专利名称：用于培养丝状真菌的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及控制植物病害试剂的技术领域，特别地是涉及用于培养丝状真菌(filamentaryfungi)的培养基，更具体地是涉及用于培养食线虫真菌(nematophagus fungi)的培养基。
背景技术：
使用微生物特别是真菌作为控制植物病害的试剂已日益普及。以真菌为基础的产品已经市场化，该产品用于对抗昆虫、植物真菌或其它农作物寄生虫类。
例如，美国专利5 811 092描述了用于杀灭线虫的试剂，该试剂能杀灭跟结线虫属(Meloidogyne)、Hetherodera、茎线虫(Ditylenchus)的一类线虫，特别是丝状真菌的Arthrobotrys conoides Dreschsler株。
上述线虫是造成蔬菜和菌类严重疾病的罪魁祸首，并造成了巨大的经济损失，导致50-70％的收割损失。
使用食线虫真菌可作为一种传统的在耕作之前施用在土壤中的抗寄生物化学药剂(例如溴化甲烷、三氯硝基甲、二氯丙烯等)或直接作用于农作物的氨基甲酸盐的替代物。这些抗寄生物的化学药剂和氨基甲酸盐会引起一系列问题，例如土壤不育、破坏生态平衡以及潜在的对人和动物的毒性，因此需避免使用。
因而，食线虫真菌特别合适用于有机农业中，但由于它仍需要相当高的成本，因此，难于工业性地高产量生产。
这样，所以，需要获得一种廉价的食线虫真菌可用于农业生产中。
本发明需要解决的问题就是提供一种用于培养丝状真菌、特别是食线虫真菌的培养基，该培养基允许这样的微生物在工业水平、快速、高产量地生长，从而降低终产物的生产成本。
发明内容
根据本发明提供的一种用于培养丝状真菌的培养基，上述问题已被解决。该培养基包括至少一种碳源，该碳源选自糖蜜、麦精和蔗糖；以及至少一种有机氮源，该有机氮源选自酵母提取物和玉米浆。
更适宜的是，上述的至少一种碳源的重量含量为所述培养基的干重的70-85％，上述的至少一种氮源的重量含量为所述培养基的干重的15-30％。
根据本发明所述的培养基还可以包括矿物氮源，硝酸铵或铵盐。上述矿物氮源通常是在真菌生长时期逐渐加入到培养基而总量不高于所述培养基干重的10％，通常重量含量在5-8％之间。
本发明所述培养基的优选的成份为由75-85％的麦精，和15-25％(该百分率—如本说明书的其余部分所描述的一样—是培养基的干重的重量百分含量)的酵母提取物组成。
根据本发明的另一种优选的培养基含有60-65％糖蜜，10-15％蔗糖，10-15％的玉米浆，10-15％的酵母提取物。优选地，该培养基还含有5-8％的矿物氮源，特别是磷酸氢二铵。
根据本发明，另一种优选的培养基含有两种碳源，即重量含量为25-30％的麦精和重量含量为40-45％的糖蜜，以及重量含量为25-30％的玉米浆。
具体实施例方式
本发明将根据实施例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。
在对实施例描述前，我们认为，提供一些关于培养基的成份的说明将有助于理解本发明。
麦精和/或糖蜜和/或蔗糖被用作为碳源。
麦精是由谷类作物(通常是大麦)的芽得到的。在萌芽时，产生特殊的酶(淀粉酶)，其能将淀粉转化为糖类。所述麦精含有大约60％的麦芽糖，维生素以及众多微量元素。
糖蜜是工业糖的副产物，为黑褐色的黏性液体，含有10％的水，35％的蔗糖，20％的其它糖和15％灰渣物质。
酵母提取物和玉米浆用作有机氮源。
酵母提取物是通过啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的自我分解得到的，为淡黄色的精细粉末，易溶于水。该酵母提取物含有多肽、游离氨基酸、嘌呤和嘧啶基，以及可溶于水的维生素B族。所述酵母提取物具有10％的总氮含量以及5％α-amminic氮含量。
所述玉米浆是通过在50℃将玉米浸泡在含有二氧化硫的水中24-48小时而得到的。在浸泡时该反应物允许围绕在淀粉周围的蛋白质网状物变性并对抑制不合需要的微生物的增长提供有利条件。所述玉米浆的总氮含量为7％，α-amminic氮含量为1.7％，并还含有5％的糖、4％的钾、3％的磷以及17％的各种矿物质。
