专利名称：：用于纯化肉毒毒素的不含动物产物的系统和方法交叉引用本申请是于2005年3月3日提交的名称为“梭菌培养基及获得梭菌毒素的方法”(PingWang和StephenDonovan)、尚未获得申请号的美国专利申请的部分继续申请，后者是2003年9月25日提交的美国申请系列号10/672,876的部分继续申请，这些申请的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。
背景技术：
：本发明涉及纯化梭菌毒素的系统和方法。具体地说，本发明涉及纯化肉毒神经毒素的色谱方法。适于为治疗、诊断、研究或美容目的而施用于人或动物的药物组合物可包含活性成分。药物组合物还可包括一种或多种赋形剂、缓冲液、载体、稳定剂、防腐剂和/或填充剂。药物组合物中的活性成分可为生物成分，如肉毒毒素。用于制备肉毒毒素药物组合物的肉毒毒素活性成分可通过多步骤培养、发酵和配制工艺获得，这些工艺利用了一种或多种动物来源的产物(如用于获得原料(bulk)肉毒毒素的一种或多种生长培养基和发酵培养基中的肉汤培养基和酪蛋白成分，和最终配制的肉毒毒素药物组合物中的血液组分或血液来源的赋形剂)。如果将一种通过利用动物来源产物的工艺获得活性生物成分的药物组合物施用于患者，可使该患者承受接受多种病原体或传染物的潜在危险。例如朊病毒可存在于药物组合物中。朊病毒是蛋白质感染颗粒，人们猜测这种颗粒是作为产生正常蛋白质的相同核酸序列所产生的异常构象同种型出现的。人们进一步猜测在翻译后水平正常同种型蛋白向朊病毒蛋白同种型的“募集反应”中存在感染性。似乎是正常内源性细胞蛋白被诱导，错误折叠成病原性朊病毒构象。克雅氏病(Creutzfeldt-Jacobdisease)是一种罕见的神经变性疾病——人传染性海绵状脑病，其传染物显然是一种朊病毒蛋白异常异构体。患克雅氏病的个体可在六个月内从完全健康恶化成运动不能性缄默症(akineticmutism)。因此，施用含有用动物来源产物获得、纯化或配制的生物成分(如肉毒毒素)的药物组合物，可能存在患朊病毒介导疾病(如克雅氏病)的潜在危险。肉毒毒素根据形态学和功能的分类，梭菌属有超过127个种类。厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)产生一种强效多肽神经毒素，即肉毒毒素，它能在人和动物身上引起一种被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌及其孢子通常存在于土壤中，并且该细菌可在家庭式罐头厂未适当消毒和密封的食品容器中生长，这是导致多起肉毒中毒的原因。肉毒中毒作用通常出现于食用被肉毒梭菌培养物或孢子感染的食品后的18～36小时。肉毒毒素似乎能不衰减地穿过肠内膜(lining)并侵袭外周运动神经元。肉毒毒素中毒的症状逐渐从行走、吞咽、语言困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。A型肉毒毒素是人类已知的最致命的天然生物毒素。A型肉毒毒素(纯化的神经毒素复合物)在小鼠的LD50为大约50皮克。以摩尔计算，A型肉毒毒素的致死力比白喉强18亿倍，比氰化钠强6亿倍，比眼镜蛇毒素强3千万倍、比霍乱强1200万倍。Singh，CriticalAspectsofBacterialProteinToxins，NaturalToxinsII，B.R.Singhetal.主编，PlenumPress，NewYork(1976)的63-84页(第四章)(其中根据约0.05ngBOTOX等于1U的事实对所述A型肉毒毒素的LD50为0.3ng等于1U进行了校正)。BOTOX是纯化的神经复合物A型肉毒毒素的商标，可从CaliforniaIrvine的Allergen公司购得。一单位(U)肉毒毒素的定义是腹腔注射每只重约18到20克的雌性SwissWebster小鼠的LD50。换句话说，一单位的肉毒毒素是将一组雌性SwissWebster小鼠的50％杀死的肉毒毒素量。已经鉴定了七种常规免疫性不同的肉毒神经毒素它们分别为A、B、C1、D、E、F和G血清型肉毒神经毒素，各种血清型通过用类型特异性抗体中和区分。不同血清型肉毒毒素在它们所感染的动物种类和引起的麻痹的严重性和持续时间方面是不同的。例如，根据对大鼠麻痹产生率的测定，测得A型肉毒毒素效力比B型肉毒毒素强500倍。此外测得B型肉毒毒素以480U/kg的剂量用在灵长类动物身上是无毒的，这个剂量是A型肉毒毒素对灵长类动物LD50的12倍。肉毒毒素似乎以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，并被移位至神经元，阻断乙酰胆碱的突触前释放。肉毒毒素在临床上已用于如以骨骼肌机能亢进为特征的神经性肌肉病症的治疗。A型肉毒毒素已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗12岁以上患者的自发性睑痉挛(essentialblepharospasm)、斜视、侧面面肌痉挛和治疗颈部肌张力障碍和眉间线(面部)皱纹。FDA还已批准B型肉毒毒素用于治疗颈部肌张力障碍。A型肉毒毒素外周注射(即肌内注射或皮下注射)的临床效果通常显现于其注射一周内，常显现于注射后几小时内。A型肉毒毒素单次肌内给药到症状缓解(即松弛肌肉麻痹)的典型持续时间约为三至六个月。尽管所有的肉毒毒素血清型在神经肌接头处能明显抑制神经递质乙酰胆碱的释放，但它们通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点裂解这些蛋白起到抑制作用。A型肉毒毒素是一种锌内肽酶，它能特异性地水解细胞内与囊泡相关的蛋白SNAP-25的肽键。E型肉毒毒素也裂解25千道尔顿(kD)的突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但是与A型肉毒毒素相比它靶向该蛋白内不同的氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素作用于囊泡相关蛋白(VAMP，也叫小突触泡蛋白)，每种血清型在不同的位点裂解蛋白。最后，C1型肉毒毒素表现为裂解突触融合蛋白和SNAP-25。这些作用机制的不同可能影响各种肉毒毒素血清型相对效力和/或作用的持续时间。不论何种血清型，毒素中毒的分子机制相似并包括至少三个步骤或阶段。在该过程的第一步中，毒素通过重链(H链)和细胞表面受体间特异的相互作用与靶神经元的突触前膜结合；认为该受体对于每种肉毒毒素血清型是不同的。H链的羧基末端片段(HC)显示出对毒素靶向于细胞表面很重要。在第二步中，毒素跨过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用(endocytosis)被细胞吞食，并且形成含有毒素的内涵体。然后毒素脱离内涵体进入细胞胞质。认为此最后一步是通过H链氨基末端(HN)介导的，它引发适应pH约为5.5或以下的毒素构象改变。已知内涵体有能够降低内涵体内pH的质子泵。构象变化暴露出毒素内的疏水残基，这使得毒素将自身嵌入内涵体膜中。然后毒素穿过内涵体膜转移至细胞溶胶。肉毒毒素活性机制的最后一步表现为涉及连接重链(H链)和轻链(L链)的二硫键的还原。肉毒和肉毒毒素的全部毒性活性都包含在全毒素的L链上；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它能够选择性裂解蛋白，这些蛋白对于含有神经递质的囊泡和质膜的胞浆侧表面的识别与对接，以及囊泡与质膜的融合都是必要的。肉毒神经毒素——B、D、F和G型肉毒毒素引起一种突触体膜蛋白即小突触泡蛋白(也叫囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解。上述任何一种切割活动中都会导致大部分存在于突触囊泡的胞质表面的VAMP被去除。每种毒素特异地降解不同的键。对于所有七种已知的肉毒毒素血清型来说，肉毒毒素蛋白的分子量大约为150kD。有趣的是，梭状芽孢杆菌以包括150kD的肉毒毒素蛋白和一种或多种相关非毒素蛋白复合物的形式释放肉毒毒素。因此，A型肉毒毒素复合物是以900kD、500kD和300kD(近似分子量)的形式由梭状芽孢杆菌产生的。B和C1型肉毒毒素似乎是仅以500kD复合物的形式产生的。肉毒毒素D型是以300和500kD复合物的形式产生的。最后，E型和F型肉毒毒素仅以约300kD复合物的形式产生。认为这些复合物(即分子量大于约150kD)含有非毒素血凝素蛋白和非毒素与无毒性非血凝素蛋白。因此，肉毒毒素复合物可包括肉毒毒素分子(神经毒素成分)和一种或多种无毒性血凝素蛋白和/或非毒素非血凝素蛋白(后者可被称为NTNH蛋白)。这两类非毒素蛋白(与肉毒毒素分子一起构成相关的神经毒素复合物)可能起到为防止肉毒毒素分子变性提供稳定性，和在毒素被消化时保护毒素抵抗消化酸的作用。此外，可能较大(大于约150kD分子量)的肉毒毒素复合物会使得肉毒毒素从肉毒毒素复合物肌肉注射位点的扩散速度较慢。可通过在pH7.3.用血红细胞处理或在pH约7-8的合适的缓冲液中使复合物经过分离方法如柱色谱，将毒素复合物解离为毒素蛋白和血凝素蛋白。除去血凝素蛋白之后，肉毒毒素蛋白具有明显的不稳定性。所有的肉毒毒素血清型均由天然肉毒梭菌作为无活性单链蛋白产生，无活性单链蛋白须由蛋白酶裂解或切割成神经活性的。产生A和G血清型的肉毒毒素的菌株有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反，C1、D和E血清型肉毒毒素是由非蛋白水解菌株产生的，因此当从培养物中回收时一般是无活性的。蛋白水解菌株和非蛋白水解菌株均产生B型和F型，因此这两种血清型可以活性形式或非活性形式被回收。然而，即使是产生例如肉毒毒素B型的蛋白水解株也只裂解所产生的毒素的一部分。切割的和未切割的分子的精确比例取决于孵育时间和培养温度。因此，例如，B型肉毒毒素的任何制剂中，可能都有一部分是无活性的，这可能能够解释所知的B型肉毒毒素的效力比A型肉毒毒素低得多。临床制剂中无活性肉毒毒素分子的存在会增加制剂总蛋白负荷这会导致抗原性增加，而未提高临床疗效。另外已知，肌内注射后，B型肉毒毒素比相同剂量水平的A型肉毒毒素的活性持续时间短，效力也弱。体外研究表明，肉毒毒素抑制钾阳离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织原代培养物中释放。此外，已有报道，肉毒毒素抑制从脊髓神经元原代培养中引发释放甘氨酸和谷氨酸，并且它在脑部突触体的标本中抑制神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸的释放。A型肉毒毒素治疗多种临床病症的成功引起了人们对其它肉毒毒素血清型的兴趣。因此至少A、B、E和F型肉毒毒素已在临床上用于人身上。此外纯的肉毒毒素(大约150kDa)已用于对人的治疗。见如KohlA.，etal.，ComparisonoftheeffectofbutuliumtoxinA(Botox(R))withthehighly-purifiedneurotoxin(NT201)intheextensordigiturumbrevismuscletest，MoVDisord2000；15(Suppl3)165.