专利名称：一种检测与鼻咽癌相关的易感基因plunc基因型的方法及plunc易感基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及鼻咽癌的人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与鼻咽癌患病风险相关的易感基因PLUNC的基因型检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及上述检测方法和易感基因在鼻咽癌的预防和控制以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
鼻咽癌(NPC)是一种上皮源性的恶性肿瘤，其发病具有明显的地域和种族差异。在中国南方和东南亚国家(如新加坡、台湾和香港)相对高发，其发病率几乎是高加索人群的100倍。鼻咽癌的易感性在种族和地区分布上的明显差异是多因素或多基因协同交互作用的结果，与EB病毒(Epstein-Barr)感染、环境理化因素和遗传因素有关。
通过定位遗传学研究能够鉴定与增加或降低多基因病发病风险相关的遗传变异。因此，搜寻在鼻咽癌发病机制中起重要作用的候选基因的多态性并研究其与疾病表型的遗传关联可能是解决鼻咽癌遗传病因和阐明种族和地区间易感性差异的机制的希望所在。事实上，已有一些基于亚洲、高加索和北非人群的病例对照研究揭示了人类白细胞抗原(HLA)多态性和鼻咽癌的相关性。一项基于东南亚中国人群的受累同胞对研究将易感位点定位于染色体的6p22区域，从而进一步支持了HLA分子在鼻咽癌发病中的重要作用。除了HLA位点以外，多个群体研究也揭示了一些非HLA位点与鼻咽癌易感性相关，包括热休克蛋白70-2基因(heatshock protein 70-2，HSP70-2)，周期素D1基因(cyclin D1，CCND1)和谷胱甘肽S-转移酶M1(glutathione S-transfera se M1，GSTM1)。最近，一项基于20个家系(广东语系，采自中国广东省)的全基因组连锁分析显示，在第4号染色体上也存在鼻咽癌的易感位点。鼻咽癌可在多级功能水平上发生，包括致癌物的代谢、肿瘤抗原的递呈、细胞周期的调节和分子伴侣辅助的肿瘤抗原肽的折叠等，因此我们假设，除上述的多个基因外，可能尚有多个未被鉴定的基因修饰鼻咽癌的易感性。
1998年我们曾在人类鼻咽部组织克隆出一个新的具有组织相对特异性表达的侯选抑瘤基因—YH1基因(现统一命名为PLUNC基因)。其确切的生物学功能至今不明，但已发现其与上呼吸道刺激炎性反应有关，并有可能作为检测非小细胞肺癌微小转移的一种分子学标记。人组织表达谱结果表明，PLUNC基因在气管组织中很高表达，在空肠、唾液腺、肺、右心房组织中有较高表达，而在其它器官组织中表达很低或不能检测出来，提示其是来源于上皮组织的且主要在鼻咽和气管中高表达的相对特异基因。原位杂交检测显示，PLUNC基因在人正常鼻咽组织的鳞状上皮、腺上皮及柱状上皮均有表达，而在鼻咽癌组织中表达水平极低。体外实验也显示PLUNC基因可使细胞增殖速度明显减低(转染CNE-2Z细胞株)，因此PLUNC基因可能与鼻咽癌的发生存在负相关，为侯选的抑瘤基因。
基于PLUNC基因在鼻咽癌发生中可能的作用，我们假设该基因是鼻咽癌发生的易感基因。很有可能该基因区域的遗传多态性能影响其功能或表达水平的改变，既而导致基因型依赖的鼻咽癌易感性的差异。
在本项研究中，我们首先系统筛查了PLUNC基因中的单核苷酸多态性(Single Nuc1eotide Polymorphism，SNP)，然后在基于中国人群的病例-对照研究中调查这些SNP与鼻咽癌易感性的相关性。
发明内容
发明人系统筛查了PLUNC基因的SNP，继而考察了PLUNC基因的多态性位点C-2128T及C-1888T与鼻咽癌易感性的相关性。通过基于医院的病例对照研究，进行了大量的临床和实验室实验和大样本的统计分析，判明携带PLUNC的-2128C/C基因型、-1888C/C基因型或携带由此两位点组成的-2128C--1888C单倍型的个体对鼻咽癌有更高的易感性。因此本发明鉴定了鼻咽癌的一种新的易感基因及易感基因型和单倍型。
本发明还提供了一种检测与鼻咽癌易感性关联的易感位点C-2128T及C-1888T的方法，该方法为PCR-RFLP法。
本发明还提供了一种检测与鼻咽癌易感性关联的易感单倍型-2128C--1888C的方法，该方法为以PHASE程序计算单倍型结果的方法。
本发明还提供了通过检测PLUNC基因的C-2128T位点、C-1888T位点或由此两位点组成的单倍型来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法。
本发明还提供了分别用于检测多态性位点C-2128T及C-1888T的引物对。
本发明进一步提供了分别用于检测与鼻咽癌关联的PLUNC基因的C-2128T及C-1888T位点的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制鼻咽癌的应用。
