581-597,1991分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等,Bio/Technology,10779-783,1992),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.,212265-2266,1993),生成高亲和力(nM范围)的人抗体。因此,这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术来的可行替换方法。
还可以修饰DNA,例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠序列(美国专利4,816,567;Morrison等,Proc.NatlAcad.Sci.USA,816851,1984),或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。
通常,用这种非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区,或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区,产生嵌合二价抗体,它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是,人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基,它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones等,Nature,321522-525,1986;Riechmann等,Nature,332323-327,1988;Verhoeyen等,Science,2391534-1536,1988),通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此,这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567),其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中,人源化抗体通常是人抗体,其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基所替代。
用于制备人源化抗体的人可变区的选择,包括轻链和重链,对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法,用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等,J.Immunol.,1512296,1993;Chothia等,J.Mol.Biol.,196901,1987)。另一种方法使用由特定轻链或重链可变区亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定构架区。同一构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,894285,1992;Presta等,J.Immunol.,1512623,1993)。
更为重要的是,抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的,依照一种优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型,且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样,可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合,从而获得所需抗体特征,诸如对靶抗原的亲和力提高。通常,高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
(iv)人抗体作为人源化的替代方法,可生成人抗体。例如,现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如,已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,902551,1993;Jakobovits等,Nature,362255-258,1993;Bruggermann等,Year in Immuno.,733,1993;和美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者,噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature,348552-553,1990)可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这一技术,将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中,并在噬菌体颗粒表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝,以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码显示那些特性的抗体基因的选择。因此,噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行;有关综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinionin Structural Biology,3564-571,1993。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature,352624-628,1991从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks等,J.Mol.Biol.,222581-597,1991或Griffith等,EMBO J.,12725-734,1993描述的技术,由未免疫人供体构建V基因全集,并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。
还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
(v)抗体片段已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上,通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysical Methods,24107-117,1992和Brennan等,Science,22981,1985)。然而,现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如,可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者,可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段,并通过化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等,Bio/Technology,10163-167,1992)。依照另一种方法,可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练技术人员是显而易见的。在其它实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利5,571,894和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”,例如美国专利5,641,870中描述的抗体。这种线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20抗原的两种不同表位。其它这种抗体可结合CD20并进一步结合第二种B细胞表面标志物。或者,抗CD20结合臂可与结合白细胞上引发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR),诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合,使得细胞防御机制集中于B细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂定位于B细胞。这些抗体拥有CD20结合臂以及结合细胞毒性剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规生成是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中两种链具有不同的特异性(Millstein等,Nature,305537-539,1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些四源杂交瘤(quadromas)生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化非常麻烦,且产量低。WO 93/08829和Traunecker等,EMBO J.,103655-3659,1991中公开了类似的方法。