因此，肉毒毒素药物组合物可用纯(大约150kDa)肉毒毒素制备，而不用肉毒毒素复合物制备。A型肉毒毒素已知可溶于pH4-6.8的稀释的水溶液中。pH约在7以上时，尤其当pH和温度升高时，起稳定作用的非毒素蛋白从神经毒素解离，导致毒性逐渐丧失。SchantzE.J.，etal.PreparationandcharacterizationofbotulintumtoxintypeAforhumantreatment(尤其44-15页)，Jznkovic，J.，etal，TherapywithBotulinumToxin，第三章，MarcelDeckker，Inc(1994)。与通常的酶一样，肉毒毒素(为细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于其三维构象。因此，通过加热、多种化学药品的表面延伸(surfacestretching)和表面干燥可使A型肉毒毒素丧失毒性。此外，已知经已知的培养、发酵和纯化后，得到的用于药物组合物溶液的毒素浓度降低很多，除非有合适的稳定剂存在，否则毒素迅速去毒。将毒素从毫克量稀释到每毫升含纳克量的溶液存在很大的困难，因为经上述高度稀释后，毒素会迅速失去特异性毒性。由于可能在制成含有毒素的药物组合物数月或数年后才使用所述毒素，因此可用稳定剂，如白蛋白和明胶使毒素稳定。据报道，肉毒毒素A型应用于临床的情况如下(1)每肌肉注射(多块肌肉)约75-125单位的BOTOX治疗颈部肌张力障碍；(2)每肌肉注射5-10单位BOTOX治疗眉间线(眉沟)(降眉间肌肌肉注射5单位，各皱眉肌肌肉注射10单位)；(3)耻骨直肠肌括约肌内(intrasphincter)注射约30-80单位的BOTOX治疗便秘；(4)向上眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌和下眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌分别肌肉注射约1～5单位的BOTOX以治疗睑痉挛。(5)向眼外肌肌肉注射约1～5单位的BOTOX以治疗斜视，注射的量根据待注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹的程度(即所需矫正的屈光度)变化。(6)为治疗中风后的上肢痉挛，按照如下方式向五块不同的上肢屈肌肌肉注射BOTOX(a)指深屈肌7.5U～30U(b)指浅屈肌7.5U～30U(c)尺侧腕屈肌10U～40U(d)桡侧腕屈肌15U～60U(e)肱二头肌50U～200U。对各指定的五块肌肉在同一治疗期进行注射，因此患者在每一治疗期接受90U至360U的BOTOX的上肢屈肌肌肉注射。(7)颅骨膜注射(对称注射至眉间肌、额肌和颞肌)25U的BOTOX以治疗偏头痛，在25U注射后三个月以上的时间段内，通过对偏头痛发作频率、最严重程度、相关呕吐和急性药物使用的下降水平的测量，发现注射作为偏头疼的预防性治疗，与赋型药物治疗相比有明显的益处。。已知A型肉毒毒素的效力可高达12个月(EuropeanJ.Neurology6(Supp4)S111～S1151999)，在某些情况下可长达27个月。TheLaryngoscope1091344-13461999。然而，Botox肌肉注射的效力维持时间一般为约3～4个月。市售的含有肉毒毒素的药物组合物以BOTOX的商标(由Irvine的Allergan，Inc.，Canifornia提供)出售。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素复合物、人血清白蛋白和氯化钠组成，包装成灭菌的真空干燥的形式。A型肉毒毒素由生长于含N-Z氨基酪蛋白和酵母提取物的培养基中的肉毒杆菌Hall株培养物制得。A型肉毒毒素复合物通过一系列酸或酸和乙醇沉淀从培养溶液中纯化为晶状的复合物，所述复合物由高分子量的活性毒素蛋白和相关的血凝素蛋白组成。晶状复合物重新溶解在含有盐和白蛋白的溶液中，并过滤除菌(0.2微米)然后真空干燥。BOTOX可在肌肉注射前用不含防腐剂的无菌盐水配制。每小瓶BOTOX含有约100单位(U)的A型肉毒毒素复合物，0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，为无菌、真空干燥形式并且无防腐剂。将适量的稀释液抽取到尺寸适中的注射器中，用无防腐剂的无菌生理盐水(0.9％的氯化钠注射液)重新配制真空干燥的BOTOX。由于BOTOX可能因起泡或类似的剧烈搅拌而变性，因此应将稀释液轻轻注射到小瓶中。重新配制的BOTOX可存放于冰箱中(2℃到8℃)，呈澄清、无色液体且无颗粒物质。据报道，重溶后冷藏的BOTOX能维持其效力至少大约三十天。参见例如，GuttmanC.，Botoxretainsitsefficacyforblepharospasmtreatmentafterfreezingandstorage，NewYorkinvestigatorsfind，EuroTimes2000Noc/Dec；5(8)16.真空干燥的产品贮存于-5℃或-5℃以下的冷柜中。一般来讲，识别出了肉毒梭菌的四个生理群(I，II，III和IV)。能够产生血清上不同的毒素的生物体可来自一种以上生理群。例如，B型和F型毒素可由来自I群或II群的菌株产生。另外，已经识别了可产生肉毒神经毒素的其他梭菌种类(巴氏梭菌(C.baratii)，F型；丁酸梭菌(C.butyricum)，E型；诺氏梭菌(C.novyi)，C1或D型)的菌株。肉毒梭菌类型的生理分组列于表1中。表1.肉毒梭菌的生理分组这些毒素类型可通过筛选来自适当生理群的肉毒梭菌生物体制备。指定为I群的生物体通常是指具有蛋白水解性且产生A、B和F型肉毒毒素。指定为II群的生物体具有糖分解性且产生B、E和F型肉毒毒素。指定为III群的生物体只产生C和D型肉毒毒素，并且因产生大量的丙酸而区别于I群和II群的生物体。IV群的生物体只产生G型神经毒素。已知可使用基本不含动物产物的特定培养基获得破伤风毒素。参见例如，美国专利6,558,926。但值得注意的是，甚至该专利公开的“不含动物产物”的培养基也使用了细菌蛋白胨(一种肉消化产物)。值得注意的是，通过破伤风梭菌生产破伤风毒素和通过肉毒梭菌生产肉毒毒素需要不同的生长、培养基和发酵参数及注意事项。参见例如，Johnson，E.A.etal.，Clostridiumbotulinumanditsneurotoxinsametabolicandcellularperspective，Toxicon39(2001)，1703-1722。活性肉毒神经毒素的制备使用改进的为人熟知的Schants方法，用于药物组合物的肉毒毒素可由肉毒梭菌厌氧发酵获得(参见例如SchantzE.J.，etal.，Propertiesanduseofbotulinumtoxinandothermicrobialneurotoxinsinmedicine，MicrobiolRev1992Mar；56(1)88-89；SchantzE.J.，etal.，PropertiesandcharacterizationofbotulinumtoxintypeAforhumantreatment的第3章，JankovicJ编著.NeurologicalDiseaseandTherapy.TherapywithBotulinuimToxin(1994)，NewYork，MarcelDekker；1994，41-49页，和；SchantzE.J.，etal.，UseofcrystallinetypeAbotulinumtoxininmedicalresearch，inLewisGSJr，ed.BiomedicalAspectsofBotulism(1981)NewYork，AcademicPress，143-50页)。肉毒梭菌神经毒素(作为纯毒素或肉毒毒素复合物)还可由载有正确基因的重组宿主细胞的厌氧发酵获得。参见例如1999年6月6日颁布予Williams的题为Vaccineforclostridiumbotulinumneurotoxin美国专利5,919,665，和Williams等的于2003年11月20日公布的题为Solublerecombinantbotulinumtoxinproteins美国专利申请20030215468。另外肉毒毒素(150千道尔顿的分子)和肉毒毒素复合物(300kDa至900kDa)可从，例如ListBiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，Canifornia；theCentreforAppliedMicrobiologyandResearch，PortonDown，英国；Wako(日本大阪)以及密苏里州圣路易斯的SigmaChemicals购得。市售的含有肉毒毒素的药物组合物包括BOTOX(含有A型肉毒毒素的纯化神经毒素复合物与人血清白蛋白以及氯化钠，可从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得，100单位瓶装的冻干粉末，使用前用0.9％的氯化钠重溶)、Dysport(在肉毒毒素药用组合物中含有肉毒梭菌A型毒素的血凝素复合物与人血清白蛋白以及乳糖，可从英国贝克郡的IpsenLimited购得，粉末状，使用前用0.9％的氯化钠重溶)，以及MyoBlocTM(一种注射液，含有B型肉毒毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠，pH为约5.6，可从加利福利亚圣地亚哥的SolsticeNeurosciences(以前从爱尔兰都柏林的ElanCorporation购得)购得)。为治疗、诊断、研究、美容目的而适于人类和动物给药的梭菌毒素药物组合物的制备，需要多个步骤。这些步骤包括获得纯化的梭菌毒素和其后配制纯化的梭菌毒素。第一步可为培养梭菌细菌，一般在琼脂板上，在有利于细菌生长的环境中，如在温厌氧环境中进行。培养步骤可获得所需形态及其他特征的梭菌集落。在第二步中所选的梭菌集落可在合适的培养基中发酵。发酵一定时间后，梭菌一般裂解并向培养基中释放梭菌毒素。第三步，可纯化培养基以获得原料或粗毒素。一般，在其它的试剂中用动物来源的酶如DNA酶和RNA酶纯化培养基以得到原料毒素，这些酶用来降解和除去核酸。由此得到的原料毒素是具有高特异活性的高纯度毒素。在适宜的缓冲液中稳定后，原料毒素可与一种或多种赋形剂混合组成适于给药至人体的梭菌毒素药物组合物。梭菌毒素药物组合物还包括一种或多种赋形剂、缓冲液、载体、稳定剂、防腐剂和或填充剂。梭菌毒素的发酵步骤后的培养液中含有完整的梭菌、裂解的细菌、培养基营养成分和发酵副产物。将此培养液过滤以除去粗大的成分如完整的和裂解的细菌，得到澄清的培养液。澄清的培养液包括梭菌和各种杂质，对其进一步纯化以得到浓缩的梭菌毒素，称为原料毒素。使用一种或多种动物来源产物(如奶消化酪蛋白、DNA酶和RNA酶)获得原料梭菌毒素的发酵和纯化方法是已知的。