上述所提到的各种基于碳源和氮源的培养基已通过测试。这些培养基能可以分成以下三类-第1类以麦精作为主要碳源的培养基；-第2类以糖蜜作为主要碳源的培养基；-第3类以麦精和糖蜜作为主要碳源的培养基。
根据本发明所述培养基的有机氮源的含量可以减少，可用无机氮源(硝酸铵或无机氮化合物)替代部分所述的有机氮源，在培养时小量地逐步加入到培养基中。
在培养时添加的无机氮可提供予微生物更好的营养，并且，对于丝状真菌而言，能加固其菌丝体。
用无机氮源替代部分所述的有机氮源还具有降低产物成本的优点，因为有机氮源(酵母提取物和玉米浆)是本发明所述培养基中最昂贵的成份。
根据本发明所述的培养基特别适合于Moniliales(丛梗孢目)族中的丝状真菌的培养，特别地，在以下的实施例中，Arthrobotrys conoides Dreschsler丝状真菌将被用到。
实施例1有关第1类的培养基丝状真菌生长在含有150ml培养基的300ml Erlen烧瓶中。
培养基中含有20g/l的麦精和4g/l的酵母提取物，该培养基在接种真菌孢子之前已被灭菌。
接种后在27℃培养6天。从开始后的第三天，在培养基中取样去检测干重(g/l)和繁殖体的数量(CFU/l)。为了检测干重，20ml的培养基被过滤并被在干燥箱中100℃干燥24小时。在1ml的培养基中测定繁殖体的数量。
总的结果可从以下表1得到表1
实施例2重复实施例1的试验，试验在含有1.2升如实施例1所述的培养基、容量为2升的袖珍型反应器中进行。试验条件和实施例1一样，唯一不同的是在孢子接种后的第一天开始取样。
所述袖珍型反应器是具有圆形底部、刀片式搅拌器、加热和冷却装置、鼓风装置以及pH测量计和温度计的容器。
总的结果可从以下表2得到
表2
实施例3有关第2类的培养基丝状真菌在含有150ml培养基的300ml Erlen烧瓶中进行培养。
培养基中含有25g/l的糖蜜和5g/l的蔗糖，5g/l的玉米浆，5g/l的酵母提取物。该培养基在接种真菌孢子之前已被灭菌。
接种后在27℃培养6天。
开始后的第三天，在培养基中取样去检测干重(g/l)和繁殖体的数量(CFU/l)。为了检测干重，20ml的培养基被过滤并被在干燥箱中100℃干燥24小时。在1ml的培养基中测定繁殖体的数量。
总的结果可从以下表3得到表3
实施例4重复实施例3的试验，试验在含有1.2升如实施例3所述的培养基、容量为2升的如实施例2所述的袖珍型反应器中进行。试验条件和实施例3一样，唯一不同的是在孢子接种后的第天开始取样。
总的结果可从以下表4中得到表4
结果表明，从第5天开始，可能会出现异常，但这仅仅是由于培养基中的真菌过度密集而引起的，这样不允许再采取相似的样本。
最后的样本直接来自反应器。
这样，在第7天时，每升培养基中可获得具有3.77×109繁殖体的、多于10g的真菌。
实施例5丝状真菌培养在含有150ml的培养基的300ml Erlen烧瓶中。
培养基中含有15g/l糖蜜膏、10g/l的麦精和10g/l玉米浆，该培养基在接种真菌孢子之前已被灭菌。
接种后在大约27℃培养6天。从开始后的第三天，在培养基中取样检测干重(g/l)和繁殖体的数量(CFU/l)。为了检测干重，20ml的培养基被过滤并被在干燥箱中100℃干燥24小时。在1ml的培养基中测定繁殖体的数量。
总的结果可从以下表5中得到
表5
实施例6重复实施例5的试验，试验在含有1.2升如实施例5所述的培养基、容量为2升的如实施例2所述的袖珍型反应器中进行。试验条件和实施例5一样，唯一不同的是在孢子接种后的第一天开始取样。
总的结果可从以下表6中得到表6
在第7天中，每升培养基中可获得含有2.22×109繁殖体的、多于10g的真菌。
实施例7为了减少两种价格最昂贵的有机氮成份的含量，实施例3所述的培养基改良如下25g/l糖蜜，5g/l蔗糖、2.5g/l玉米浆、2.5g/l的酵母提取物。
利用这样的培养基，通过上述真菌类，培养试验(A)与另两个培养试验(B and C)做比较，培养试验(B and C)中用了同样的培养基，以及随后从第四天开始在培养基中加入矿物氮源。
在试验B中，0.21g的磷酸氢二铵从第四天起(最好是第4天、第6天、第8天)加入三次，总的添加量为0.63g。在试验C中分三次加入磷酸氢二铵，每次0.28g，同样是从第四天起(最好是第4天、第6天、第8天)，总的添加量为0.84g。
该试验在500ml Erlen烧瓶中进行，并且含有300ml培养基的烧瓶在接种真菌孢子前灭菌。