根据一种不同的方法,将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是,在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必须的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及,如果需要,免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体,并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中,这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而,在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时,有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。
在本方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链,和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径,因此发现这种不对称结构促进所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于制备双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等,Methods inEnzymology,121210,1986。
根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法,可改造抗体分子对之间的界面,将从重组细胞培养物中回收的异型二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3抗体恒定区。在该方法中,将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链替换(例如酪氨酸或色氨酸)。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链,在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了相对于其它不想要的终产物诸如同型二聚体提高异型二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如,异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联,另一种抗体与生物素偶联。例如,这种抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980),和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域所熟知的,并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980中。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如,可使用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等,Science,22981,1985描述了通过蛋白水解切割完整抗体生成F(ab′)2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的条件下还原,以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇,并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合,形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如,已使用亮氨酸拉链生产出双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.,148(5)1547-1553,1992。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原,形成单体,然后重新氧化,形成抗体异型二聚体。这种方法也可用于生产抗体同型二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,906444-6448,1993描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),该接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此,迫使一个片段上的VH和VL区不得不与另一个片段上的互补VL和VH区配对,由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.,1525368,1994。
希望得到具有超过两个效价的抗体。例如,可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.,14760,1991。
IV.拮抗剂的偶联物和其它修饰任选将本发明的方法中所使用的或本发明的产品中所包含的拮抗剂与细胞毒性剂偶联。
上文已经描述了可用于生成这种拮抗剂-细胞毒性剂偶联物的化疗剂。
本发明还希望得到拮抗剂与一种或多种小分子毒素形成的偶联物,诸如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢菌毒素和CC1065。在本发明的一个实施方案中,将拮抗剂与一个和多个美登素分子偶联(例如每个拮抗剂分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转化为May-SS-Me,后者可还原为May-SH3并与经修饰拮抗剂反应(Chari等,Cancer Research,52127-131,1992)产生美登木素生物碱-拮抗剂偶联物。
或者,将拮抗剂与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等,Cancer Research,533336-3342,1993和Lode等,Cancer Research,582925-2928,1998)。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素。还可参见例如1993年10月28日出版的WO 93/21232。
本发明还希望得到与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶和DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶;DNA酶)偶联的拮抗剂。
有多种放射性同位素可用于生成放射性偶联拮抗剂。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备拮抗剂和细胞毒性剂的偶联物,诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,可如Vitetta等,Science,2381098,1987中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与拮抗剂偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research,52127-131,1992)。
或者,可例如通过重组技术或肽合成法来制备包含拮抗剂和细胞毒性剂的融合蛋白。
在另一个实施方案中,可以将拮抗剂与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联,用于肿瘤的预定位,其中对患者施用拮抗剂-受体偶联物,随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物,然后施用与细胞毒性剂(例如放射性核苷)偶联的“配体”(例如生物素)。
还可将本发明的拮抗剂与前体药物活化酶偶联,后者将前体药物(例如肽基化疗剂,参见WO 81/01145)转化为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。