这种用于获得肉毒毒素复合物的已知非APF的方法例子就是Schantz方法。Schantz方法(从开始的细胞培养到发酵和毒素纯化)使用大量的来源于动物的产物，如培养瓶中动物来源的BactoCookedMeat培养基，用于集落生长和选择的哥伦比亚血琼脂板和发酵介质中的酪蛋白。此外，Schantz原料毒素纯化方法用牛来源的DNA酶和RNA酶水解含有毒素的发酵培养基中存在的核酸。已知获得破伤风类毒素的发酵方法减少了动物来源产物的用量(被称为不含动物蛋白或“APF”发酵方法)。参见例如2003年5月6日颁予Demain等的题为Methodforproductionoftetanustoxinusingmediasubstantiallyfreeofanimalproducts的美国专利。获得梭菌毒素的APF发酵方法具有减少(已非常低)病毒、朊病毒或其它不期望的成分污染随后的原料毒素的可能性的潜在优势，当制成用于给药至人体的药物组合物时，那些成分就会与活性药物组成成分梭菌毒素共存。已知用色谱法纯化梭菌毒素。例如1.OzutsumiK.，etal.，Rapid，simplifiedmethodforproductionandpurificationoftetanustoxin，App&EnvronMicro，Apr.1985，p939-943，vol49，no.4.(1985)公开用高效液相凝胶色谱(HPLC)纯化破伤风毒素。2.SchmidtJ.J.，etal.，PurificationoftypeEbotulinumneurotoxinbyhigh-performanceionexchangechromatography，AnalBiochem1986Jul；156(1)213-219公开了用分子排阻色谱或离子交换色谱纯化E型肉毒毒素，还公开了用硫酸鱼精蛋白代替核糖核酸酶(RNA酶)。3.SimpsonL.L.，etal.，Isolationandcharacterizationofthebotulinumneurotoxins。SimpsonLL；SchmidtJJ；MiddlebrookJL，在HarsmanS主编的MethodsinEnzymology.Vol.165，MicrobialToxinsToolsinEnzymologySanDiego，CAAcademicPress；165卷76-85页(1988)中公开了用重力流动色谱、HPLC、亲和树脂捕获步骤、分子排阻色谱和离子交换色谱(阴离子和阳离子)(包括用两种不同的离子交换色谱柱)纯化肉毒神经毒素。公开了各种Sephadex、Sephacel、Trisacryl、S和Q柱。4.ZhouL.，etal.，ExpressionandpurificationofthelightchainofbotulinumneurotoxinAAsinglemutationabolishesitscheavageofANAP-25andneurotoxicityafterreconstitutionwiththeheavychain，Biochemistry1995；34(46)15175-81(1995)公开了用直链淀粉亲和柱纯化肉毒毒素轻链融合蛋白。5.KannanK.，etal.，MethodsdevelopmentforthebiochemicalassessmentofNeuobloc(botulinumtoxintypeB)，MovDisord2000；15(Supp2)20(2000)公开了用分子排阻色谱分析B型肉毒毒素。6.WangY-c，ThepreparationandqualityofbotulinumtoxintypeAforinjection(BTXA)anditsclinicaluse，DermatolLasFaciCosmSurg2002；58(2002)公开用离子交换色谱纯化A型肉毒毒素。此参考文献公开沉淀和色谱技术相结合。7.JohnsonS.K.，etal.，Scale-upofthefermentationandpurificationoftherecombinationheavychainfragmentCofbotulinumneurotoxinserotypeF，expressedinPichiapastroris，ProtainExprandPurif2003；32；1-9(2003)公开用离子交换色谱和疏水作用柱纯化F型肉毒毒素的重组重链片断。8.出版的美国专利申请20030008367A1(Oguma)公开用离子交换和乳糖柱纯化肉毒毒素。以上总结的纯化方法一般是关于研究或实验室级别的方法，而不是放大到工业或商业规模的方法。众所周知，例如凝胶过滤和重力流动色谱的色谱技术不适于作为大规模、可验证(validatable)的cGMP生产方法使用。另外或此外，以上总结的纯化方法是关于纯毒素(即大约150kDa神经毒素分子)，或神经毒性特异性成分，而不是整个900kDa肉毒毒素复合物的小量纯化。正如众所周知的，与仅纯化复合物的一种组分相比，获得具有生物活性的、纯化的肉毒毒素复合物要复杂和困难得多。这是由于，例如，分子较大、易碎、性质不稳定以及特殊的二级、三级和四级分子和复合物构象，而这些构象又是获得具有生物活性和稳定的肉毒毒素复合物所需的。另外，获得适于组成肉毒毒素药物组合物的肉毒毒素的现有的方法(包括商业规模的方法)，包括一系列沉淀步骤将毒素复合物和杂质分离，这些杂质是源自发酵方法与肉毒毒素并存的。值得注意的是，沉淀技术广泛用于生物制药工业以纯化肉毒毒素。例如，用冷醇分离(Cohn’s方法)或沉淀除去血浆蛋白。不幸的是，纯化肉毒毒素的沉淀技术具有低分离度，低产量、难于操作，难于控制和/验证(validate)、难于放大或缩小规模的缺点。因此需要在纯化方法中不用动物来源产物，纯化梭菌毒素发酵介质以获得原料梭菌毒素的APF方法。
发明内容本发明提供了纯化梭菌毒素的多种色谱APF系统和方法。本发明的这些系统和方法，规模大小可变并遵从cGMP。梭菌毒素优选为肉毒毒素，并且最优选为900kDa的A型肉毒毒素复合物。本发明可作为商业、工业级APF纯化方法使用，以纯化从梭菌细菌的独立APF发酵(即在发酵培养基中用大豆代替酪蛋白)中获得的梭菌毒素(如肉毒毒素)。因此，本发明允许替代通常在非APF发酵后进行的非APF纯化(即使用DNA酶和RNA酶的)方法以纯化肉毒毒素。本发明还可用于梭菌的Schantz发酵之后，以本发明公开的APF毒素纯化方法代替Schantz(非APF)纯化方法。与在APF发酵方法后实施本发明相比，不优选在非APF发酵方法后实施本发明，，这是因为本发明已为在APF发酵方法后使用进行了优化。因此本发明范围内的方法，优选与APF发酵结合(在APF之后)使用，由此在需要获得原料梭菌毒素的步骤中进一步减少并且在某些实施方案中排除动物来源产物的使用。显然，APF发酵方法后实施本发明使得基本完全实施APF方法学(发酵和纯化)成为可能。本发明的实施方案提供获得高纯度生物活性的高产量梭菌毒素的系统和方法。本发明通过一种不含或基本不含动物产物的色谱系统和方法，纯化从梭菌如肉毒梭菌发酵得到的澄清培养液来达到此目的。定义本文使用的下述词语或术语具有如下定义。“约”是指以其限定的项、参数或期限包括所述的项、参数或期限的值以上和以下的正或负10％的范围。“给药”或“施用”是指将药物组合物给予(即施用于)受试者的步骤。本文公开的药物组合物为“局部施用”，给药途径为例如肌内(i.m.)、皮内、皮下给药，鞘内给药，颅内、腹膜内(i.p.)给药，局部(经皮)和植入(即植入缓释装置如多聚植入物或微渗泵)途径给药。“不含动物产物”或“基本不含动物产物”分别包括“不含动物蛋白”或“基本不含动物蛋白”，是指不存在或基本不存在血液来源的、血液汇集的或其他动物来源的产物或化合物。“动物”指哺乳动物(如人类)、鸟类、爬行类、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物种类。“动物”不含微生物，如细菌。因此在本发明范围内不含动物产物的培养基或方法或基本不含动物产物的培养基或方法可包括肉毒毒素或肉毒梭菌细菌。例如，不含动物产物的方法或基本不含动物产物的方法是指基本不含或者大体上不含或者完全不含动物来源蛋白(如免疫球蛋白、肉消化产物、肉类副产物和奶或乳制品或消化产物)的方法。因此，不含动物产物的方法的一个实例是不使用肉和乳制品或者肉或乳副产物的方法(如细菌培养或细菌发酵方法)。“肉毒毒素”是指由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及修饰、重组、杂交和嵌合的肉毒毒素。重组的肉毒毒素可具有由非梭菌种类重组产生的肉毒毒素的轻链和/或重链。本文使用的“肉毒毒素”包括血清型A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。本文使用的“肉毒毒素”还包括肉毒毒素复合物(即300、600和900kDa复合物)，以及纯的肉毒毒素(即约150kDa神经毒性分子)，上述二者均用于本发明中的实践中。“纯化的肉毒毒素”定义为与其他蛋白和杂质分离或基本分离的肉毒毒素或肉毒毒素复合物，这些蛋白和杂质在由培养或发酵方法获得肉毒毒素时与肉毒毒素并存。因此，纯化的肉毒毒素是指至少有90％、优选95％以上、最优选99％以上的非肉毒毒素蛋白和杂质被除去。肉毒梭菌C2和C3细胞毒素不是神经毒素，不在本发明范围之中。“梭菌神经毒素”是指由梭菌细菌如肉毒梭菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌产生的或者天然具有的神经毒素，以及通过重组由非梭菌种类制得的梭菌神经毒素。“完全不含”(即术语“由......组成”)是指在所用仪器或方法的检测范围内，检测不到该物质或者不能确定其存在。“实质上不含”(或“实质上由......组成”)是指只能检测到痕量的该物质。“修饰的肉毒毒素”是指与天然的肉毒毒素相比，其至少一个氨基酸被缺失、修饰或替换。此外，修饰的肉毒毒素可为重组制得的神经毒素，或者重组制得的神经毒素的衍生物或片段。修饰的肉毒毒素保留天然肉毒毒素的至少一种生物学活性，如结合肉毒毒素受体的能力，或抑制神经递质从神经元释放的能力。修饰的肉毒毒素的一个实例是轻链来自一种肉毒毒素血清型(如血清型A)，而重链来自另外一种肉毒毒素血清型(如血清型B)的肉毒毒素。修饰的肉毒毒素的另一个实例是与神经递质(如P物质)相耦合的肉毒毒素。“患者”是指接受医疗或兽医治疗的人类或非人类受试者。因此，本发明所公开的组合物可用于治疗任何动物，例如哺乳动物。“药物组合物”是指一种制剂，其中活性成分可为肉毒毒素。词语“制剂”是指在药物组合物中，除了神经毒素活性成分，至少还有另外一种成分(如白蛋白和/或氯化钠)。因此，药物组合物是一种适于对受试者(如人类受试者)诊断性、治疗性或为美容目的给药(即肌内注射或皮下注射或插入贮库(depot)或植入物)的制剂。药物组合物可以是处于冻干或真空干燥的状态；用盐水或水重新配制冻干或真空干燥的药物组合物所形成的溶液；或者不需要重新配制的溶液。活性成分可以是血清型A、B、C1、D、E、F或G型肉毒毒素之一或者肉毒毒素，它们都可天然地由梭菌细菌制备。如上所述，药物组合物可为液体或如通过真空干燥的固体。