专利名称：一种结核杆菌重组蛋白及其表达纯化方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因重组技术领域，具体涉及一种结核杆菌重组蛋白Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4及其表达纯化方法和应用。
背景技术：
结核杆菌是引起人类和动物结核病的病原菌，结核杆菌由于其独特的生物特性，如细胞壁厚、生长周期长、多为潜伏感染和易于耐药等特点使结核病药物治疗面临很大的困难。虽然在上世纪上半叶，已成功的研制出预防结核病的卡介苗(BCG)，以及治疗结核病的特效药物(如异烟肼，利福平等)，但到了上世纪末，结核病仍然是全球感染和传染病的第一“杀手”。而且随着艾滋病(HIV)在全球的肆虐，以及结核多重抗药菌株(multi-drugresistant strains)的出现等诸多原因，使得治疗结核病的形势更加严峻。
目前研制成功的唯一的能够预防结核病的疫苗——卡介苗，虽然已在全球范围内广泛使用，但在近期研究中发现，其许多临床试验结果并不是十分有效，免疫预防效果不稳定，在全球范围的免疫保护力检测，由0-80％不等，并且对成人几乎无效，对已感染患者更是没有治疗作用，可以说卡介苗并不是预防肺结核的理想疫苗，研究和开发新的结核疫苗势在必行！现阶段研究结核病疫苗主要集中在以下几个领域1、以BCG为载体，重组进新基因的重组BCG，2、营养缺陷型结核减毒活疫苗，3、结核亚单位疫苗，4、结核DNA疫苗。
发明内容
本发明目的在于提供一种结合杆菌重组蛋白，并提出该重组蛋白的构建、表达和纯化方法，最后提出该重组蛋白在构建新型的抗结核杆菌亚单位疫苗中的应用。
本发明提出的结核杆菌重组蛋白为Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4，由结合抗原Ag85B，Mpt64第190-198位多肽段和Mtb8.4重组获得，其序列为SEQ.ID.NO1。并以该重组蛋白作为抗结核杆菌亚单位疫苗。
虽然卡介苗在临床的使用已经超过了半个世纪，但是由于其免疫保护效果在不同地区存在着明显的差距.为了避免BCG的这些缺陷，可以利用结核杆菌的具有免疫保护效果的蛋白质抗原作为结核病的亚单位疫苗.
实验结果一再证明，结核杆菌的活菌苗对动物的免疫保护力要明显高于死菌苗，这是因为结核杆菌分泌到菌体外的抗原在结核感染的初期阶段能被第一类辅助性T细胞(Th1)所识别而诱发有效的免疫保护反应.这个结果对亚单位疫苗抗原的选择提供了方向.由于抵抗结核杆菌的侵袭，主要依赖巨噬细胞内的抗原特异性T细胞的活化，以及IFN-γ途径的激活.所以如何发挥细胞内这两方面的作用，也就成了本发明选择抗原的依据.
本发明所选用的结核抗原Ag85B，Mpt64，Mtb8.4就属于这样的抗原Ag85B属于结核杆菌抗原85复合物家族成员.该家族是一类纤维结合素结合蛋白，是结核杆菌ST-CF(short-term culture filtrates短期培养物的过滤后蛋白质)中早期的主要分泌性蛋白质.已被证明是一种潜在的毒力因子，可以特异结合纤维结合素及宿主体内细胞外基质蛋白，从而增强病原体的毒力.实验证明Ag85B基因是重要的结核杆菌免疫保护性抗原.将其免疫小鼠，都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应.在用气雾攻击结核杆菌H37Rv毒株后，均获得了接近BCG的免疫保护力。
(引自1.Patti，J.M.，B.L.Allen，M.J.McGavin，and M.Hook.1994.MSCRAMMmediated adherence of microorganisms to host tissues.Annu.Rev.Microbiol.48585-617.VOL.68,2000 DISRUPTION OF fbpA AND fbpB IN M.TUBERCULOSIS 7772.Ratliff，T.L.，R.McCarthy，W.B.Telle，and E.J.Brown.1993.Purificationof a mycobacterial adhesin for fibronectin.Infect.Immun.611889-1894.