一、如上所述，本发明提供了一种检测与鼻咽癌易感性关联的PLUNC基因的C-2128T及C-1888T位点的方法，该方法为PCR-RFLP法。具体的说，包括了如下步骤1、分别对PLUNC基因C-2128T及C-1888T位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对扩增的含有C-2128T位点和C-1888T位点的PCR产物分别以限制性内切酶Pst I和Fba I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明PLUNC基因C-2128T及C-1888T位点的基因型。
二、另一方面，本发明还提供了与鼻咽癌易感性关联的易感基因型，即PLUNC基因的-2128C/C等位基因型、-1888C/C等位基因型或由此两等位组成的C-C单倍型为鼻咽癌的易感基因型。并提供了一种通过检测PLUNC基因的C-2128T等位基因型、C-1888T等位基因型或由此两等位组成的单倍型来判定人群或个体对鼻咽癌易感性的方法。该方法包括1、分别对PLUNC基因C-2128T位点和C-1888T位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对PCR产物分别以限制性内切酶Pst I和Fba I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明PLUNC基因C-2128T位点和C-1888T位点的基因型；3、当某一个体的PLUNC基因的C-2128T位点表现为-2128C/C基因型，或者C-1888T位点表现为-1888C/C基因型，或者由PHASE程序计算出的此两位点构成的单倍型表现为-2128C--1888C单倍型时，则表明该个体患鼻咽癌的可能性更高。
三、检测PLUNC基因C-2128T位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5’-AGCTTGGAGCATTGAAAGGA-3’反向引物5’-ACGCACCCCAGATGTAGGC-3’检测PLUNC基因C-1888T位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5’-AGGTGAGACAGTTAAGCTATTTGAT-3’反向引物5’-AGGGGCCAAGAGATGAGACT-3’四、本发明进一步提供了检测与鼻咽癌关联的PLUNC基因的C-2128T位点及C-1888T位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测C-2128T位点及C-1888T位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的C-2128T位点及C-1888T位点的基因型的试剂盒，含有PCR的引物对(5’-AGCTTGGAGCATTGAAAGGA-3’和5’-ACGCACCCCAGATGTAGGC-3’；5’-AGGTGAGACAGTTAAGCTATTTGAT-3’和5’-AGGGGCCAAGAGATGAGACT-3’)，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStar Taq酶Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStarTaq酶。在PCR产物的RFLP分析中，该试剂盒可含有Pst I及Fba I内切酶及其缓冲液，显示C-2128T位点基因型的Pst I酶切图谱及C-1888T位点基因型的Pba I酶切图谱等。
使用方法说明如下1、C-2128T位点所在区域的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25μl反应体系为10ng基因组DNA，2μM引物，2.5mM dNTP，0.6U TaKaRa EX Taq DNA聚合酶以及10×EX Taq Buffer(含Mg2+)。95℃ 15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃ 30s和72℃ 50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从61.5℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在55℃，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的PCR产物(164bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2、C-2128T位点的RFLP分析5μl的164bp PCR产物以8U的Pst I(TaKaRa公司)充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，T/T基因型者具Pst I酶切位点(CTGCA↓G)，被切成19bp和145bp的两条带，C/C基因型者则没有酶切位点则不能被切开，只有164bp的单一条带，而杂合子则呈现19bp、145bp和164bp三条带。