这种偶联物的酶成分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转化为更具有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶;可将含硫酸盐的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶;将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶;可将含肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶,诸如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L);可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶;可将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物切割酶类诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶;可将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶;可将在氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者,可使用具有酶活性的抗体,本领域也称作“抗体酶”,将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(参见例如Massey,Nature,328457-458,1987)。可如本文所述制备拮抗剂-抗体酶偶联物,用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与拮抗剂共价结合,诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者,可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明拮抗剂的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger等,Nature,312604-608,1984)。
本文还设想了拮抗剂的其它修饰。例如,可将拮抗剂与多种非蛋白质聚合物中的一种连接,例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体片段,诸如与一个和多个PEG分子连接的Fab’是本发明尤其优选的实施方案。
本发明公开的拮抗剂还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法制备包含拮抗剂的脂质体,诸如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,823688,1985;Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,774030,1980;美国专利4,485,045和4,544,545;和1997年10月23日出版的WO 97/38731中所述。美国专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器,产生具有所需直径的脂质体。可如Martin等,J.Biol.Chem.,257286-288,1982中所述,将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等,J.NationalCancer Inst.,81(19)1484,1989。
设想了本文描述的蛋白质或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如,可能需要改进拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入拮抗剂核酸或通过肽合成法来制备拮抗剂的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如拮抗剂氨基酸序列中的残基删除、和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性,可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可能改变拮抗剂的翻译后加工,诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定拮抗剂中作为优选突变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描突变”,由Cunningham和Wells,Science,2441081-1085,1989描述。这里鉴定了一个或一组靶残基(例如带电荷的残基,诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸),并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选的是丙氨酸或聚丙氨酸)替代,以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体,推敲对替代显示功能敏感性的氨基酸位置。这样,虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的,但是突变本身的性质不需要预先决定。例如,为了分析在指定位点处的突变的后果,在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变,并对表达的拮抗剂变体筛选所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合,长度范围从一个残基到包含上百或更多残基的多肽,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括在拮抗剂N-或C-末端融合酶或提高拮抗剂的血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在拮抗剂分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最感兴趣在抗体拮抗剂中进行替代诱变的位点包括高变区,但也考虑了FR改变。保守替代在表1中显示为“优选替代”。如果这些替代导致生物学活性的改变,那么可以引入表1中称为“例示取代”的更实质性改变,或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述,并筛选产物。
表1

对拮抗剂生物学特性的实质性修饰可通过选择在保持(a)替代区域的多肽主链的结构,例如作为折叠片或螺旋构象,(b)靶位点处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积这几方面的效果上显著不同的替代来完成。根据共有的侧链特性,将天然存在的残基分为以下各组(1)疏水性的正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸;(2)中性亲水性的半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸;(3)酸性的天冬氨酸、谷氨酸;
(4)碱性的天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸;(5)影响链取向的残基甘氨酸、脯氨酸;和(6)芳香族的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守替代需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。
任何不涉及保持拮抗剂正确构象的半胱氨酸残基也可替代,通常用丝氨酸,以改进分子的氧化稳定性和预防异常交联。相反地,可向拮抗剂中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当拮抗剂是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。通常,选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生这些替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之,将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变,在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上,作为与各个颗粒内包装的M13基因III的产物的融合体。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选它们的生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点,可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外,分析抗原-抗体复合物的晶体结构,以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。这些接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这种变体,如本文所述筛选该组变体,可选择在一种或多种相关试验中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