药物组合物的组成成分可包含于单一组合物(即除了所需的重溶液体，所有组成成分在药物组合物配制之初即存在)，或者作为双组分系统，例如一种使用稀释剂(如盐水)重溶的真空干燥的组合物，其中稀释剂含有在药物组合物配制之初不存在的成分。双组分系统的优点在于它可以引入成分，所述成分在长期与双组分系统的第一组分共同贮存的情况下没有足够的相容性。例如，重溶的赋形剂或稀释剂可包括防腐剂，所述防腐剂可在使用期间(如一周时间的冷藏保存)提供足够的保护以防止微生物生长，而在两年时间的冷冻保存中不存在，因为这期间它可能会使毒素降解。与梭菌毒素或其他成分在长时间内不相容的成分可以这种方式加入即在接近使用时在第二赋形剂中(即在用于重溶液体中)加入。配制肉毒毒素活性成分药物组合物的方法公开于美国专利公开文本20030118598A1中。“基本不含”是指以重量计，占药物组合物的少于1％的水平。“药物制剂”是指可用于治疗并因而减轻病症或疾病(如以外周肌肉的机能亢进(即痉挛状态)为特征的病症或疾病)的制剂。本文使用以下缩写本发明包括纯化梭菌毒素的方法。该方法有四个步骤获得肉毒毒素发酵培养物的样品；培养样品与第一根色谱柱树脂接触使得肉毒毒素被第一根柱捕获；从第一根柱洗脱肉毒毒素；将第一根色谱柱的洗脱液加到第二根柱色谱树脂上，由此获得纯化的肉毒毒素。“肉毒毒素发酵培养物”意为梭菌细菌在其中发酵的发酵培养基，在该培养基中细菌已释放肉毒毒素。肉毒毒素发酵培养物(培养基)的样品优选为发酵培养基的澄清培养物样品。第一根色谱柱和第二根色谱柱可以是不同的柱子，并且两根不同的柱子可通过不同的纯化机理纯化肉毒毒素。例如，第一根色谱柱可以是疏水作用柱且第二根柱子可以是离子交换柱。本发明范围内的纯化梭菌毒素的方法还包括接触步骤之后和洗脱步骤之前将杂质从第一根柱子冲洗下来的步骤。另外，本发明范围内的纯化梭菌毒素方法也包括，上样步骤后将杂质从第二根柱子冲洗下来的步骤。另外，本发明范围内的纯化梭菌毒素的方法还包括将杂质从第二根柱子冲洗下来后从第二根柱子洗脱肉毒毒素的步骤。优选地，本发明范围内的纯化梭菌毒素的方法为APF方法，更优选地为基本不含动物蛋白(“APF”)的方法，更优选地为纯化梭菌毒素如肉毒毒素复合物的实质上为APF的方法。用于本发明范围内的纯化梭菌毒素的方法的肉毒毒素发酵培养物，优选由APF方法而得，更优选由基本不含动物蛋白的方法而得，最优选由实质上不含动物蛋白的方法而得。值得注意的是，本发明范围内的纯化梭菌毒素的方法可提供每10升肉毒毒素发酵培养物每批纯化的肉毒毒复合物的产量大于约50mg。从实施本发明范围内的纯化梭菌毒素的方法中获得的纯化的肉毒毒素复合物具有以下特征外观为白色至灰白色的悬液；每ml洗脱液中的肉毒毒素复合物的浓度为2.0-3.6mg；260nm与278nm处的吸光度比值(A260/A278)小于或等于0.6；特异性效力以MLD50单位/mg计为2.4×107至5.9×107MLD50单位/mg纯化的肉毒毒素；免疫学特征与A型肉毒毒素复合物一致；SDS-PAGE特征符合标准；SEC-HPLC特征为900kDa毒素复合物＞总峰的95％，和；用于获得这样的纯化肉毒毒素复合物的方法稳定、可放大或缩小规模、可验证、和/或遵从cGMP。本发明范围内的纯化梭菌毒素复合物的方法有以下步骤(a)获得肉毒毒素发酵培养物的样品，其中肉毒毒素发酵培养物是由基本不含动物产物的方法得来的。(b)将培养物样品与疏水作用色谱柱树脂接触使得第一根柱子捕获肉毒毒素；(c)将杂质从疏水作用色谱柱中冲洗下来；(d)将肉毒毒素从疏水作用色谱柱中洗脱下来(洗脱步骤在稀释疏水作用色谱柱的洗脱液步骤之前，稀释的洗脱液用于随后的离子交换色谱)；(e)用疏水作用色谱柱的洗脱液(如疏水作用色谱柱的稀释的洗脱液)给离子交换色谱柱树脂上样；(f)将杂质从离子交换色谱柱中冲洗下来，和；(g)将肉毒毒素从离子交换柱中洗脱下来，由此通过基本不含动物产物的纯化肉毒毒素的方法获得纯化肉毒毒素。以上篇幅阐明的APF方法还包括，在获得肉毒毒素发酵培养物样品之后和培养物样品与疏水作用色谱柱树脂接触之前，附加的处理澄清培养物适于疏水作用色谱的步骤。此外以上篇幅阐明的APF方法还进一步包括从疏水作用色谱柱洗脱肉毒毒素后和用疏水作用色谱柱的洗脱液为离子交换色谱柱树脂上样之前，处理疏水作用色谱柱洗脱液适于离子交换色谱的步骤。纯化肉毒毒素的APF方法详细实施方案，该方法包括的步骤(a)获得肉毒毒素发酵培养物样品，其中肉毒毒素发酵培养物是由基本不含动物产物的方法得来的。(b)处理澄清培养物适于疏水作用色谱；(c)将培养物样品与疏水作用色谱柱树脂接触使得第一根柱子捕获肉毒毒素；(d)将杂质从疏水作用色谱柱中冲洗下来；(e)将肉毒毒素从疏水作用色谱柱中洗脱下来；(f)处理疏水作用色谱柱的洗脱液适于离子交换色谱；(g)用处理的疏水作用色谱柱的洗脱液给离子交换色谱柱树脂上样；(h)将杂质从离子交换色谱柱中冲洗下来，和；(i)将肉毒毒素从离子交换柱中洗脱下来，由此通过基本不含动物产物的纯化肉毒毒素的方法获得纯化肉毒毒素。本发明范围也包括纯化梭菌毒素(如A型肉毒毒素复合物)的系统。这种系统包括从发酵培养物中捕获肉毒毒素的第一根色谱柱树脂；从第一根柱子洗脱肉毒毒素的洗脱缓冲液；捕获第一根色谱柱的洗脱液中的肉毒毒素的第二根色谱柱树脂，和；从第二根色谱柱树脂洗脱肉毒毒素的第二种洗脱缓冲液。发明的各方面按以下附图解释或说明。图1标题“N-源(即HySoy和YE)％相对效力和pH”显示肉毒毒素活性测定曲线图(1)左边Y轴小鼠致死剂量50(MDL50)(蓝条)，和；(2)左边Y轴SNAP25活性(红条)，各种APF培养基发酵结束的时间显示在直条顶端，右边Y轴显示的是APF培养基的pH，X轴表示APF培养基的水解的大豆浓度和酵母提取物浓度的重量％。图1所有的培养基还包括以重量计1％的葡萄糖。图2是概括流程图，比较了用于获得肉毒毒素的非APF方法(图2的上半部分)和本发明范围内的用于获得肉毒毒素的APF方法(图2的下半部分)的制备细胞库、培养和发酵步骤。图2省略了收获和纯化的步骤。图3是APF澄清培养物(3.1.1培养物)经丁基SepharoseFastFlow柱疏水作用色谱而得的色谱图。图3的X轴表示通过柱子的液体ml体积(流出液)。Y轴表示在280nm处的以mAU表示的吸光度。图4是图3丁基柱的洗脱液在SPSepherose高效柱的离子交换色谱色谱图。图4中的各轴表示与图3相同。图5A是过图3丁基柱后获得的各组分的还原SDS-PAGE图。图5A的左边竖直标出了递减的千道尔顿分子量(kDa)。图5A沿底部边界的1到8的数字表示上样部分的泳道。图5B是过图3SP柱后获得的各组分的还原SDS-PAGE图。图5B的左边和底部所标与图5A相同。图6是柱后步骤即来自UF/DF、过滤除菌和硫酸铵沉淀的步骤所获得的各组分的还原SDS-PAGE图。图6的左边和底部所标与图5A相同。图7是本发明范围内的APF肉毒毒素色谱纯化工艺的流程图。图8是在发酵培养基中含1重量％的葡萄糖和1重量％的酵母提取物的APF发酵方法中，大豆蛋白浓度对A型肉毒毒素复合物产生的影响。在图8中，X轴表示发酵培养基中特殊水解的大豆蛋白(HySoy)质量百分比浓度，左边的Y轴表示最终纯化的肉毒毒素复合物的效力和右边的Y轴表示完全细胞裂解的百分比，按公式计算。其中OD600最大相当于最大生长时600nm处的光密度，OD600终点发酵收获时600nm处的光密度。具体实施例方式本发明是以发现梭菌毒素能通过不含动物产物的系统和方法纯化为基础的。本发明包括纯化肉毒梭菌神经毒素的不含动物产物的系统和方法。肉毒梭菌神经毒素可以是A型肉毒毒素复合物，如300kD，500kD或900kD(近似分子量)的复合物或它们的混合物。肉毒梭菌神经毒素可以是A、B、C、D、E或G血清型中的任何一种或它们的混合物。此外，该系统和方法可与重组、杂交、嵌合或修饰的肉毒毒素(轻链、重链或两种链一起)结合。很重要的一点是，此处公开的系统和方法可放大，也就是它可用来纯化从工业或商业过程中获得的大量肉毒毒素用于制药生产。而且，该系统和方法还遵从美国CFR(美国联邦法规(unitedstatescodeoffederalregulations))要求的CGMP(认证的药品生产质量管理规范)，亦即它遵从法规要求。经实验，开发出纯化梭菌毒素(如A型肉毒梭菌(Hall菌株)神经毒素复合物)的APF系统和方法。梭菌毒素通过对Schantz发酵方法(非APF方法)或APF发酵方法得到的发酵培养基进行纯化得到。Schantz发酵方法用到动物来源产物。值得注意的是，尽管APF发酵方法能减少或者避免以动物来源产物(如酪蛋白和肉胨)作为培养基的营养成分用于培养和发酵梭菌细菌，但在APF发酵方法之后一般有一个或多个使用动物来源产品(如DNA酶和RNA酶)的纯化步骤。要求纯化发酵培养基以获得原料的梭菌毒素。原料的梭菌毒素(纯毒素或毒素混合物)可用来配制梭菌毒素药物组合物。本发明优选与APF发酵方法结合实施。本发明和APF发酵方法的结合实施使得APF发酵方法和APF纯化方法联合。此外，本发明的系统和方法对APF发酵培养基而非酪蛋白或其它动物蛋白的发酵培养基的操作进行了优化。对非APF发酵实施本发明可导致获得的纯化的肉毒毒素产量较低和/或效力较低。因此，虽然Schantz和APF肉毒毒素纯化方法都用到动物来源产物如用于稳定肉毒毒素的苯甲脒和除去在发酵培养基中与肉毒毒素共存的核酸的DNA酶和RNA酶(参见例如实施例6和7)，但本发明允许可不使用这些动物来源产物纯化肉毒毒素。本发明包含纯化梭菌毒素如肉毒毒素复合物的系统和方法。一般本发明范围内的特定系统与本发明范围内的特定方法联合实施。本发明范围内的系统可包括多个(优选连续的系列)色谱步骤。在本发明范围内的方法可包括将梭菌毒素发酵培养基经过多个色谱柱，由此获得高纯度和高效的梭菌毒素。这种纯化的毒素适于配制梭菌毒素药物组合物。本发明范围内重要的系统和方法参数包括使用的具体的柱子、缓冲液和操作(跑柱)条件。本发明具体实施方案的第一个大步骤是将发酵培养基的澄清培养物加到疏水作用柱上(如丁基SepharoseFastFlow[“FF”]柱)。第一根柱捕获梭菌毒素(如肉毒毒素复合物)并让杂质流出柱子。发现疏水作用柱能从发酵培养基中高效捕获肉毒毒素复合物(具有特定三维和四维结构的大的蛋白)并保留肉毒毒素复合物的生物活性，同时也分离了在发酵培养基中与肉毒毒素共存的杂质(流出)。用合适的缓冲液洗脱疏水作用柱捕获(结合)的梭菌毒素。在本发明具体实施方案的第二个大步骤中，第一根柱流出的洗脱液加到第二根柱上以进一步纯化梭菌毒素。发现，优选地，如果第二根柱对将梭菌毒素和杂质分离提供不同的机制，那么第二根柱色谱步骤可提供更高效的纯化步骤。因此，优选地，第二根色谱步骤优选使用不同的柱子，如SPSepharose高效[“HP”]柱。色谱(柱)步骤之后，从第二根柱子流出的洗脱液然后可进行进一步的处理以获得高纯度的原料肉毒毒素复合物。这些附加步骤包括用超滤和渗滤更换缓冲液、渗滤、过滤除菌和制备纯化的肉毒毒素复合物的硫酸铵悬浮液。本发明包含纯化肉毒毒素的可放大或缩小规模并遵从cGMP的系统和方法，所获得的原料肉毒毒素的特征陈述于表1中。