专利名称：一种超声波处理酶水解改性制备水解磷脂的方法
技术领域：
一种超声波处理酶水解改性制备水解磷脂的方法，属于磷脂改性技术领域。
背景技术：
磷脂是甘油、脂肪酸、胆碱、和胆胺等所组成的复杂化合物。它是脂溶性物质，是构成生物组织的重要成分，是生命的基础物质之一。在权威的美国食品化学法典中对磷脂的定义如下食品级的磷脂来源于大豆及其它植物，他是由磷脂的丙酮不溶物组成的复杂混合物，其中主要是磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)及磷脂酰肌醇(PI)。
磷脂(包括改性、精制磷脂)分为天然磷脂与改性磷脂两大类。天然磷脂主要是浓缩磷脂，根据性状的不同可分为塑性磷脂与流质磷脂而改性磷脂包括添加非反应物改性、化学改性、酶改性，也包括丙酮、乙醇精制。磷脂改性主要通过降低磷脂粘度，增加亲水性、消色、转化为粉末等形式改善其分散性、乳化性、润湿性及可加工性。
传统的磷脂改性方法主要是单个磷脂组分的分提、分离与纯化，实际上磷脂混合物的改性也可通过部分化学或酶水解、酰化、羟化和氢化实现。
浓缩磷脂中有多种官能团，这些集团能够成功地进行水解、氢化、羟基化、乙氧基化、卤化、磺化、酰化、琥珀酰化、臭氧化及磷酸化反应。现在工业大规模生产的化学改性食用级产品主要是羟化、酰化产品以及酶水解产品。
浓缩磷脂在强酸或强碱存在情况下发生水解，酶可用于选择性水解，反应过程中如果延长水解时间会产生脂肪酸、甘油磷酸(或脂肪酸盐、甘油磷酸盐)与氨化合物、碳水化合物的混合物。工业生产中需要通过控制反应条件对磷脂分子的某一脂肪酸进行水解，但酸、碱水解条件很难控制，在这种情况下，采用酶法水解更具有实用价值。
磷脂的酶改性是指用特定的酯酶或磷脂酶通过水解或酯交换反应能够改变磷脂的组成和结构，从而改变其理化性质和功能性质。这也是目前磷脂改性研究中的热点。Dutilh等(1981)用磷脂酶A2水解发现能提高蛋黄的乳化性质和热稳定性。水解物用于制作蛋黄酱，产品在100℃加热不会破乳，其制品的稠度大，动物实验也表明水解物不存在任何毒理问题。后来，Mine等(1993)利用核磁共振(NMR)和圆二色谱(CD)研究磷脂与蛋白质的相互作用发现鸡蛋磷脂酰胆碱不会影响卵白蛋白(OA)的结构，而其水解溶血磷脂酰胆碱能使卵白蛋白的结构发生改变，使其中的α-螺旋含量增大而β-折叠的含量降低。Buchold(1993)研究发现磷脂酶A2处理产生的溶血磷脂，其亲水性非常强而不溶于油，这样就可以从植物油中分离制备溶血磷脂。
磷脂作为保健食品是七十年代后才发展起来的，国内大豆磷脂的研究始于80年代初，到了90年代研究侧重于大豆磷脂的改性及应用研究，高纯度的醇溶卵磷脂的提取技术研究和磷脂保健食品的开发。我国大豆磷脂资源丰富，年加工大豆油200万吨左右。其中的副产品磷脂约2-3万吨，我国磷脂产品档次较低，多是饲料级的产品。食品级的产品关键指标和国外同种产品相比相差较大。医药级的产品多依赖进口。究其原因是磷脂质量与功能性太差，无法满足市场要求，天然磷脂的HLB值小，亲水性差，在水相中不易分散，而改变磷脂结构与功能性制成的改性磷脂改善了乳化性，提高了其亲水性。
磷脂酶可以裂解磷脂分子的脂肪酸集团来提高其对水溶解性。超声化学就是利用超声波来加速物质的化学反应后启动新的反应途径或改善其溶解、结晶、分配等物化性能，以提高化学反应产率或获得新的化学反应物质或提高物质的分离、提取效率。在食品领域中超声波广泛应用于食品分析检测、食品乳化混合、控制结晶、澄清分离、提取、干燥及对酶的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种超声波处理酶水解改性制备水解磷脂的方法。用超声波处理水解反应可明显地加速磷脂酶A2对大豆水化油脚的水解速度。
