专利名称：海带配子体固相培养保存方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，尤其是涉及一种大型经济藻类--海带种质的海带配子体固相保存方法。
背景技术：
海带(Laminaria japonica Aresch)是中国重要的经济藻类，海带生活史分两个明显的世代阶段孢子体世代和配子体世代，配子体世代是海带的单倍体阶段，在该阶段将雌配子体和雄配子体单个分离培养，可形成无性繁殖系。20世纪70年代方宗熙等成功分离培养了海带雌雄配子体，建立了无性繁殖系，也称克隆。崔竟进等进行了海带配子体弱光保存的研究，吴超元等提出了适宜配子体克隆生长的因子为温度10-15℃，光照2000-3000lx，N6-8g/m3，P0.8-1g/m3。传统的种质保存技术就是将无性系继代培养保存，传统保存技术具有明显的不足(1)液体培养是唯一的保存途径，手段单一，限制了保存的规模和效率；(2)液体培养保存一般需要在半月内更新一次培养液，工作量大，操作繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的机会；(3)采孢子前无法对种海带进行无菌处理，整个保存过程都在有菌条件下，不能彻底杜绝微生物尤其杂藻的污染；(4)培养中细胞形态异常、单性生殖等现象时有发生，培养因子有待进一步优化。因此，目前的保种技术是一种传统的继代培养保存的方法，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性。
这些缺点限制了海带配子体克隆作为海带育苗与育种主要材料的应用。
发明内容
本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种不使用液体培养保存、保存时间长，后期操作简单，为航天育种技术在海藻的育种中应用提供了可能的海带配子体固相培养保存方法。
本发明的目的是这样实现的，海带配子体固相培养保存方法，是选取海带雌雄配子体克隆进行，其特点是该方法包括以下步骤固相培养的培养基配制、配子体克隆的粉碎、配子体的接种、固相培养、固相保存以及固相培养保存配子体的复苏扩培。
固相培养的培养基配制是0.8-1％琼脂的PESI培养基，高压灭菌，待冷却至60-70℃，加入终浓度为50-150μg/ml卡那霉素，用直径9cm的培养皿倒平板。
配子体克隆的粉碎是取液体培养的配子体克隆簇状体20-40mg，无菌条件下进行超声粉碎，粉碎的条件，功率400W粉碎4-8次、每次8-10s，然后功率200W粉碎10-16次、每次8-10s，将配子体克隆粉碎为1-4个细胞。
配子体的接种是超净台中，用10ml一次性无菌注射器取2ml左右粉碎的配子体细胞，逐点注射入一个平板内，接种后，用param膜密封培养皿。
固相培养是在温度8-10℃，光强1500-2500lx，光时24h；或是温度5℃冷藏柜中，保持自然光照。
固相保存是固相培养3个月后，在琼脂上的藻斑直径为2-3mm、表面略显干燥、配子体克隆进入休眠状态时，在琼脂上加入4-5ml水，将培养皿转入5℃冷藏柜中，进入保存程序，每半月观察一次，三个月换水一次。
固相培养保存配子体的扩培是取琼脂上生长的藻斑于PESI液体培养基中，在温度8-10℃、光强1500-2500lx、光时24h的条件下复苏2天，然后取出，用机械法磨碎，再次放入PESI液体培养基中培养即可，30天长成簇状体后可再次粉碎扩培。
本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果采用本发明方法在温度8-10℃，光强1500-2500lx，光时24h条件下，固相培养3天后，细胞边缘变圆；10天后开始有分支的新分裂的细胞出现；30天后，分支的细胞数为2-3个，分支数与原来细胞数相同，并在分支上出现新的分支；60天后，原分支细胞数4-6个，新分支仍在出现；90天长成簇状体，肉眼观察表现为藻斑；液体对照培养的配子体明显快于固相培养，3天后即出现新分支，10天后分支的新细胞数为4-5个；20天后新分支的细胞数达到2-3个；30天后长成簇状体；固相与液相培养海带配子体生长情况比较见下表。
四、具体实施方案下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1，海带配子体固相培养保存方法，是选取海带品种“早厚成”雌配子体克隆进行，经过固相培养的培养基配制、配子体克隆的粉碎、配子体的接种、固相培养、固相保存以及固相培养保存配子体的复苏扩培；固相培养的培养基配制是0.8-1％琼脂的PESI培养基，高压灭菌，待冷却至65℃，加入终浓度为100μg/ml卡那霉素，用直径9cm的培养皿倒平板；配子体克隆的粉碎是取液体培养的配子体克隆簇状体30mg，无菌条件下进行超声粉碎，粉碎的条件，功率400W粉碎6次、每次9s，然后功率200W粉碎，粉碎12次、每次10s，将配子体克隆基本粉碎为1-4个细胞；配子体的接种是超净台中，用10ml一次性无菌注射器取2ml左右粉碎的配子体细胞，逐点注射入一个平板内，接种后，用param膜密封培养皿；固相培养是在温度8-10℃，光强1500-2500lx，光时24h；固相保存是固相培养3个月后，在琼脂上的藻斑直径为2mm、表面略显干燥、配子体克隆进入休眠状态时，在琼脂上加入4ml水，将培养皿转入5℃冷藏柜中，进入保存程序，每半月观察一次，三个月换水一次；固相培养保存配子体的扩培是取琼脂上生长的藻斑于PESI液体培养基中，在温度8-10℃、光强1500-2500lx、光时24h的条件下复苏2天，然后取出，用机械法磨碎，再次放入PESI液体培养基中培养即可，30天长成簇状体后可再次粉碎扩培。