表1纯化的肉毒神经毒素的特征市售的含有肉毒毒素的药物组合物以BOTOX的商标出售(加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.提供)。BOTOX具有以上表1所述的特征。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素复合物、人血清白蛋白和氯化钠，以灭菌、真空干燥的形式包装。A型肉毒毒素由生长于含有N-Z胺类酪蛋白和酵母提取物(即非APF方法)培养基的肉毒梭菌Hall菌株培养物制得。A型肉毒毒素复合物从一系列沉淀步骤(包括酸沉淀)到由高分子量的活性毒素蛋白和相关的血凝素蛋白组成的晶状复合物得到纯化。晶状复合物再次溶解于含有盐和白蛋白的溶液中并过滤除菌，然后真空干燥。BOTOX在肌肉注射前可用不含防腐剂的灭菌盐水重新配制。每瓶BOTOX含有无菌真空干燥形式的约100单位的A型梭菌毒素复合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，并且不含防腐剂。用不含防腐剂的无菌生理盐水(0.9％的氯化钠注射液)，通过将适量的稀释液抽取到尺寸适中的注射器中重新溶解真空干燥的BOTOX。由于BOTOX可能因起泡或类似的剧烈搅拌而变性，因此应将稀释液轻轻地注射到小瓶中。据报道，BOTOX在重溶后三十天或三十天以上给药，其效力几乎无损失。在这段时间内，重溶的BOTOX存于冰箱中(2℃到8℃)。重溶的BOTOX澄清、无色、无颗粒物。真空干燥的产品存于-5℃或-5℃以下的冷柜中。本发明是以发现用于能产生生物活性肉毒毒素的生物体(如肉毒梭菌细菌)培养和发酵的不含或基本不含动物产物或动物副产物的培养基和方法为基础的。得到的肉毒毒素可用于配制肉毒毒素活性成分的药物组合物。因此，本发明公开的生长培养基显著降低了肉或乳制副产物的水平，并且优选的培养基实施方案基本不含这些动物产物。本发明包括令人吃惊的发现，培养肉毒梭菌的培养基不需要动物源性产物，并且尤其是植物源性产物能代替一般在这些培养基中用于肉梭菌生长的动物源性产物。现有用于细菌生长和发酵的培养基包括一种或多种动物来源的成分，如熟肉。依据本发明，肉毒梭菌生长的优选培养基含有的动物来源的成分不超过培养基总重的约5％到约10％。更优选地，在本发明范围内的培养基包含不超过培养基总重的约1％到小于5％的动物来源产物。最优选地，用于生产肉毒毒素的梭菌生长的培养基和培养物完全不含动物来源产物。这些培养基包括但不限于适于小型或大规模的肉毒梭菌发酵的培养基、用于接种种子(第一)培养基和发酵(第二)培养基的肉毒梭菌培养物培养的培养基、以及用于肉毒梭菌长期储存(如原种培养(stockculture))的培养基。在本发明某些优选的实施方案中，用于肉毒梭菌生长和肉毒毒素产出的培养基包括用大豆来源产物代替动物来源产物。另外，可用除去苦味的平原羽扇豆(Lupinuscampestris)种子代替大豆来源产物。已知平原羽扇豆种子中的蛋白含量与大豆极为接近。优选地，这些培养基包括经过水解且可溶于水的大豆或平原羽扇豆来源的产物。然而，不溶性大豆或平原羽扇豆产物也可用于本发明中以替换动物产物。可被大豆或平原羽扇豆产物替换的常用动物来源产物包括牛心浸液(BHI)、动物来源的蛋白胨产物如细菌蛋白胨、水解的酪蛋白、以及乳品副产物如动物奶。优选地，含大豆或平原羽扇豆来源产物用于肉毒梭菌培养的培养基与通常使用的含动物来源产物的生长培养基相似，除了基本上所有的动物来源产物被植物来源产物替换。例如，大豆来源的发酵培养基可包括大豆来源产物，碳源如葡萄糖，盐类如NaCl和KCl，含磷酸盐的成分如Na2HPO4、KH2PO4，二价阳离子如铁和镁，铁粉，以及氨基酸如L-半胱氨酸和L-酪氨酸。用于发酵(第二)培养基接种的肉毒梭菌培养物生长的培养基(即种子培养基或第一培养基)优选包含至少大豆来源产物、盐类来源如NaCl、以及碳源如葡萄糖。本发明提供了一种使用基本不含动物来源产物的培养基培养肉毒梭菌以使肉毒毒素产量最大化的方法。生产肉毒毒素的肉毒梭菌的生长可通过在含大豆副产物代替动物副产物来源的成分的培养基中发酵来进行。发酵培养基的接种菌可来自较小规模的生长培养基(一种种子培养基)。根据发酵步骤的大小和体积不同，为提高菌体量而在种子培养基中连续培养的次数可以不同。为培养适量的用于接种发酵培养基的肉毒梭菌，可进行一步或多步涉及在种子培养基中培养的步骤。对于不含动物来源产物的培养肉毒梭菌的方法来说，优选肉毒梭菌的生长来自贮存于非动物来源培养基中的培养物。贮存的培养物(优选冻干的)通过在含大豆来源的蛋白而不含动物副产物的培养基中培养产生。在发酵培养基中肉毒梭菌的培养可通过将贮存的、冻干的培养物直接接种进行。在本发明优选的实施方案中，肉毒梭菌培养分为两个阶段——种子培养和发酵。这两个阶段都在厌氧环境下进行。种子培养阶段一般用于“扩大”来自贮存培养物的微生物的数量。种子培养阶段的目的是增加可用于发酵的微生物的数量。另外，种子培养阶段可使贮存的培养物中相对来说休眠的微生物复苏并生成活跃生长的培养物。而且，与贮存的培养物相比，通过活跃生长的培养物可更加精确地控制用于接种发酵培养物的活微生物的体积和数量。因此，优选培养用于接种发酵培养基的种子培养物。另外，为了增加用于接种发酵培养基的肉毒梭菌的数量，可进行任何次数的涉及在种子培养基中培养的连续步骤。应该注意，发酵阶段的肉毒梭菌的培养可通过直接将贮存的培养物直接接种来进行。在发酵阶段，将种子培养的含肉毒梭菌的种子培养基的一部分或全部用于接种发酵培养基。优选地，将种子培养阶段大约2～4％的含肉毒梭菌的种子培养基用于接种发酵培养基。发酵在大规模厌氧环境下，用于产生最大数量的微生物(Ljungdahl等，Manualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology(1986)，Demain等编著，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.第84页)。肉毒毒素可使用蛋白纯化领域的普通技术人员熟知的蛋白纯化方法来进行分离和纯化。参见例如Coligan等，CurrentProtocolsinProteinScience，Wiley&Sons；Ozutsumi等，Appl.Environ.Microbiol.49；939-9431985。为了制备肉毒毒素，肉毒梭菌培养物可在用于接种发酵培养基的种子培养基中培养。根据在发酵阶段生产肉毒毒素的规模不同，涉及在种子培养基中培养的连续步骤数可以不同。然而，如前所述，在发酵阶段的培养可从贮存的培养物直接接种来进行。动物来源的培养肉毒梭菌的种子培养基通常包括BHI、细菌蛋白胨、NaCl和葡萄糖。如前所述，可根据本发明制备另一种种子培养基，其中动物来源组分被非动物来源组分替换。例如但不限于，在培养肉毒梭菌和生产肉毒毒素的种子培养基中，大豆来源的产物可替换BHI和细菌蛋白胨。优选地，大豆来源产物可溶于水，并且包含水解的大豆，但肉毒梭菌培养物可在含不溶性大豆的培养基中生长。然而，在可溶性大豆产物制成的培养基中，生长水平和随后的毒素产量均较高。根据本发明，可使用任何来源的大豆来源产物。优选地，大豆为水解大豆并且用非动物酶水解。水解大豆源可从多家厂商购得。它们包括但不限于Hy-Soy(QuestInternational)，Soypeptone(Gibco)，Bac-soytone(Difco)，AMISOY(Quest)，NZsoy(Quest)，NZsoyBL4，NZsoyBL7，SE50M(DMVInternationalNutritionals，Fraser，N.Y.)，以及SE50MK(DMV)。最优选地，水解大豆源为Hy-Soy或SE50MK。其他潜在的水解大豆源也是已知的。根据本发明，种子培养基中Hy-Soy的浓度范围在25～200g/L。种子培养基中Hy-Soy的浓度范围优选在50～150g/L之间。种子培养基中Hy-Soy的浓度最优选大约100g/L。此外，NaCl浓度范围为0.1～2.0g/L。NaCl浓度范围优选为0.2～1.0g/L。种子培养基中NaCl浓度最优选大约0.5g/L。葡萄糖的浓度范围为0.1g/L～5.0g/L。葡萄糖的浓度范围优选为0.5～2.0g/L。种子培养基中葡萄糖的浓度最优选大约1.0g/L。还有对于本发明来说优选而非必需的是，将葡萄糖与种子培养基的其他组分一起高压灭菌。培养前种子培养基的pH范围可为7.5～8.5。例如，肉毒梭菌培养前种子培养基的pH大约8.1。在种子培养基中培养肉毒梭菌可分为一个或多个阶段进行。在种子培养基中培养优选分为两个阶段。在第一阶段，肉毒梭菌培养物悬浮于一定量的种子培养基中，并在34±1℃、厌氧环境下培育24～48小时。第一阶段的培养优选进行大约48小时。在第二阶段，将部分或全部含肉毒梭菌的第一阶段培养基用于接种第二阶段种子培养基以进一步培养。接种后，第二阶段培养基在34±1℃、也在厌氧环境下培育大约1～4天。在第二阶段种子培养基中的培养优选进行大约3天。还优选在使用种子培养基中的最终培养物接种发酵培养基之前，任一阶段的种子培养基中的培养都不导致细胞裂解。培养肉毒梭菌的含动物副产物的标准发酵培养基可基于Mueller和Miller的配方(MM；J.Bacteriol.67271，1954)。含动物副产物的MM培养基的成分中包括BHI和NZ-CaseTT。NZ-CaseTT是可在市面上购买的肽和氨基酸源，它来自酪蛋白(在动物奶中发现的一组蛋白)的酶消化产物。本发明证实，非动物来源产物可替换发酵培养基中的BHI和NZ-CaseTT。例如但不限于，大豆产物可替换用于发酵肉毒梭菌的MM培养基中的动物来源组分。虽然如前所述，不溶性大豆产物也可用于实施本发明，但大豆产物优选为水溶性，且来自水解大豆。根据本发明可使用任何来源的大豆产物。水解大豆优选获自QuestInternational(Sheffield)，商品名Hy-Soy，或者获自DMVInternationalNutritionals(Fraser，N.Y.)，商品名SE50MK。可溶性大豆产物还可从多个来源获得，包括但不限于Soypeptone(Gibco)Bac-soytone(Difeo)，AMISOY(Quest)，NZsoy(Quest)，NZsoyBL4，NZsoyBL7，以及SE50MK(DMVInternationalNutritionals，Fraser，N.Y.)。在本发明另一个优选的实施方案中，用于发酵肉毒梭菌的培养基不含动物副产物，并且包括水解大豆、葡萄糖、NaCl、Na2HPO4、MgSO47H2O、KH2PO4、L-半胱氨酸、L-酪氨酸以及铁粉。正如所公开的种子培养基一样，水解大豆可替换发酵培养基中的动物副产物。这些动物副产物包括BHI和NZ-CaseTT(酶消化的酪蛋白)。生产肉毒毒素的发酵培养基中Hy-Soy的浓度范围优选为大约10～100g/L。Hy-Soy的浓度范围优选为大约20～60g/L。发酵培养基中Hy-Soy的浓度最优选大约35g/L。为使肉毒毒素产量最大，发酵培养基中特别优选的组分浓度是大约7.5g/L葡萄糖；5.0g/LNaCl；0.5g/LNa2HPO4；175mg/LKH2PO4；50mg/LMgSO47H2O；125mg/LL-半胱氨酸；以及125mg/LL-酪氨酸。