3.Ratliff，T.L.，J.A.McGarr，C.Abou-Zeid，G.A.Rook，J.L.Stanford，J.Aslanzadeh，and E.J.Brown.1988.Attachment of mycobacteria to fibronectin-coated surfaces.J.Gen.Microbiol.1341307-1313.
4.李忠明 当代新疫苗)。
Mpt64是结核杆菌的分泌性蛋白质，也是结核杆菌ST-CF中的主要成分，可以占到结核杆菌培养基上清滤过液中蛋白质总量的8％.相对分子质量24KDa，既能刺激细胞免疫反应，又能诱导体液免疫反应.由Mpt64蛋白的免疫原性表位中，本发明选取了其(190～198)这段多肽为H-2D(b)限制性的CD8+T细胞表位.因为加入激活特异性的CD8+T细胞抗原成分可以提高疫苗的整体保护率。
(引自1.柏银兰，薛莹，李元，徐志凯，师长宏，张海；结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性；第四军医大学学报(J Fourth Mil Med Univ)2004；25(13)2.Harboe，M.，S.Nagai，M.E.Patarroyo，M.L.Torres，C.Ramirez，and N.Cruz.1986.Properties of proteins MPB64，MPB70，and MPB80 of Mycobacterium bovis BCG.Infect.Immun.52293-302。
3.李忠明 当代新疫苗)。
Mtb8.4一种低分子量的T-细胞抗原.来源于结核杆菌滤过后培养物(culture filtrate)，是结核杆菌潜伏感染期的T细胞免疫反应性抗原.能够激起Th1型细胞反应，刺激高水平的IFN-γ的分泌.(引自李忠明 当代新疫苗)本发明提出的重组蛋白为Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4.就是将Ag85B，mpt64的190-198位的氨基酸序列所对应的核酸序列以及mtb8.4基因连在一起，克隆进大肠杆菌载体进行表达，然后进一步纯化。具体步骤如下首先重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4的构建设计引物扩增mpt64(190-198)-mtb8.4(简称8.4f)，(引物由DNA的5’端-3’端)上游ACA ATGAGGCTGTCGTTGAC(SEQ.ID.NO2)说明双下划线代表编码Mpt64(190-198)肽段的基因.
单下划线代表Sal I酶切位点下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG(SEQ.ID.NO3)说明单下划线HindIII酶切位点以结核杆菌标准毒株H37Rv(上海市肺科医院提供)DNA为模板，用以上两条引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后，用Sal I和HindIII双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)(市售)中；设计引物扩增Ag85B基因，(引物由DNA的5’端-3’端)上游CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT(SEQ.ID.NO4)说明单下划线代表EcoR I酶切位点下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG (SEQ.ID.NO5)说明单下划线代表Sal I酶切位点将扩增的mpt64(190-198)-mtb8.4和Ag85B经酶切，连接后，形成重组新基因。
测序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv结核全基因组相应基因序列完全一致。相应的氨基酸序列为SEQ ID NO6。
其次，将重组好的基因，克隆到质粒PET28a(+)中，在大肠杆菌表达菌株B121上进行表达纯化。
步骤如下培养菌体，诱导活化，离心收集上清，将上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果没有发现所需的目的重组蛋白，说明目的蛋白是以包涵体形式存在于沉淀中.利用传统的Ni-NTAHisbind树脂柱进行分离纯化，效果不好，杂蛋白的洗脱效果不明显.于是进一步对包涵体进行分离。电泳结果显示，目的蛋白已经得到分离，经透析，超滤后收集。
重组蛋白免疫效果的测定分别将Ag85B蛋白和重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4与等体积的弗式不完全佐剂(IFA)混合，(对照组为重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4与PBS混合以及单独的IFA免疫组)，皮下注射免疫C57BL/6小鼠(市售)，共免疫三次，最后一次免疫后三周，取血做ELISA检测抗-Ag85B的抗体IgG(H+L)，IgG1和IgG2a水平，并进行比较。