本发明的技术方案以大豆水化油脚为原料，以磷脂酶A2为酶水解用酶，采用超声波处理方法对大豆水化油脚在水相中进行改性，制备水解磷脂。磷脂酶A2为NOVO公司产品。大豆水化油脚中磷脂的质量浓度为20％-45％，加入磷脂酶A2的量为1-1.5毫升酶液/kg反应液，反应液中含0.15-0.3mol/l的钙离子，用0.05mol/L Tris/HCl缓冲液调pH值，超声波处理水解反应条件为反应液pH为7.5-8.5，超声波屏极电流为0.3-0.44A，反应温度50-60℃，反应时间30-50分钟。
本发明提出以大豆水化油脚为原料制备酶水解磷脂。加入磷脂酶A2的量为1.25毫升酶液/kg反应液为佳。超声波处理较佳水解反应条件为反应液pH为7.5，超声波屏极电流为0.44A，反应温度50℃，反应时间40分钟。
本发明的有益效果用超声波处理和不用超声波处理的两份样品做平行实验，实验结果显示，用超声波处理水解反应可非常明显地加速磷脂酶A2对大豆水化油脚的水解速度。
磷脂酶A2的水解反应是一个界面反应，磷脂在水中较难分散，而磷脂酶A2溶解于水中，它并不和单个的磷脂分子结合对其进行水解。一部分磷脂分散在水中，形成双层胶束，胶束与水的界面就是酶反应的点。磷脂酶游离到胶束与水的界面，胶束胶合到酶的活性部位，发生水解。反应界面的大小直接影响到反应的速度和水解的程度。反应往往需要经过一个潜伏期。而超声波处理反应体系时，可使体系迅速发生乳化，这就促进了底物的分散，反应界面迅速增大，这必然会促使反应速度的加快，与此同时，也必然是水解程度高于不用超声波处理的水解反应。
水解磷脂的O/W乳化性有很大改善，尤其是在钙离子存在的情况下更明显，而且其乳化性能较未改性磷脂更具持久性。酶改性产品应用于牛奶替代品以改善分散性与脂肪消化性。用本发明方法处理水化油脚，反应平衡后释放脂肪酸的量达到35umol/(g磷脂)，获得水解磷脂产品的HLB值为8-9。
具体实施例方式
实施例1大豆水化油脚中磷脂质量浓度20％-45％的反应液，加入磷脂酶A21-1.5ml的酶液/kg反应液，在相同反应体系的情况下用0.05mol/L Tris/HCl缓冲液调pH值，分别在pH＝5.5，6.5，7.5，8.5的0.05摩尔/升Tris/HCl缓冲液中55℃反应，反应液中含有0.15-0.3M的钙离子，超声波屏极电流为0.3-0.44A，反应时间30-50分钟。测定水解反应释放脂肪酸量与反应时间的关系。酶一般都有最适反应pH、温度、离子强度等反应条件，只有在最适反应条件下反应程度才能达到最好。从反应结果来看，在pH＝7.5-8.5的缓冲液中，反应释放出的脂肪酸量较多，太低或太高的pH值都不利于酶水解反应。pH＝7.5缓冲液尤为适合水解反应的进行。
实施例2超声波处理对水解反应速度的影响在与实施例1相同反应体系的情况下，用超声波处理和不用超声波处理的两份样品做平行实验。结果如表1所示。
从反应结果显示，用超声波处理水解反应可非常明显地加速磷脂酶A2对大豆水化油脚的水解速度。
磷脂酶A2的水解反应是一个界面反应，磷脂在水中较难分散，而磷脂酶A2溶解于水中，它并不和单个的磷脂分子结合对其进行水解。一部分磷脂分散在水中，形成双层胶束，胶束与水的界面就是酶反映的点。磷脂酶游离到胶束与水的界面，胶束胶合到酶的活性部位，发生水解。反应界面的大小直接影响到反应的速度和水解的程度。反应往往需要经过一个潜伏期。而超声波处理反应体系时，可使体系迅速发生乳化，这就促进了底物的分散，反应界面迅速增大，这必然会促使反应速度的加快，与此同时，也必然是水解程度高于不用超声波处理的水解反应。