所用铁粉的量可在50mg/L至2000mg/L范围内。铁粉的量优选在大约100mg/L至1000mg/L范围内。发酵培养基中铁粉的量最优选在大约200mg/L至600mg/L范围内。为使毒素生产水平最高，大豆来源的发酵培养基的初始pH值(高压灭菌前)范围优选在大约5.0至7.1。我们发现控制初始pH可以改善肉毒毒素的收率。发酵培养基的初始pH优选约为7。正如实施例7所阐释的，我们发现如果之后的pH减小并维持在5-5.5，就可获得稳定的肉毒毒素的高产。与对种子培养基叙述的一样，优选包括葡萄糖和铁的发酵培养基的组分一起高压灭菌。优选地，用于培养肉毒梭菌的第二阶段种子培养基的一部分用于接种发酵培养基。发酵在厌氧培养室中大约34.±1℃下持续大约7到9天。通过测量培养基的光密度(O.D.)来监测生长情况。在通过生长测量手段(光密度)测得细胞裂解已持续至少48小时后停止发酵。细胞裂解时，培养基的O.D.值下降。在本发明一个优选的实施方案中，用于长期贮存肉毒梭菌和接种种子培养基的肉毒梭菌培养物在贮存于4℃下之前在豆奶中培养和冻干。冻干保存的动物奶中的肉毒梭菌培养物也可用于制备肉毒毒素。然而，为了保持在整个生产肉毒毒素的方法中培养基基本不含动物副产物，优选肉毒梭菌的初始培养物保存在豆奶中而不是动物奶中。实施例以下实施例阐明包含于本发明中的具体的方法，并非意在限制本发明的范围。除非另行解释，实施例中的“毒素”或“肉毒毒素”是指分子量约为900kDa的A型肉毒毒素复合物。本发明不限于纯化分子量约为900kDa的A型肉毒毒素复合物的系统和方法，同样适用于150kDa、300kDa、500kDa和其它分子量毒素、毒素复合物和肉毒毒素血清型的纯化。实施例1制备不含动物产物的肉毒梭菌种子培养基每1升培养基中使用下列组分制备对照种子培养基NaCl(5g)，细菌蛋白胨(10g)，葡萄糖(10g)，BHI(至1升)，pH8.1(用5NNaOH调节)。每1升培养基中使用下列组分制备试验(不含动物产物)种子培养基NaCl(5g)，大豆蛋白胨(10g)，葡萄糖(10g)，Hy-Soy(35g/升，补足1升培养基液体)，pH8.1(用5NNaOH调节)。实施例2在不含动物产物的种子培养基中培养肉毒梭菌可将冻干的肉毒梭菌培养物悬浮于实施例1的对照和试验种子培养基各1ml之中，分装(每一种种子培养基)于两个试管中，每个试管中装有10ml相应的种子培养基，然后在34℃下培育约24～48小时。然后可用1ml培养物接种于(分别)含40ml种子培养基的125mlDeLongBellco培养瓶。接种的培养物可在Coy厌氧培养箱(CoyLaboratoryProductsInc.，GrassLake，Mich.)中在33℃.±1℃下培育24小时。实施例3制备不含动物产物的肉毒梭菌发酵培养基使用下列成分制备基础发酵培养基，每2升培养基中含葡萄糖(15g)，NaCl(10g)，NaH2PO4(1g)，KH2PO4(0.350g)，MgSO47H2O(0.1g)，半胱氨酸-HC(0.250g)，酪氨酸-HCl(0.250g)，铁粉(1g)，ZnCl2(0.250g)，和MnCl2(0.4g)。使用下列成分制备对照发酵培养基，每2升制备的培养基中含BHI(500ml；这相当于大约45.5克牛心浸液干重)，NZ-CaseTT(30g)，以及基础培养基(至2升)，pH6.8。可先制备基础发酵培养基并调节pH至6.8。然后制备牛心浸液(BHI)BHI，并用5NNaOH调节其pH值至.8。然后将BHI加至基础培养基中。下一步制备NZ-CaseTT。然后将NZ-CaseTT加入已经加有牛心浸液的基础培养基中，并加入HCl溶解。然后使用5NNaOH调节pH值至6.8。然后将该培养基分成8ml的小份，分别装入16支100mm试管中，然后在120℃下高压灭菌25分钟。可通过以试验氮源替换存在于对照发酵培养基中的BHI来制备试验发酵培养基(不含动物产物)。合适的试验发酵培养基氮源包括Hy-Soy(Quest)，AMI-Soy(Quest)，NZ-Soy(Quest)，NZ-SoyBL4(Quest)，NZ-SoyBL7(Quest)，SheftoneD(Sheffield)，SE50M(DMV)，SE50(DMV)，SE％)MK(DMV)，大豆蛋白胨(Gibco)，Bacto-Soyton(Difco)，Nutrisoy2207(ADM)，BakesNutrisoy(ADM)Nutrisoy粉，大豆粉，细菌-酵母提取物(Difco)，酵母提取物(Gibco)，Hy-Yest412(Quest)，Hy-Yest441(Quest)，Hy-Yest444(Quest)，Hy-Yest455(Quest)Bacto-MaltExtract(Difco)，CornSteep，以及Proflo(Traders)。试验发酵培养基可按对照发酵培养基的上述方法进行制备，除了不加入BHI，并且首先使用3NHCl或5NNaOH将相关氮源的pH值调至6.8。将该培养基分成8ml的小份，装入16支100mm试管中，然后在120℃下高压灭菌20～30分钟。实施例4在不含动物产物的发酵培养基中培养肉毒梭菌40μl的试验种子培养基培养物(不含动物产物)的小份可用于接种于8ml16×100mm试管的每8ml的对照或试验发酵培养基等份中。然后培养物在33±1℃下孵育24小时。然后将试管在厌氧培养室中培育，使细菌生长。各培养基试样重复进行三次(即可包括同一培养基三次独立的接种)，还可包括未接种的对照，在分光光度计中用作空白。每24小时使用Turner分光光度计(型号330)在660nm下测定生长状况(通过光密度OD值测定)。细胞裂解已经持续约48小时时停止培养，随后测定肉毒毒素的产量。另外还可使用每500ml培养基中含下列成分的Hy-Soy发酵培养基进行实验Hy-Soy(17.5g)，葡萄糖(3.75g)；NaCl(2.5g)；Na2HPO4(0.25g)，MgSO47H2O(0.025g)，KH2PO4(0.0875g)，L-半胱氨酸(0.0625g)，L-酪氨酸(0.0625g)，铁粉(0.25g)，pH6.8。实施例5在不含动物产物的发酵培养基中培养肉毒梭菌的肉毒毒素产量测定将实施例4中的培养物细胞离心，测定上清液pH值。通过加入标准抗毒素，测定出现絮凝所需时间来测定给定样本中的肉毒毒素水平。Kf(出现絮凝所需时间，分钟)和Lf(絮凝限度；按絮凝建立的，相应于1国际单位的标准抗毒素)两者均可测定。对于给定的培养物，可从各发酵管中取4ml发酵液，汇集在一起，总共12ml混合于15ml离心管中。离心管在4℃、5000rpm(3400g)下离心30分钟。可将1ml小份的上清液加入含0.1～0.6ml标准肉毒毒素抗血清的试管中，轻轻摇动试管使管内物质混合。然后将管放入45±1℃的水浴中，记录起始时间。经常检查试管，絮凝开始时间记录为Kf。絮凝最先开始的试管中的毒素浓度可定为LfFF。絮凝随后开始的试管中的毒素浓度可定为LfF。平行的发酵、培养和毒素产量分析可在以下液体培养基中进行(a)对照种子培养基(用于接种对照发酵培养基)和对照发酵培养基；(b)(不含动物产物的)试验种子培养基(用于接种试验发酵培养基)和(不含动物产物的)试验发酵培养基。值得注意的是，经测定，不含动物产物的培养基中的肉毒梭菌发酵以及使用同样不含动物产物(使用大豆产物替换动物产物)的培养物接种，可导致Lf毒素约为50或更高。最少，Lf毒素等于大约10。Lf毒素优选至少20。Lf毒素最优选大于50。另外还可测定，在不含BHI的发酵培养基中，各种大豆产物支持的肉毒梭菌生长情况。因此，可使用可溶性大豆制备物代替BHI培养肉毒梭菌。最佳浓度可为12.5或25g/L。使用Hy-Soy(Sheffield)时的生长情况最好。不溶性大豆制备物的效果较差。另外，获得的结果显示，在替换BHI培养肉毒梭菌的能力方面，QuestHy-Soy，DMVSE50MK，和QuestNZ-Soy是有效的大豆产物。该结果显示对生长最佳的大豆产物(如QuestHy-Soy，DMVSE50MK，和QuestNZ-Soy)同样在替换BHI生产毒素方面有效。对生产毒素来说最佳的大豆产物是22.75g/l的QuestHy-Soy。该产物较高的浓度可使生长状况较好，但不会提高毒素产量。有人提出使用SE50MK可获得相似的结果，较高浓度可改善生长状况，但不会提高毒素产量。另一方面，NZ-Soy在更高的浓度下可提供更好的生长状况和更高的毒素产量。最后，可确定大豆产物可有效替换BHI以及NZ-CaseTT。从大豆基础培养基中除去NZ-CaseTT可使生长减缓约2～4倍。对于存在和不存在NZ-CaseTT的生长的最佳大豆产物是SE50MK。在生产毒素中，HY-Soy可替换BHI和NZ-CaseTT两者。然而，可能需要1天或2天的更长的发酵循环。在生产毒素的培养基中，HY-Soy可替换BHI和NZ-CaseTT两者。然而，可确定酵母提取物可抑制毒素产生。可确定在毒素生产中，22.75g/l的HY-Soy可完全替换BHI和HY-CaseTT两者。与对于生长作用最佳的56.88g/lHY-Soy不同，34.13g/lHY-Soy对于毒素生产阶段作用最佳。因此，已出人意料地确定了在用于肉毒梭菌的种子生长的培养基中Hy-Soy或〔Hy-Soy+Hy-Yest〕是否可替换BHI和细菌蛋白胨。另外，可设计实验测定在通过肉毒梭菌得到最高水平的肉毒毒素产量的种子培养基中各组分的最佳浓度。通过在不含BHI和NZ-CaseTT的种子培养基和发酵培养基中培养肉毒梭菌所得的毒素产量，可达到或超过从含BHI和NZ-CaseTT的培养基获得的产量水平。可测定在种子培养基中对于生长来说Hy-Soy或〔Hy-Soy+Hy-Yest〕的最佳浓度。实验证实，在培养肉毒梭菌以及在随后的发酵阶段生产肉毒毒素的种子培养基中，Hy-Soy可替换BHI和细菌蛋白胨作为氮源。同样，在种子培养基中以Hy-Soy作为氮源，与Hy-Soy加Hy-Yest相比，在随后的发酵步骤中可产出更高水平的肉毒毒素。可产生最高水平毒素的种子培养基中的Hy-Soy的浓度范围是从大约62.5g/L至100g/L。设计另外的实验以测定通过肉毒梭菌发酵具有最高肉毒毒素产量时的种子培养基中的Hy-Soy的最佳浓度。因而，在种子培养基中30g、50g、75g和100gHy-Soy通过发酵肉毒梭菌均可产生肉毒毒素，而且与含BHI和细菌蛋白胨作为氮源的种子培养基相比，其肉毒毒素生产水平相当或更高。可以发现，种子培养基中Hy-Soy浓度为100g/L时可使随后的发酵步骤中毒素产生水平最高。另外，数据显示Hy-Soy种子培养基的种子步骤1在48小时后比24小时后可产生更好的生长状况。实施例6获得肉毒毒素的非APF方法通过肉毒梭菌获得肉毒毒素。因此，用改进的Schantz(非APF)方法获得如下所述的高效力和高纯度的肉毒毒素(即原料毒素)。改进的Schantz(非APF)方法可提供高产量的肉毒毒素。Schantz和改进的Schantz的方法在所有的发酵培养基中均使用了酪蛋白。原种培养物制备各种梭菌细菌购自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。另外，肉毒梭菌细胞库管可通过分离各种来源的肉毒梭菌制备，包括土壤或腐烂的动物实体的深层样品(厌氧或几乎厌氧的部位)。