3、C-1888T位点所在区域的的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25μl反应体系为10ng基因组DNA，2μM引物，2.5mM dNTP，0.6U TaKaRa EX Taq DNA聚合酶以及10×EX Taq Buffer(含Mg2+)。95℃ 15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃ 30s和72℃ 50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从60.5℃开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在54.8℃，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的PCR产物(192bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
4、C-1888T位点的RFLP分析5μl的192bp PCR产物以8U的Fba I(TaKaRa公司)充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，T/T基因型者具Fba I酶切位点(T↓GATCA)，被切成22bp和170bp的两条带，C/C基因型者因没有酶切位点则不能被切开，只有192bp的单一条带，而杂合子则呈现22bp、170bp和192bp三条带。
五、本发明还提供了与鼻咽癌易感性关联的PLUNC基因C-2128T基因型、C-1888T基因型以及由此两位点组成的单倍型的检测方法及其在鼻咽癌人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了PLUNC基因的-2128C/C基因型、-1888C/C基因型或由此两位点组成的-2128C--1888C单倍型与鼻咽癌易感性存在关联，因此，在鼻咽癌人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象进行PLUNC基因C-2128T和C-1888T位点的基因型进行分析，以判断该对象是否携带有鼻咽癌易感基因型-2128C/C、-1888C/C或C-C单倍型(表现为对鼻咽癌具有更高的易感性)。对具有基因型-2128C/C、-1888C/C或C-C单倍型的个体，则可对之进行科学的干预，例如建议及早进行治疗性预防等，这样可以针对性地降低这些易感人群的鼻咽癌的风险。
图1.限制性内切酶Pst I(购自TaKaRa公司)消化164bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M标准分子量参照物DL2000(购自TaKaRa公司)；泳道3、6和7T/T基因型酶切鉴定的结果，PCR产物被切割为长度分别为145bp和19bp的两条片段(因为19bp片断过小，电泳图上没有显示)；泳道2C/C基因型酶切鉴定的结果，只出现长度为164bp的一个条带；泳道1、4、5和8C/T基因型酶切鉴定的结果，出现长度分别为164bp、145bp和19bp的三条片段(因为19bp片断过小，电泳图上没有显示)。
图2.限制性内切酶Fba I(购自TaKaRa公司)消化192bp PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M标准分子量参照物DL2000(购自TaKaRa公司)；泳道5、7和8T/T基因型酶切鉴定的结果，PCR产物被切割为长度分别为170bp和22bp的两条片段(因为22bp片断过小，电泳图上没有显示)；泳道2C/C基因型酶切鉴定的结果，只出现长度为192bp的一个条带；泳道1、3、4和6C/T基因型酶切鉴定的结果，出现长度分别为192bp、170bp和22bp的三条片段(因为22bp片断过小，电泳图上没有显示)。
实施例实施例1该实施例设计并合成了两套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与鼻咽癌易感性关联的PLUNC基因C-2128T位点基因型、C-1888T位点基因型及由此两位点组成的单倍型的方法。
1、基因组DNA的提取采取本领域常规的Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。
1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；
2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4℃2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.1％Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl-10mM EDTA，pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10％SDS至终浓度为0.5％，混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200μg/ml，混匀，55℃ 3小时或37℃过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入6M NaCl 1.2ml，剧烈振荡20秒，2,200rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)加入2倍体积预冷无水乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀，挑出DNA至另一Eppendorf管；8)以75％预冷乙醇洗涤DNA沉淀2次；9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/280nm OD比值。