拮抗剂的另一类氨基酸变体改变了拮抗剂的原始糖基化样式。这种改变包括删除在拮抗剂中发现的一个或多个糖类模块,和/或添加拮抗剂中不存在的一个或多个糖基化位点。
多肽的糖基化典型的是N-连接的或O-连接的。N-连接是指糖类模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将糖类模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。这样,多肽中这两种三肽序列其中任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸,最常见的是丝氨酸或苏氨酸,但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向拮抗剂中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上文描述的三肽序列便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向原始拮抗剂序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
在抗体包含Fc区时,可改变附着其上的糖类。例如,美国专利申请US2003/0157108 A1,Presta,L中描述了具有成熟糖类结构的抗体,该结构缺乏附着于抗体Fc区的岩藻糖。WO 03/011878,Jean-Mairet和美国专利6,602,684,Umana等中提到了在附着于抗体Fc区的糖类中具有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087,Patel等中报告了在附着于抗体Fc区的低聚糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。关于具有附着于其Fc区的更改糖类的抗体参见WO 98/58964(Raju,S.)和WO 99/22764(Raju,S.)。
编码拮抗剂氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中),或者通过对早期制备的变体或非变体形式拮抗剂进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能需要在效应子功能方面修饰本发明拮抗剂,例如增强拮抗剂的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体拮抗剂的Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外,可在Fc区中引入半胱氨酸残基,从而使得在该区域中形成链间二硫键。这样产生的同型二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp.Med.,1761191-1195,1992和Shopes,B.,J.Immunol.,1482918-2922,1992。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体还可使用如Wolff等,CancerResearch,532560-2565,1993中描述的异双功能交联剂制备。或者,抗体可改造成具有双重Fc区,并因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design,3219-230,1989。WO 00/42072(Presta,L)描述了在存在人效应细胞的条件下具有改善的ADCC功能的抗体,其中抗体在其Fc区中具有氨基酸替代。
WO 99/51642、美国专利6,194,551 B1、美国专利6,242,195 B1、美国专利6,528,624 B1和美国专利6,538,124(Idusogie等)中描述了具有改变的C1q结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。这些抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334其中一个和多个具有氨基酸替代。
为了提高拮抗剂的血清半衰期,可如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入拮抗剂(尤其是抗体片段)。如本文所使用的,术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。WO 00/42072(Presta,L)中也描述了在其Fc区中具有氨基酸替代且具有提高的血清半衰期的抗体。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的改造抗体(美国专利申请US2002/0004587 A1,Miller等)。
V.药物制剂制备依照本发明使用的拮抗剂的治疗用制剂,即将具有所需纯化程度的拮抗剂与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》,第16版,Osol,A.编,1980),以冻干制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,还包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化乙烷双胺;苯扎氯铵、苯索氯铵;酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐相反离子,诸如钠;金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物);和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性抗CD20抗体制剂描述于WO 98/56418,明确引入本文作为参考。该出版物描述了一种液体多剂量制剂,该制剂包含40mg/mL Rituximab、25mM醋酸盐、150mM海藻糖、0.9%苯甲醇、0.02%聚山梨醇酯20,pH 5.0,它在2-8℃具有最少2年的储存保存期。另一种感兴趣的抗CD20制剂在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水合柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨醇酯80、和注射用无菌水、pH 6.5中包含10mg/mL Rituximab。
适于皮下施用的冻干制剂描述于美国专利6,267,958(Andya等)。这种冻干制剂可用合适的稀释液复水成为高蛋白浓度,且复水后的制剂可皮下施用于本发明所治疗的哺乳动物。
本发明制剂还可包含所治疗具体适应症所需的超过一种活性化合物,优选的是那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如,可能还需要提供细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的免疫抑制剂,诸如环孢霉素或结合T细胞的抗体,例如结合LFA-1的抗体)。所述其它试剂的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量、疾病或紊乱或治疗的类型、以及上文讨论的其它因素。这些通常以与上文所用相同的剂量和施药途径使用,或是迄今所用剂量的约1-99%。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如分别在胶状药物传递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于《Remington′s PharmaceuticalSciences》第16版,Osol,A.编,1980。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
VI.用拮抗剂进行治疗结合CD20的拮抗剂可用于治疗(这种治疗包括预防)患者的移植排斥,包括急性和慢性排斥。优选的是,所述患者没有患上B细胞恶性肿瘤且拮抗剂包括抗CD20抗体。一个实施方案中的抗体未与细胞毒性剂偶联,另一个实施方案中的抗体则已与细胞毒性剂偶联(例如Y2B8或131I-B1)。