表1
实施例3超声波处理反应条件的确定超声波处理反应的最佳功率超声波声功率的大小不同，对于酶水解反应的作用效果也就会不同。不同超声波屏极电流处理下处理时间与释放脂肪酸量的关系如表2所示。
实验结果显示，选择温和的超声波声功率下处理反应能够加速酶水解反应的速度，一些学者把原因归于较低的超声波声功率引起的空化现象较弱，而强的超声波的空化作用会使酶活降低。因此，选择屏极电流0.3-0.44A超声波处理水解反应较合适，尤以选择屏极电流0.44A为更佳表2
在一定功率超声波处理下温度对反应的影响在屏极电流0.44A的超声波处理下不同温度与释放脂肪酸量的关系如表3所示。
实验结果显示，在35-60℃温度范围内，随着温度的增加，释放的脂肪酸量也相应地增加，既反应速度加快，但渐趋平缓，和文献报道的磷脂酶A2最优温度50-60℃相吻合，尤以采用50℃的水解温度为更佳。
表3
在一定功率超声波处理下pH的影响在屏极电流0.44A的超声波处理下不同pH值与释放脂肪酸量的关系如表4所示。
表4
从表中可以看出，相同的水解时间里，在较低的pH值下释放的脂肪酸量随pH的上升而增大，在pH增到7.5左右略有下降，但逐渐趋向平缓，这和磷脂酶A2的最适pH在7-9相吻合。因此选择pH＝7.5-8.5的缓冲液，尤以pH7.5为更佳。
在一定功率超声波处理下反应时间的影响在屏极电流0.44A的超声波处理下不同反应时间与释放脂肪酸量的关系如表5所示。
表5
实验表明在短时间内，磷脂酶A2的水解速率较快，随着反应时间的延长，产物不断生成，底物浓度的不断下降，由于产物的抑制作用，水解速度逐渐趋于平缓，所以用超声波处理反应在一定时间内对磷脂酶A2水解起加速作用。水解时间40-50分钟即可，考虑生产效率和成本，取水解时间为40分钟。
权利要求
1.一种超声波处理酶水解改性制备水解磷脂的方法，其特征是以大豆水化油脚为原料，以磷脂酶A2为酶水解用酶，采用超声波处理方法对大豆水化油脚在水相中进行改性，制备水解磷脂；反应液大豆水化油脚中磷脂的质量浓度为20％-45％，加入磷脂酶A2的量为1-1.5毫升酶液/kg反应液，反应液中含0.15-0.3mol/l的钙离子，用0.05mol/LTris/HCl缓冲液调pH值，超声波处理水解反应条件为反应液pH为7.5-8.5，超声波屏极电流为0.3-0.44A，反应温度50-60℃，反应时间30-50分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是以大豆水化油脚为原料制备酶水解磷脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是加入磷脂酶A2的量为1.25毫升酶液/kg反应液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是超声波处理水解反应条件为反应液pH为7.5，超声波屏极电流为0.44A，反应温度50℃，反应时间40分钟。
全文摘要
一种超声波处理酶水解改性制备水解磷脂的方法，属于磷脂改性技术领域。本发明以大豆水化油脚为原料，以磷脂酶A
文档编号C12P9/00GK1824784SQ20051012317
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者王兴国, 刘元法, 金青哲 申请人:江南大学