2、PCR扩增用本发明提供的扩增C-2128T位点所在区域的引物对(检测C-1888T位点则选用与其相对应的PCR引物对)，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25μl反应体系为10ng基因组DNA，2μM引物，2.5mM dNTP，0.6U TaKaRa EX Taq DNA聚合酶以及10×EX Taq Buffer(含Mg2+)。95℃ 15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94℃ 30s和72℃ 50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从61.5℃(对C-1888T位点则是60.5℃)开始每个循环降0.5℃，第二阶段扩增的退火温度则固定在55℃(对C-1888T位点则是54.8℃)，最后的72℃延伸时间为7min。特异性的164bp的PCR产物(对C-1888T位点则是192bp)以1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
3、RFLP分析取5μl的164bp PCR产物以8U的Pst I(TaKaRa)充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，T/T基因型者具Pst I酶切位点(CTGCA↓G)，被切成19bp和145bp的两条带，C/C基因型者则没有酶切位点则不能被切开，只有164bp的单一条带，而杂合子则呈现19bp、145bp和164bp三条带。
对C-1888T位点的RFLP分析而言，则取5μl的192bp PCR产物以8U的Fba I(TaKaRa)充分酶切，并以3％的琼脂糖凝胶进行酶切片断分析，T/T基因型者具Fba I酶切位点(T↓GATCA)，被切成22bp和170bp的两条带，C/C基因型者则没有酶切位点则不能被切开，只有192bp的单一条带，而杂合子则呈现22bp、170bp和192bp三条带。
4、单倍型构建将经过PCR-RFLP方法得到的C-2128T位点和C-1888T位点基因型数据输入PHASE程序，可以计算得到各个体的单倍型。
实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对239个鼻咽癌病人和286个匹配的健康对照人群的PLUNC基因的C-2128T位点基因型、C-1888T位点基因型及由此两位点组成的单倍型进行了分析。
1、试验对象
研究群体由525名个体组成。鼻咽癌患者239例，其中男163例、女76例，年龄21-77岁(平均46.9岁)，广东籍220例，其他籍19例，来源于广州第一军医大学南方医院耳鼻喉科和广东省建门中心医院，经临床及病理切片确诊为NPC，且未经治疗；健康对照286例，其中男151例、女135例，年龄18-80岁(平均47.2岁)，广东籍264例，其他籍22例，来源于上述2个医院的门诊查体的志愿者，无鼻咽癌家族史。所有受试者均签署了知情同意书，本研究计划得到国家人类基因组北方研究中心医学伦理委员会的批准。
2、PLUNC基因C-2128T、C-1888T位点基因型及由此两位点组成的单倍型的确定239例鼻咽癌患者和286例健康对照个体中PLUNC基因C-2128T位点和C-1888T位点的基因型的频率分布如表1所示。携带-2128C/C基因型的个体比携带-2128T/T基因型的个体有更高的患鼻咽癌的风险(OR＝2.8，95％CI＝1.7-4.9，p＝0.0006)；类似的，携带-1888C/C基因型的个体比携带-1888T/T基因型的个体有更高的患鼻咽癌的风险(OR＝3.3，95％CI＝1.8-6.1，p＜0.0001)。这些关联在进行针对多重检验的校正后仍然存在。
由C-2128T位点和C-1888T位点组成的单倍型在239例鼻咽癌患者和286例健康对照个体中的分布频率如表2所示。携带C-C单倍型的个体患鼻咽癌的风险显著增加(OR＝1.86，95％CI＝1.34-2.56，p＝0.00016)，在进行针对多重检验的校正后仍然如此。
因此，用本发明的方法解析了PLUNC的C-2128T位点基因型、C-1888T位点基因型及由此两位点组成的单倍型与鼻咽癌的易感性之间的相关性。
表1鼻咽癌患者与健康对照中PLUNC基因的C-2128T和C-1888T位点基因型的分布
注CI可信限。通过执行logistic回归分析检测关联，并校正了年龄和性别的风险因素。
表2鼻咽癌患者与健康对照中PLUNC基因的单倍型的分布 应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。
参考文献1.Parkin DM，Laara E，Muir CS.Estimates of the worldwidefrequency of sixteen major cancers in 1980.Int J Cancer1988；41184-97.