通常，肉毒梭菌可从诊断为肉毒中毒的患者的生理体液里获取样本。图2的上半部分总结了制备细胞库管和肉毒毒素发酵的非APF方法。天然获得的或者患者来源的肉毒梭菌在血琼脂板上培养，然后将生长旺盛的集落接种到细胞库管的培养基中。用于肉毒梭菌的细胞库管培养基为含有新鲜碎牛肉的熟肉培养基。将活性生长培养基与甘油混合制备肉毒梭菌细菌的细胞库管(即原料培养物)，并将其冷冻为日后所用。培养使肉毒梭菌细胞库管在室温下解冻，然后进行四步培养步骤(1)选择合适形态的集落，将细菌在预还原的哥伦比亚血琼脂板上划线培养，于34℃±1℃厌氧环境中孵育30-48小时以培养解冻的细胞库管肉毒梭菌整分试样。(2)然后将选择的集落接种到含酪蛋白生长培养基的测试管中34℃孵育6-12小时。生长最迅速且光密度最高(生长选择步骤)的管内物进一步通过两步逐步扩大的厌氧环境孵育(3)34℃在一升种子培养瓶中第一次孵育12-30小时，之后(4)35℃在25升含有酪蛋白生长培养基的种子发酵罐中第二次培养6-16小时。这两步逐步扩大的培养在水中含2％酪蛋白水解产物(酪蛋白[奶蛋白质]消化物)、1％酵母提取物和1％葡萄糖(右旋糖)，pH7.3的营养培养基中进行。发酵逐步扩大培养之后，在含酪蛋白培养基的商业规模的发酵罐(即115升)中，在35℃受控的厌氧环境下进一步孵育60-96小时。一般24到36小时后完成细菌生长，并且在60-96小时的发酵过程中，大多细胞裂解并释放肉毒毒素。在Schantz方法或改进的Schantz方法中，不需控制发酵培养基pH值。存在于培养物发酵液中的蛋白酶将细胞裂解释放的毒素活化。任选的用单层厚度的滤器过滤该培养液除去粗大杂质(即完整及破裂的细胞)，得到称为澄清培养物的澄清溶液。收获在20℃用硫酸降低pH至3.5以沉淀粗毒素，从而完成毒素收获。然后将粗毒素用超微过滤以及之后的渗滤浓缩。纯化然后将收获的毒素粗品转移到消化管中，并加入蛋白酶抑制剂盐酸苯甲脒稳定。加入DNA酶和RNA酶消化核酸。超滤和渗滤后，通过3个沉淀步骤纯化毒素，即酸沉淀、冷醇沉淀和硫酸铵沉淀。纯化的肉毒神经毒素复合物以磷酸钠/硫酸铵缓冲液的悬浮液在2-8℃储藏。得到的原料毒素为高质量晶状肉毒梭菌HallA菌株的900kDaA型肉毒毒素复合物，其特异性效力≥3×107U/mg，A260/A278小于0.6，且凝胶电泳上呈现特征性条带形式，适用于配制肉毒毒素药物组合物。配方包括与一种或多种的赋形剂(例如白蛋白和氯化钠)混合的多倍稀释的原料毒素，由此形成毒素组合物，并通过冻干、冷冻干燥或真空干燥制成毒素组合物贮存和运输的稳定形式。从Schantz方法或改进的Schantz方法获得的纯化的肉毒毒素复合物可在pH7-8的缓冲液中经离子交换柱洗脱将非毒素复合物蛋白质与肉毒毒素分子分开，由此得到纯化的A型肉毒毒素，其分子量大约为150kD，特异性效力为1-2×108LD50U/mg或其以上；或纯化的B型肉毒毒素，其分子量大约为156kD，特异性效力为1-2×108LD50U/mg或其以上；或纯化的F型肉毒毒素，其分子量大约为155kD，特异性效力为1-2×107LD50U/mg或其以上(这取决于发酵的肉毒梭菌细菌的类型)。如前所述，本发明去掉了实施例6所述的澄清培养物收获纯化的步骤，包括不使用动物来源产物，如RNA酶和DNA酶。实施例7为获得肉毒毒素的APF培养基和方法本实施例7提出了实行APF方法以获得高效和高纯度的A型肉毒毒素(即原料毒素)。该方法可用于其它肉毒毒素血清型。原种培养制备如实施例6所述，可从ATCC获得各种天然来源或肉毒毒素中毒患者来源的肉毒梭菌。图2下半部分总结了用于细胞库管肉毒梭菌制备，肉毒毒素培养和发酵的APF方法。通过在植物琼脂板上培养肉毒梭菌制备APF细胞库管肉毒梭菌。植物琼脂板是通过将大豆衍生物HySoy(Quest)和酵母提取物及葡萄糖以3∶1∶1(重量百分比)混合并凝固制成的。其它市售的APF琼脂板或用来制板的脱水粉末也适合使用。将所选择的生长旺盛的集落接种到APF细胞库管培养基中。所用的APF细胞库管培养基包括大豆蛋白、酵母提取物(在酵母培养或发现适于酵母制备的方法中不使用动物产物)。所用的水解大豆和酵母提取物的浓缩物获自QuestInternational。APF培养基中的肉毒梭菌培养物与甘油混合，等分到冻存管中冷冻备日后使用。研制的APF培养基可用于贮存肉毒梭菌长达一年或更长时间而不损失活力。这些在冻存管中的冷冻的培养物和甘油的混合物就是APF细胞库管。培养APF细胞库管在室温下解冻，随后进行单一培养步骤将APF细胞库管的内容物使用相同APF培养基直接接种(即不经过血琼脂培养或试管生长步骤)到(APF细胞库管[贮存]培养基可与APF发酵[生长]培养基不同)一升种子培养瓶，培养基起始pH为7.0，在35℃厌氧环境(氮气)中维持15到24小时。发酵接着将种子瓶培养物转移至含有APF培养基(水解大豆蛋白、酵母提取物和1％葡萄糖)的商业规模的10升生产发酵罐中，且培养基起始pH7.0，在35℃厌氧环境(氮气)中维持52到72小时。之后(发酵开始1-2小时内)pH减小并维持在5-5.5狭窄范围内。我们发现有必要控制APF发酵培养基pH在狭窄范围内，以获得令人满意的活性肉毒毒素产量。因此我们发现将pH控制在pH5-5.5基本防止肉毒毒素降解和效力的丧失。我们认为在发酵时大多细胞裂解并释放肉毒毒素并且细胞裂解释放的毒素经存在于培养物发酵液中的蛋白酶活化。用单层厚度的滤器过滤培养基除去粗大杂质(即完整的细胞和破裂的细胞)，从而得到称为澄清培养物的澄清溶液。收获然后可按实施例6(即硫酸沉淀，之后用微滤和随后的渗滤浓缩)收获肉毒毒素。纯化毒素纯化可按实施例6所述的进行即加入盐酸苯甲脒和DNA酶与RNA酶，硫酸沉淀、冷醇沉淀、磷酸缓冲液萃取、盐酸沉淀、磷酸缓冲液萃取和原料毒素贮存。作为实施例6的收获和纯化方法的替代方法，就是进行本发明的柱色谱方法。得到的原料毒素为高质量晶状肉毒梭菌HallA菌株的900kDA型肉毒毒素复合物，其特异性效力≥3×107U/mg，A260/A278小于0.6，且凝胶电泳呈现特征性条带形式，适用于配制肉毒毒素药物组合物。因此这种用于肉毒毒素的APF方法能产生高质量的毒素。从APF方法所得的纯化的肉毒毒素复合物在pH7-8的缓冲液中经离子交换柱过柱并洗脱，使非毒素复合物蛋白和肉毒毒素分子分离，由此得到肉毒毒素，其分子量大约为150kD，特异性效力为1-2×108LD50U/mg或以上；或纯化的B型肉毒毒素，其分子量大约为156kD，特异性效力为1-2×108LD50U/mg或其以上；获纯化的F型肉毒毒素，其分子量大约为155kD，特异性效力为1-2×107LD50U/mg或其以上(这取决于发酵的肉毒梭菌细菌的类型)。例如，用我们的APF培养基，我们能获得肉毒毒素特异性效力为1.02×108LD50U/mg的A型肉毒毒素复合物。在实施例7中用到了含有按重量计1％或2％(注意1％(重量)葡萄糖意为每100ml培养基有1g葡萄糖，2％(重量)葡萄糖意为每100ml培养基有2g葡萄糖)的葡萄糖的APF培养基，并在1％葡萄糖APF培养基发酵约20小时，而在2％葡萄糖APF培养基发酵约40小时后测得细菌生长最大(通过培养基光密度峰值[在600nm测量光密度]测得)，但该光密度峰值不因培养基中葡萄糖含量变化而显著不同。我们认为细胞自溶和毒素释放使得发酵约55小时后在1％葡萄糖APF培养基中的活性肉毒毒素量最大(通过SNAP分析测定活性毒素)，但对于2％葡萄糖APF培养基，活性肉毒毒素的量在较晚的时间出现在培养基中(通过SNAP分析测定活性毒素)，并且发酵65小时后仍在增加。所以，使用较低量的葡萄糖(1％)的APF培养基释放肉毒毒素更快，说明使用较低量(1％)的葡萄糖的APF培养基进行毒素生产的方法(即每单位时间获得毒素量更多)更高效。如图1所示，还测得使用APF培养基生产肉毒毒素的最佳参数为以下参数的组合(1)APF发酵培养基中约6％(重量)的水解大豆蛋白(图1中的“HySoyConc.”)。6％大豆意为每100ml培养基含6g大豆蛋白；(2)APF发酵培养基中酵母提取物的浓度(图1中“YEConc”，)为0％到3％；(3)在厌氧条件(氮气环境)下33-35℃发酵50-72小时；(4)整个发酵过程，发酵培养基pH维持在约pH5.0到5.5，和；(5)APF发酵培养基中1重量％的葡萄糖。我们测得培养物和/或发酵培养基中1-2重量％葡萄糖作用较好。当发酵培养基中葡萄糖和酵母的浓度各为常数1重量％，但发酵培养基中大豆蛋白营养物(如HySoy)在1重量％到6重量％间变化时，发现68-100％的细胞裂解，并且用鼠LD50分析测得的肉毒毒素复合物效力在1.3×108单位/ml到4.7×106单位/ml间变化(见图8)。因此，如图1所示存在较多蛋白质(作为APF培养基中的HySoy和YE的总量)时，培养基的pH易升高，导致毒素稳定性降低，当pH降低同时培养基中总的蛋白质营养含量都相同时，毒素产量就显著增加。在非APF方法中，培养基中总蛋白含量降低使得pH不会趋于升高，从而不会因升高的pH对毒素的产生起到有害的作用。图1显示当培养基的pH控制在约5.3到5.5的狭窄的范围内时，产物就有持久的较高活性(通过MLD50和SNAP-25分析测定)。图1还显示用含6％水解大豆和1％酵母提取物的培养基获得的毒素产量最高(通过SNAP-25分析测定)。所用的SNAP-25分析是基于ELISA的方法用于测量肉毒毒素的SNAP-25蛋白水解活性。SNAP-25是分子量为25kD的突触小体相关蛋白的缩写。SNAP-25是涉及神经胞吐的含206个氨基酸的质膜蛋白。该分析是以公开于EkongT.等，RecombinantSNAP-25isaneffectivesubstrateforClostridiumbotulinumtypeAtoxinendopeptidaseactivityinvitro，Microbiology(1997)，143卷，3337-3347页中的方法为基础的。该分析用截短的SNAP-25蛋白(206个氨基酸残基的肽)结合到聚苯乙烯96孔微升板上并且用单克隆抗体识别裂解的产物(197氨基酸残基多肽)，此裂解产物是用还原型A型肉毒毒素将SNAP-25的197和198氨基酸酶促水解而生成。结合到裂解产物上的单克隆抗体然后用二抗(结合辣根过氧化物酶的羊抗小鼠IgG)检测，在发色底物(TMB)存在的情况下产生颜色变化。MLD50(小鼠50％的致死剂量)分析是通过在分析开始时向每只重17到22克雌性小鼠(约四周大)腹腔注射肉毒毒素来测量肉毒毒素效力的方法。每只小鼠处于腹部向上的位置，头部斜向下，用规格25到27的3/8”到5/8”的针头在右下腹部以约30度的角度腹腔注射几种用盐水连续稀释的肉毒毒素中的一种。对于每种稀释记录紧接的72小时的死亡率。制备稀释液使得最大浓度的稀释液产生至少80％的注射小鼠死亡率和最小浓度的稀释液产生不超过20％的注射小鼠死亡率。必须有最少四种稀释度属于死亡率的单调下降区间。单调下降区间的起始死亡率不小于80％。在四个或更多的单调下降死亡率中，最高的两个和最低的两个死亡率必须是递减的(即不相等的)。50％的小鼠在注射后三天观察期内死亡的稀释液就定义为含有一单位(1U)的肉毒毒素的稀释液。