实施例2，海带配子体固相培养保存方法，是选取海带品种“早厚成”雄配子体克隆进行，经过固相培养的培养基配制、配子体克隆的粉碎、配子体的接种、固相培养、固相保存以及固相培养保存配子体的复苏扩培；固相培养的培养基配制是0.8-1％琼脂的PESI培养基，高压灭菌，待冷却至60℃，加入终浓度为95μg/ml卡那霉素，用直径9cm的培养皿倒平板；配子体克隆的粉碎是取液体培养的配子体克隆簇状体35mg，无菌条件下进行超声粉碎，粉碎的条件，功率400W粉碎8次、每次10s，然后功率200W粉碎粉碎10次、每次8s，将配子体克隆基本粉碎为1-4个细胞；配子体的接种是超净台中，用10ml一次性无菌注射器取2ml左右粉碎的配子体细胞，逐点注射入一个平板内，接种后，用param膜密封培养皿；固相培养是在温度5℃冷藏柜中，保持自然光照；固相保存是固相培养4个月，在琼脂上的藻斑直径为3mm、表面略显干燥、配子体克隆进入休眠状态时，在琼脂上加入5ml水，将培养皿转入5℃冷藏柜中，进入保存程序，每半月观察一次，三个月换水一次；固相培养保存配子体的扩培是取琼脂上生长的藻斑于PESI液体培养基中，在温度8-10℃、光强1500-2500lx、光时24h的条件下复苏2天，然后取出，用机械法磨碎，再次放入PESI液体培养基中培养即可，30天长成簇状体后可再次粉碎扩培。
在本发明固相培养的条件下，3个月藻斑直径可以达到2-3毫米，海带配子体克隆进入休眠状态，加液体培养基后可在冷藏柜中长时间保存，复苏后海带配子体的生物特性保持不变。
权利要求
1.海带配子体固相培养保存方法，是选取海带雌雄配子体克隆进行，其特征是该方法包括以下步骤固相培养的培养基配制、配子体克隆的粉碎、配子体的接种、固相培养、固相保存以及固相培养保存配子体的复苏扩培。
2.根据权利要求1所述的海带配子体固相培养保存方法，其特征是固相培养的培养基配制是0.8-1％琼脂的PESI培养基，高压灭菌，待冷却至60-70℃，加入终浓度为50-150μg/ml卡那霉素，用直径9cm的培养皿倒平板。
3.根据权利要求1所述的海带配子体固相培养保存方法，其特征是配子体克隆的粉碎是取液体培养的配子体克隆簇状体20-40mg，无菌条件下进行超声粉碎，粉碎的条件，功率400W粉碎4-8次、每次8-10s，然后功率200W粉碎10-16次、每次8-10s，将配子体克隆粉碎为1-4个细胞。
4.根据权利要求1所述的海带配子体固相培养保存方法，其特征是配子体的接种是超净台中，用10ml一次性无菌注射器取2ml左右粉碎的配子体细胞，逐点注射入一个平板内，接种后，用param膜密封培养皿。
5.根据权利要求1所述的海带配子体固相培养保存方法，其特征是固相培养是在温度8-10℃，光强1500-2500lx，光时24h；或是温度5℃冷藏柜中，保持自然光照。
6.根据权利要求1所述的海带配子体固相培养保存方法，其特征是固相保存是固相培养3个月后，在琼脂上的藻斑直径为2-3mm、表面略显干燥、配子体克隆进入休眠状态时，在琼脂上加入4-5ml水，将培养皿转入5℃冷藏柜中，进入保存程序，每半月观察一次，三个月换水一次。
7.根据权利要求1所述的海带配子体固相培养保存方法，其特征是固相培养保存配子体的扩培是取琼脂上生长的藻斑于PESI液体培养基中，在温度8-10℃、光强1500-2500lx、光时24h的条件下复苏2天，然后取出，用机械法磨碎，再次放入PESI液体培养基中培养即可，30天长成簇状体后可再次粉碎扩培。
全文摘要
本发明公开了海带配子体固相培养保存方法，是选取海带雌雄配子体克隆进行，包括以下步骤固相培养的培养基配制、配子体克隆的粉碎、配子体的接种、固相培养、固相保存以及固相培养保存配子体的复苏扩培，本发明具有使用液体培养保存、保存时间长，后期操作简单的特点，为航天育种技术在海藻的育种中应用提供了可能。
文档编号C12N5/04GK1793337SQ20051012327
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者唐永政, 张全胜, 张壮志, 孙娟, 金瑜, 王萍 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司, 烟台大学