2.Hildesheim A，Levine PH.Etiology of nasopharyngeal carcinomaa review.Epidemiol Rev 1993；15466-85.
3.Simons MJ，Wee GB，Goh EH，Chan SH，Shanmugara tnam K，Day NE，de-The GB.Immunogenetics aspects of nasopharyngeal carcinoma(NPC).IV.Increased risk in Chinese for NPC associated witha Chinese-related HLA profile(A2，Singapore2).J Nat CancerInst 1976；57977-80.
4.Chen CJ，Liang KY，Chang YS，Wang YF，Hsieh T，Hsu MM，Chen JY，Liu MY.Multiple risk factors of nasopharyngeal carcinomaEpstein-Barrvirus，malarial infection，cigarette smoking andfamilial tendency.Anticancer Res 1990；10547-53.
5.Lu SJ，Day NE，Degos L，Lepage V，Wang PC，Chan SH，Simons M，McKnight B，Easton D，Zeng Y，de-The G.Linkage of anasopharyngeal carcinoma susceptibility locus to the HLA region.Nature 1990；346470-1.
6.Feng BJ，Huang W，Shugart YY，Lee MK，Zhang F，Xia JC，Wang HY，Huang TB，Jian SW，Huang P，Feng QS，Huang LX，Yu XJ，Li D，ChenLZ，Jia WH，Fang Y，Huang HM，Zhu JL，Liu XM，Zhao Y，Liu WQ，Deng MQ，Hu WH，Wu SX，Mo HY，Hong MF，King MC，Chen Z，ZengYX.Genome-wide scan for familial nasopharyngeal carcinomareveals evidence of linkage to chromosome 4.Nat Genet 200231395-9.
7.Weston WM，LeClair EE，Trzyna W，McHugh KM，Nugent P，LaffertyCM，Ma L，Tuan RS，Greene RM.Differential displayidentification of plunc，a novel gene expres sed in embryonicpalate，nasal epithelium，and adult lung.J Biol Chem1999；27413698-703.
8.He ZW，Xie L，Xu LG，Lan K，Liu W，Zhang L，Ren C，Shi J，ZhouW，Yao K.Cloning of a novel gene associated with humannasopharyngeal carcinoma.Chin Sci Bull 2000；452267-72.
9.Sung YK，Moon C，Yoo JY，Moon C，Pearse D，Pevsner J，RonnettGV.Plunc，a member of the secretory gland protein family，isup-regulated in nasal respiratory epithelium after olfactorybulbectomy.J Biol Chem 2002；27712762-9.
10.Zhou GQ，Zhai Y，Dong XJ，Li Y，Zhang XM，Zhang RF，Li SQ，LiXH，He FY，Wei HD，Chen XP，Yao ZJ，Shen Y，Qiang BQ，He FC.Variants in TNFRSF5 locus and association analysis withhepatitis B virus(HBV)infection.Hum Mutat 2004；2399-100.11.Zhou GQ，Zhai Y，Dong XJ，Zhang XM，He FY，Zhou KX，Zhu YP，WeiHD，Yao ZJ，Zhong SF，Shen Y，Qiang BQ，He FC.Haplotypestructure and evidence for positive selection at the human IL13locus.Mol Biol Evol 2004；2129-35.
12.Stephens M，Smith NJ，Donnelly P.A new statistical method forhaplotype reconstruction from population data.Am J Hum Genet2001；68978-89.