在第9天和最后一天培养中，试验(A)中培养基总氮含量相等于0.85g/l，而加入了磷酸氢二铵的培养基中，总氮含量分别等于1.05g/l(A)，1.26g/l(B)。
从开始后的第三天起，从培养基中每隔一天取样测定干重(g/l)和繁殖体的数量(CFU/l)。为了检测干重，20ml的培养基被过滤并被在干燥箱中100℃干燥24小时。在1ml的培养基中测定繁殖体的数量。
总的结果可从以下表7中得到表7
MS＝干重(g/l)。
CFU＝繁殖体/升可从以上表中看出，从培养的第七天起，在相同的培养时间内，因为添加了无机氮源，特别是少量(试验B)的添加，从而相当可观地提高了干重，并且，繁殖体数量的增加大于100％。
权利要求
1.一种用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，该培养基包含至少一种碳源，该碳源选自糖蜜、麦精和蔗糖；以及至少一种有机氮源，该有机氮源选自酵母提取物和玉米浆。
2.根据权利要求1所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述的至少一种碳源的重量含量为所述培养基干重的70-85％，所述的至少一种氮源的重量含量为所述培养基干重的15-30％。
3.根据权利要求1或2所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述的培养基还包含矿物氮源。
4.根据权利要求3所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述矿物氮源的重量含量不高于所述培养基干重的10％，优选在5-8％之间。
5.根据权利要求3或4所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述矿物氮源为硝酸铵或铵盐。
6.根据权利要求1或2所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，培养基为由重量含量为75-85％的麦精和15-25％的酵母提取物组成，所述重量含量是所述培养基干重的重量百分比。
7.根据权利要求1或2所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述培养基包含有60-65％糖蜜，10-15％蔗糖，10-15％的玉米浆，10-15％的酵母提取物。
8.根据权利要求7所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述培养基还含有5-8％的矿物氮源。
9.根据权利要求8所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述的矿物氮源是磷酸氢二铵。
10.根据权利要求1或2所述的用于培养丝状真菌的培养基，其特征是，所述培养基包括重量含量为25-30％的麦精、40-45％的糖蜜，以及25-30％的玉米浆，所述重量含量为所述培养基干重的重量百分比。
11.一种在工业水平培养丝状真菌—特别是食线虫真菌的方法，其特征是，包括以下步骤在如权利要求1和2所述的培养基中接种所述真菌的孢子；所述培养基在23-27℃培养5-10天；测定所述真菌的繁殖和生长量。
12.根据权利要求11所述的培养方法，其特征是，还进一步包括，从真菌孢子接种后的第4天起逐渐加入小量的矿物氮源。
13.根据权利要求11所述的培养方法，其特征是，所述矿物氮源选自硝酸铵和铵盐，其加入的总量不高于所述培养基干重的10％，优选在5-8％之间。
全文摘要
本发明公开了一种用于培养丝状真菌的培养基，该培养基含有至少一种碳源，该碳源选自糖蜜、麦精和蔗糖；以及至少一种有机氮源，该有机氮源选自酵母提取物和玉米浆。本发明还公开了一种在工业水平培养丝状真菌－特别是食线虫真菌的方法，该方法包括以下步骤在如权利要求1和2所述的培养基中接种所述真菌的孢子；所述培养基在23－27℃培养5－10天；测定所述真菌的繁殖和生长量。
文档编号C12N1/14GK1926230SQ200580004379
公开日2007年3月7日 申请日期2005年2月8日 优先权日2004年2月11日
发明者伊丽莎白·潘卡-米拉贝尔 申请人:卡萨勒尿素股份有限公司