本发明将结核杆菌三种具有明显免疫保护力的抗原基因连接在一起，形成新的重组基因.这种组合不是简单的叠加组合，而是选用成熟的Ag85A蛋白的基因与具CD8+T细胞表位的一段Mpt64抗原的肽段还有Mtb8.4抗原基因连接在一起，在大肠杆菌载体内进行克隆表达，并通过初步实验发现用这种重组蛋白免疫的小鼠可以激起比利用单个蛋白(Ag85B)免疫的小鼠更好的抗体反应。从而为以后继续进行抗结核蛋白疫苗的研究打下基础。
图1Ag85B基因克隆进大肠杆菌载体PET28a(+)。其中，M代表Marker，1.质粒PET-28a-(+)，2.Ag85B基因 组入质粒PET-28a(+)，3.PET28a(+)质粒经酶切后产物，4.PET28a(+)-Ag85BPCR产物。
图2.mtp64(190-198)-mtb8.4基因克隆进质粒PET28a(+)中。
图3重组基因Ag85B-mpt64190-198-mtb8.4克隆进入PET28a(+)质粒。
图4Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4融合蛋白纯化。其中，M代表Marker，1-3杂蛋白漂洗，4-5目的蛋白洗脱。
图5 ELISA方法检测抗Ag85B IgG(H+L)水平。AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
图6 ELISA方法检测抗Ag85B IgG1水平。AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
图7 ELISA方法检测抗Ag85B IgG2a水平。AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
具体实施例方式
1、重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4的构建1)首先设计引物扩增mpt64(190-198)-mtb8.4(简称8.4f)，上游ACA ATGAGGCTGTCGTTGAC说明双下划线代表编码mpt64190-198肽段的基因.
单下划线代表Sal I酶切位点下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG
说明单下划线HindIII酶切位点以结核杆菌标准毒株(H37Rv)DNA为模板，用以上两条引物进行扩增，PCR反应条件如下98℃预变性5分钟；98℃变性45秒，62℃复性45秒，72℃延伸2分30秒，30个循环；72℃延伸12分钟。PCR产物经纯化后，用Sal I和HindIII双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)中。
2)扩增Ag85B基因(由于Ag85B基因后面拟定插入联合基因mpt64-mtb8.4，所以设计引物时就把终止信号去掉，另外Ag85B前端的信号肽序列也被去掉，只扩增成熟肽部分)上游CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT说明单下划线代表EcoR I酶切位点下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG说明单下划线代表Sal I酶切位点以结核杆菌标准毒株(H37Rv)DNA为模板，用以上两条引物进行扩增，PCR反应条件如下98℃预变性5分钟；98℃变性45秒，62℃复性45秒，72℃延伸2分30秒，30个循环；72℃延伸12分钟。PCR产物经纯化后，用EcoR I和Sal I双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)中。
3)将扩增的mpt64(190-198)-mtb8.4和Ag85B经酶切，连接后，形成重组新基因，2、将重组好的基因，克隆在大肠杆菌表达载体PET28a(+)上进行表达纯化。其步骤为活化菌体，移入1升培养基中摇2-3h经IPTG(1mM)37℃诱导4h，10000rpm离心10’，分别将上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果没有发现所需的目的重组蛋白，说明目的蛋白是以包涵体形式存在于沉淀中.利用传统的Ni-NTA Hisbind树脂柱进行分离纯化，效果不好，杂蛋白的洗脱效果不明显.于是用下列方法对包涵体进行分离.
菌体沉淀用不加尿素的bufferB溶解(不加尿素的bufferB0.1MNaH2PO4，0.01MTris-Cl，PH8.0)经超声破碎(超声破碎1s，间隔一秒，持续时间0.5h，超声功率不超过300w)，10000rpm，离心40min，沉淀重悬于6M尿素中(PH8.5)，4℃，10000rpm离心15min，沉淀用含8M尿素的bufferB溶解，离心后取上清.电泳结果显示，目的蛋白已经得到分离.将上清装入透析袋中，分别用6M，4M，2M，1M，0.5M尿素洗液(每种尿素洗液中均含5mMTris-Cl)各洗一次，最后用0M尿素(含Tris-Cl 0.6057g)洗两次，将透析液用30KD的超滤管10000rpm，40min离心收集.