13.Johnson GC，Esposito L，Barratt BJ，Smith AN，Heward J，DiGenova G，Ueda H，Cordell HJ，Eaves IA，Dudbridge F，Twells RC，Payne F，Hughes W，Nutland S，Stevens H，Carr P，Tuomilehto-WolfE，Tuomilehto J，Gough SC，Clayton DG，Todd JA.Haplotypetagging for the identification of common disease genes.NatGenet 2001；29233-7.
14.He Y，Zhou G，Zhai Y，Dong X，Lv L，He F，Yao K.Associationof PLUNC gene polymorphisms with susceptibility tonasopharyngeal carcinoma in Chinese population.J Med Genet.2004；In press.
权利要求
1.一种通过检测PLUNC基因的C-2128T位点、C-1888T位点或由此两位点组成的单倍型来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法，其特征在于当某一个体的PLUNC基因的C-2128T位点或C-1888T位点表现为基因型C/C，或由此两位点组成的单倍型表现为C-C时，则表明该个体对鼻咽癌具有更高的易感性。
2.一种检测PLUNC基因的C-2128T位点的基因型的方法，该方法为PCR-RFLP，即聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性分析方法，其特征为1)对包含C-2128T多态位点的PLUNC基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物5’-AGCTTGGAGCATTGAAAGGA-3’反向引物5’-ACGCACCCCAGATGTAGGC-3’2)对包含C-2128T多态位点的PLUNC基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增；3)对PCR产物以限制性内切酶Pst I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明PLUNC基因C-2128T位点的基因型，164bp的PCR产物以Pst I限制性内切酶消化后，若出现长度分别为145bp和19bp的2条带，则为T/T基因型；若只出现164bp一个条带则为基因型C/C；若145bp、19bp和164bp的三个片段均出现则为基因型C/T。
3.一种与鼻咽癌易感性关联的PLUNC基因C-2128T位点的检测试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种、用于RFLP的限制性内切酶Pst I和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱。
4.一种检测PLUNC基因的C-1888T位点的基因型的方法，该方法为PCR-RFLP，即聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性分析方法，其特征为1)对包含C-1888T多态位点的PLUNC基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物5’-AGGTGAGACAGTTAAGCTATTTGAT-3’反向引物5’-AGGGGCCAAGAGATGAGACT-3’2)对包含C-1888T多态位点的PLUNC基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增；3)对PCR产物以限制性内切酶Fba I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明PLUNC基因C-1888T位点的基因型，192bp的PCR产物以Fba I限制性内切酶消化后，若出现长度分别为170bp和22bp的2条带，则为T/T基因型；若只出现192bp一个条带则为基因型C/C；若170bp、22bp和192bp的三个片段均出现则为基因型C/T。
5.一种与鼻咽癌易感性关联的PLUNC基因C-1888T位点的检测试剂盒，其特征在于包括扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种、用于RFLP的限制性内切酶Fba I和相应缓冲液的一种或多种及其酶切图谱。
6.一种检测PLUNC基因的C-2128T位点和C-1888T位点组成的单倍型的方法，其特征是利用如权利要求2-5项或其它方法得到个体的C-2128T位点和C-1888T位点的基因型数据，以PHASE程序计算出个体的单倍型。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法或其试剂盒在鼻咽癌的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。
全文摘要
本发明涉及与鼻咽癌患病风险相关的易感基因PLUNC的C－2128T、C－1888T位点以及由此两位点组成的单倍型的检测方法。所述方法为PCR－RFLP(即聚合酶链式反应－限制性内切酶长度多态性分析)，单倍型的构建则应用PHASE程序。本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及使用。另外，本发明将基因的C－2128T、C－1888T位点以及由此两位点组成的单倍型与鼻咽癌患病风险联系起来，确定了PLUNC是鼻咽癌的一个新型易感基因，为鼻咽癌的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。
文档编号C12Q1/68GK1683556SQ200510008650
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月1日 优先权日2005年3月1日
发明者贺福初, 周钢桥, 翟芸, 张红星 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所