结合CD20的拮抗剂因此可用于治疗哺乳动物的移植物抗宿主或宿主抗移植物疾病和/或使等待移植的哺乳动物脱敏。
对于本发明公开的各种适应症,包含结合CD20抗原的拮抗剂的组合物将以与优良医学实践相一致的形式进行配制、服用和施用。在此内容中考虑的因素包括治疗的具体疾病或紊乱、治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、疾病或紊乱的起因、药剂的投递部位、施药方法、施药方案以及医学从业人员知道的其它因素。施用拮抗剂的治疗有效量将由这些考虑事项决定。
作为一般性建议,肠胃外施用拮抗剂的每剂有效量范围为约20mg/m2至10,000mg/m2患者身体,通过一个或多个剂量。完整抗体的例示性静脉内剂量方案包括375mg/m2每周×4、1000mg×2(例如在第1天和第15天)、或1g×3。
如上所述,然而,拮抗剂的这些建议量受到大量治疗学判断的支配。在选择适当剂量和方案中的关键因素是如上所示获得的结果。例如,对于治疗发展中的和急性的疾病最初可能需要相对较高的剂量。为了获得最有效的结果,根据疾病或紊乱,应尽可能地在接近疾病或紊乱的最初征兆、诊断、表现、或发生时,或者在疾病或紊乱的消除过程中施用拮抗剂。
可通过任何合适的手段施用拮抗剂,包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内,如果需要局部免疫抑制处理,则还有伤口内施药。肠胃外输液包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施药。另外,拮抗剂可适当地通过脉动输液施用,例如用下降剂量的拮抗剂。优选通过注射给药,最优选静脉内或皮下注射,这部分取决于施药是短时间的还是长时间的。
可与本发明的拮抗剂一起施用其它化合物,诸如细胞毒性剂、化疗剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。联合施用包括使用分开的制剂或单一的药物制剂的共施用,以及以任一次序依序施用,其中优选地是有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物学活性。
除对患者施用蛋白质拮抗剂外,本申请设想通过基因疗法来施用拮抗剂。这种编码拮抗剂的核酸的施用涵盖在表述“施用有效量的拮抗剂”中。关于使用基因疗法产生细胞内抗体参见例如1996年3月14日出版的WO96/07321。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者细胞,即体内和离体。对于体内投递,通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射到患者体内。对于离体治疗,采集患者细胞,将核酸导入这些分离的细胞,并将经过修饰的细胞或者直接施用于患者,或者例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于离体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂类的系统(可用于脂类介导的基因转移的脂类有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中,需要提供具有靶向靶细胞的试剂的核酸源,诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时,与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入,例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu等,J.Biol.Chem.,2624429-4432,1987和Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,873410-3414,1990中描述了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson等,Science,256808-813,1992。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。
VII.产品在本发明的另一个实施方案中,提供了装有可用于治疗上文所述疾病或状况的物质的产品。该产品包括容器以及该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。该容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有有效治疗选定疾病或状况的组合物,并可具有无菌存取口(例如该容器可以是具有皮下注射器针头可刺穿的塞子的静脉内溶液包或小管)。该组合物中的至少一种活性剂是结合CD20的拮抗剂。标签或包装插页表明该组合物用于治疗移植排斥,并且还指示根据其样品中存在CD20来选择患者进行治疗。该产品还可包括第二容器,该容器装有制药学可接受的稀释缓冲液,诸如注射用制菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。该产品还可包括商业和使用者立场上所需的其它物质,包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下面的非限制性实施例阐明了本发明的更多细节。将说明书中所有引用的公开内容明确引入本文作为参考。
实施例1肺移植(阻塞性细支气管炎综合征)在肺移植前从肺移植接受者取得肺活组织检查。可用公知的方法冷冻或固定活组织检查样品。通过免疫组织化学(IHC)使用CD20抗体,诸如结合CD20的L26(Abcam Ltd),依照生产商的说明书来评估样品中致病性CD20阳性B细胞的存在。如果在活组织检查中发现浸润型CD20阳性B细胞时,则通过在肺移植之前、同时、或之后以每周375mg/m2×4、1000mg×2(在第1和15天)、或1g×3服用Rituximab或人源化2H7来治疗所述患者。CD20抗体可与一种或多种其他免疫抑制剂联合,包括定向T细胞的试剂诸如环孢菌素、皮质类固醇、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、抗IL2受体抗体(ZENAPAX)、多克隆抗淋巴细胞抗体、抗CD3抗体、钙依赖磷酸酶抑制剂(例如他克莫司(Tacrolimus))、抗增殖剂(如硫唑嘌呤(Azathioprine)、来氟洛米(Leflunomide)或西罗莫司(Sirolimus))、LFA-1抗体(RAPTIVA)等。
对于在取自患者的样品中存在CD20阳性B细胞的患者进行处理,将预防或治疗对所移植肺的排斥。
移植后,定时采集所移植肺的活组织检查样本,并如上所述测试CD20的存在。如果这种分析得出阳性结果,则继续施用CD20抗体。
权利要求
1.治疗患者的移植排斥的方法,包括(a)对来自该患者的样品检测CD20;和(b)如果在该样品中检出CD20,则对该患者施用治疗移植排斥有效量的CD20拮抗剂。
2.权利要求1所述的方法,其中所述样品来自移植前取自所述患者的活组织检查。
3.权利要求1所述的方法,其中所述样品来自所移植的移植物的活组织检查。
4.权利要求1所述的方法,其中在步骤(b)中治疗实体器官移植排斥。
5.权利要求4所述的方法,其中所述实体器官是肺。
6.权利要求1所述的方法,其中所述拮抗剂包括抗体。
7.权利要求6所述的方法,其中所述抗体未与细胞毒性剂偶联。
8.权利要求6所述的方法,其中所述抗体包括Rituximab。
9.权利要求6所述的方法,其中所述抗体包括人源化的2H7。
10.权利要求6所述的方法,其中所述抗体与细胞毒性剂偶联。
11.权利要求1所述的方法,其中在步骤(a)中检测CD20蛋白质。
12.权利要求1所述的方法,其中在步骤(a)中检测CD20核酸。
13.权利要求1所述的方法,其中在步骤(b)中治疗急性排斥。
14.权利要求1所述的方法,其中在步骤(b)中治疗慢性排斥。
15.权利要求1所述的方法,其中将选自下组的移植物移植到所述患者中肾、肺、胰岛细胞、或心移植物。
16.权利要求1所述的方法,其中在移植前、移植中或移植后施用所述拮抗剂。
17.权利要求1所述的方法,其中所述样品取自移植前、移植中或移植后的患者。
18.治疗患者的移植排斥的方法,包含(a)对来自所述患者的样品检测CD20阳性B细胞;和(b)如果在该样品中检出CD20阳性B细胞,则对该患者施用治疗移植排斥有效量的CD20抗体。
全文摘要
本申请描述了在其样品中检出CD20的患者中治疗移植排斥的方法。
文档编号C12Q1/68GK1918181SQ200480041907
公开日2007年2月21日 申请日期2004年12月7日 优先权日2003年12月19日
发明者保罗·G·布鲁尼塔 申请人:健泰科生物技术公司
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