3、分别用重组蛋白Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4和Ag85B蛋白与等量的福式不完全佐剂(IFA)混合，(对照组为重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4与PBS混合以及单独的IFA免疫组)。免疫C57BL/6小鼠(100μg/只小鼠，皮下注射)，隔周免疫一次，共免疫三次，最后一次免疫后三周，取血利用ELISA方法测抗Ag85B的IgG(H+L)，IgG1，IgG2a水平。
首先，Ag85B蛋白溶解于PBS中(终浓度5μg/ml)，然后将该溶液加入96孔板中(100μl/孔)4℃过夜。将板洗干净后，加入含1％的小牛血清(BSA)的PBS封闭板(200μl/孔).待检血清(分别用Ag85B+IFA，Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4+IFA，Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4+PBS，IFA免疫的小鼠的血清)用PBS稀释100倍，再连续对倍稀释，加入板中(200μl/孔)孵育，37℃，1.5h。洗板后分别加稀释10000倍酶标羊抗鼠IgG(H+L)，稀释1000倍的酶标兔抗鼠IgG1或IgG2a，37℃孵育2h。板子加入邻苯二胺溶液(含0.03％过氧化氢，pH5.0)，用2mol/LH2SO4终止反应。测OD492。根据OD492≥阴性OD492二倍以上者，判定为阳性，再根据呈现阳性反应的抗体溶液稀释最大倍数的倒数判断其效价。结果显示重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4加弗式佐剂组比单纯Ag85B加弗式佐剂组抗体水平明显升高，而和单纯重组蛋白免疫组相比，重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4加弗式佐剂组表现出明显的抗体水平，可见重组蛋白在相应佐剂的辅助下可以激起明显的抗体水平，是新型亚单位疫苗的候选材料。
序列表SEQ ID NO1 SEQ ID NO2ACA TGAGGCTGTCGTTGACSEQ IDN03GCGAAGCTTTTAArAGTTGTTGCAGGAG
SEQ ID NO4CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCTSEQ ID NO5ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAGSEQ ID NO6MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSEFFSRPGLPVEYLQVHis Tag AG85BPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAGVD MRLSLTALSAGMPT64(190-198)VGAVAMSLTVGAGVASADPVDAVINTTCNYGQVVAALNATDPGAAAQFNASPVAQSYLRNFLAAPPPQRAAMAAQLQAVPGAAQYIGLVESVAGSCNNY.
Mtb8.权利要求
1.一种结核杆菌重组蛋白，其特征在于为Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4，其序列为SEQ.ID.NO.1。
2.一种如权利要求1所述结核杆菌重组蛋白的构建表达和纯化方法，其特征在于具体步骤如下(1)重组蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4的构建设计引物扩增mpt64(190-198)-mtb8.4，引物由DNA的5’端-3’端，上游ACAGTCGACTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTATGAGGCTGTCGTTGAC其中，双下划线代表编码Mpt64(190-198)肽段的基因，单下划线代表SalI酶切位点下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG其中，单下划线HindIII酶切位点；以结核杆菌标准毒株H37RvDNA为模板，用以上两条引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后，用SalI和HindIII双酶切，克隆构建在质粒PET28a(+)中；设计引物扩增Ag85B基因，引物由DNA的5’端-3’端，上游CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT其中，单下划线代表EcoRI酶切位点下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG其中，单下划线代表SalI酶切位点，将扩增的mpt64(190-198)-mtb8.4和Ag85B经酶切，连接，形成重组新基因Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4；(2)将上述重组好的基因，克隆质粒PET28a(+)中，在大肠杆菌表达菌株B121上进行表达、纯化。
3.一种结核杆菌重组蛋白Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4作为抗结核杆菌亚单位疫苗的应用。
全文摘要
本发明属基因重组技术领域，具体为一种抗结核杆菌的重组蛋白，它由抗原Ag85B－Mpt64第190－198位多肽和Mtb8.4基因连在一起，克隆进大肠杆菌载体进行表达，然后进一步纯化获得。记为Ag85B－Mpt6文档编号C12N15/63GK1793367SQ20051003077
公开日2006年6月28日 申请日期2005年10月27日 优先权日2005年10月27日
发明者王洪海, 郄亚卿, 祝秉东, 王九玲, 徐颖, 王庆忠 申请人:复旦大学