值得注意的是，实施例7的APF方法至少有以下几个方面与实施例6不同(1)用APF培养基代替细胞库管的熟肉培养基；(2)去掉血琼脂集落选择的步骤；(3)去掉随后的基于酪蛋白培养基的管内生长的步骤，和；(4)整个方法用APF培养基代替非APF培养基。图2对工业规模(非APF方法)的Schantz方法(实施例6)和实施例7的工业规模的APF方法的细胞库建立、培养和发酵步骤的不同进行总结。图2省略了收获和纯化的步骤。APF培养基可用于选择肉毒梭菌细菌。因此同时实施实施例6和7开始的培养步骤允许以有助于在APF培养基内或上生长或产生肉毒毒素为特征的肉毒梭菌的分离和生长。将肉毒梭菌细菌从非APF培养基转移至APF培养基，富集和选择适应新的环境的细菌，或者通过不能在新环境中生长和生产的细菌的选择性死亡富集和选择。实施例8纯化肉毒毒素的色谱系统和方法实施例8叙述了实验中使用的化学物质，包括以下10NNaOH(Mallinckrodt，VWRCat#MKH38505)乙酸，USP/FCC级，99.5-100.5％(J.T.Baker，Cat#JT9522-2)硫酸铵，超纯，99％(ICN，Cat#IC808211)柠檬酸，USP/FCC级，99.5-100.5％(J.T.Baker，Cat#JT0119-1)乙醇，无水，变性(JTBaker，Cat#9299-1)盐酸，NF/FCC级，36.5-38％-Mallinckrodt-MK2612-14磷酸，NF/FCC，85％-88％(Mallinckrodt，Cat#MK278814)醋酸钠三水合物，99％-101％，USP/FCC(Mallinckrodt，Cat#MK735602)氯化钠，USP/FCC级，99.0-101.0％(Mallinckrodt，Cat#MK753204)柠檬酸钠，USP/FCC级，99.0-100.5％(J.T.Baker，Cat#JT3650-1)氢氧化钠，NF/FCC级，95.0-100.5％-Mallinckrodt-MK768004磷酸钠，二元(碱)七水合物，USP(Mallinckrodt，Cat#MK789604)磷酸钠，一元(碱)单水合物，USP/FCC(Mallinckrodt，Cat#MK786812)实验中使用的色谱树脂包括以下-BakerbondABxPrepscale(JTBaker，Cat#7269-02)-丁基SepharoseFF(AmershamBioscience，Cat#17-098002)-陶瓷羟磷灰石(ceramichydroxyapatite)，I型(Bio-Rad，Cat#158-4000)-陶瓷羟磷灰石，II型(Bio-Rad，Cat#1587-4200)-HiTrapHIC选择试剂盒(AmershamBioscience，Cat#17-1349-01)-HiTrapIEX选择试剂盒(AmershamBioscience，Cat#17-6002-33)-MEPHypercel(Ciphergen，样品)-SPSepharoseHP(AmershamBioscience，Cat#17-1087-03)实验使用的设备和辅助设备包括以下AKTA纯化仪和AKTAFPLC色谱系统(AmershamBioscience)0.22μm真空灭菌瓶口滤器(Nalgene)实验室级的TFF系统和带Biomax100膜的PelliconXL50(Millipore)(此为超滤设备)MasterflexL/S泵型号#77201-62(Cole-Parmer)Pellicon2MiniHolder(Millipore)XK和HR柱(AmershamBioscience)实验中所用的缓冲液在表2中列出。表2APF纯化方法中所用的缓冲液在表2中缓冲液1和2用于洗出柱内的杂质；缓冲液3和4用于洗脱结合在柱子上的毒素；缓冲液5用于稀释来自丁基柱的洗脱液；缓冲液6用于洗出柱内的杂质；缓冲液7和8用于洗脱结合在柱上的毒素；缓冲液8为UF/DF透析缓冲液；溶液9用于沉淀毒素，以及溶液10和11用于使得使用后留在柱内的毒素失活(清洗)。实施例9用于肉毒毒素APF柱色谱纯化(捕获步骤)方法中优选色谱柱的选择本实验对在发酵培养基中将A型肉毒毒素复合物从伴随的杂质中分离的初始纯化建立了优选的色谱柱和技术。进样从APF方法发酵和其盐酸沉淀制备的提取物获得的过滤细胞培养物(澄清的培养物)均作为色谱进样进行评估。发现将澄清培养物直接加到柱上避免毒素沉淀，并且澄清的培养物进样更容易操作和实现。另一方面酸沉淀制备的澄清培养物提取物作为进样使用，除去了多余的杂质并使病毒失活。关于方法稳定性特征，与使用盐酸沉淀制备物作为原料肉毒毒素复合物色谱树脂进样相反，确定澄清培养物为优选进样。因此，澄清培养物为优选进样。我们的研究表明，当pH降低，蛋白质在pH约5时开始沉淀(即肉毒毒素复合物)，在pH约为4.0时小量毒素(多数沉淀出来)被提取出来，在pH在3.5到3.8之间时基本上所有的毒素从溶液中沉淀出来。另一方面，我们发现(基于如SDS-PAGE和Western印迹)大多杂质在pH6.8时与肉毒毒素共同提取出来。因此优选的实行我们的纯化方法发明的进样液pH大约为5-6.8，对于提取更优选的pH约为5.5，此时肉毒毒素和伴随的杂质分离。捕获步骤在捕获步骤，A型肉毒毒素(Hall菌株)细胞培养物的滤液在生产商对于每种特定的柱子的指定条件下与许多色谱树脂一起孵育(参见下文)。柱子经冲洗后，结合在柱上的蛋白用特定的洗脱缓冲液洗脱。收集洗脱的所有部分并用SDS-PAGE分析。得到的结果(表3)用1mlHiTrap或HR5/5柱色谱确证。表3捕获步骤的结果总结该实验清楚地表明了用疏水型柱色谱达到了所期望的肉毒毒素和其它物质的最好的分离。因此我们发现肉毒毒素与疏水柱结合，但并不与离子交换柱(如QSepharoseFF柱)结合。在所评价的疏水柱中，较弱的疏水丁基SepharoseFF的分离度最好。因此，结合型的丁基SepharoseFF或者流出型(flowthrumode)的QSepharoseFF提供了优选的肉毒毒素捕获步骤。因此，我们确定，可用疏水柱进行有效的捕获步骤，如丁基Sepharose柱色谱。推测，毒素通过疏水作用结合到丁基柱上。在本实验之前还不知道可用疏水色谱柱直接从澄清的培养物中纯化肉毒毒素复合物。我们发现丁基SepharoseFastFlow柱有较高的结合容量，允许用低背压的快速流速，因此适于所需的快速去除杂质的捕获步骤。实施例10纯化肉毒毒素复合物的四柱APF色谱系统和方法中间和精制纯化步骤用从实施例9优选的Q和丁基柱而得的含有毒素的部分进行附加(中间和精制步骤)的毒素纯化步骤。发现三种类型的色谱柱对这种肉毒毒素复合物的进一步纯化有效。I型羟磷灰石(HA)是我们使用的优选柱，因为它显示能够进行分离，但在流出液(flowthru)中发现一些毒素。凝胶过滤的Superdex200柱为更优选使用柱，因为它使900kDa肉毒毒素复合物从杂质中纯化出来，但SDS-PAGE上仍有少量杂质的条带存在。最优选柱为SPSepharoseHP柱，我们发现用它分离肉毒毒素和杂质有很好的分离度。基于SDS-PAGE的分析，SPSepharoseHP色谱后的肉毒毒素是纯的。表4柱色谱纯化步骤总结基于实施例8和9和表4所示的结果，得到了以下四种柱色谱的纯化方法1开始的澄清培养物的纯化用QSepharoseFF柱。在此步骤中，杂质结合到柱上，毒素流过整个柱子；2来自步骤1的QSepharoseFF柱的洗脱液过丁基SepharoseFF柱。毒素结合到柱上并用合适的缓冲液洗脱；3来自丁基SepharoseFF柱的洗脱液然后过I型羟磷灰石柱。杂质结合到柱上并且毒素流过整个柱子。4I型羟磷灰石柱的洗脱液然后过SPSepharose柱。毒素结合到柱上并且用合适的缓冲液洗脱。此四柱毒素纯化方法可总结为此原料肉毒毒素复合物四柱法允许过滤的培养物上清液直接加到Q柱上(步骤1)。在第二步向丁基柱上样前流出液用硫酸铵补到0.8M。第三步，将丁基洗出物直接加到HA柱，同时在第四步向SP柱上样前，HA的流出液用去离子水稀释4倍，pH调到4.0。这四柱方法要求在每步处理最少的样品，并保证在这四步纯化过程中毒素处于温和的缓冲液环境中。当从APFA型肉毒毒素发酵过程获得680ml的过滤的培养物上清时，进行上述四柱纯化方法的扩大。结果(参见表5)显示这四柱法产出高产量的高纯度A型肉毒毒素复合物。表5用四柱纯化法放大纯化的结果实施例11其它的纯化肉毒毒素复合物的多柱APF色谱方法使用实施例9和10所述的相同步骤评价其它的柱的组合。通过SDS-PAGE确定以下另外的四根柱的组合，其每根柱为获得高纯度的肉毒毒素复合物提供APF方法。纯化的毒素进一步用结合光散射的SEC-HPLC、毛细管电泳、DNA残基分析、Hc-ELISA和MLD50分析。上述四种不同的方法得到的毒素未发现显著差异。结果总结于表6。表6用上述1.4.不同的APF方法纯化的毒素样品质量总结实施例12纯化肉毒毒素复合物的两柱APF色谱方法基于实施例11得到的结果，选择一种两柱柱色谱方法以进一步研究。第一个步骤的优化丁基SepharoseFF毒素捕获进样进样是将澄清的培养物加到柱上。因为硫酸铵能影响缓冲液pH，对在丁基柱用NaCl代替硫酸铵进行评价。我们发现在进样中加入NaCl至2M使得肉毒毒素复合物结合到丁基柱上。随后，我们发现以4MNaCl进样增加了肉毒毒素复合物与丁基柱的结合，因此按Hc-ELISA测得，丁基柱的毒素产量与用2MNaCl进样相比增加了30％到50％。向澄清的培养物中加入NaCl(进样)引起pH小波动。然而，令人满意的进样pH确定在5和6之间，且加入NaCl后的进样的最终pH在pH5和pH6间。因此在两柱纯化法的第一个步骤中使用的优选的进样含浓度4MNaCl且pH5-6。将固体NaCl直接加到澄清的培养物中以获得4MNaCl浓度，再将进样加到丁基柱上。结合的毒素用1MNaCl洗脱缓冲液从柱上洗脱。出人意料的是大多杂质蛋白都从柱中冲走并且大多结合于柱上的毒素可用1MNaCl缓冲液洗脱，这是因为除了亲和柱方法，柱纯化方法一般由三根或三根以上的柱子组成。我们确定此丁基柱很特别，因为它能除掉许多杂质蛋白。因此，用过这根柱子后，肉毒毒素复合物的纯度大约为50％。然后进行冲洗步骤，以除去柱中的杂质。柱中的杂质来源于所用的澄清的培养物的进样(含4MNaCl)。优化的冲洗步骤是1)冲洗#15CV的50mMNaPi，4MNaCl，pH6.0，和2)冲洗2#12CV的50mMNaPi，2MNaCl，pH6.0。当12CV和5CV比较时，发现5CV不足以除去杂质。但是，在这种情况中，冲洗是为了除去澄清的培养物上样后的杂质。洗脱(移除结合在柱上的毒素)。对用1.2M、1.0M和0.8MNaCl洗脱毒素进行评价。基于回收毒素和去除杂质，选择用50mMNaPi中1MNaCl，pH6.0洗脱。低盐洗脱对于纯化方法的特征而言，洗脱后，柱子进一步用50mMNaPi，pH6.0冲洗，以除去结合在柱上的残留杂质。清洗柱子用3CV的0.1NNaOH清洗，在处理用过的树脂前使得所有残留的毒素失活。跑柱的流速典型流速为100cm/h。上样的流速根据背压在90cm/h到120cm/h间。上样量典型的上样量为每ml柱床12.7ml培养物，或者在生产规模，785ml树脂床承载10L培养物(10cm床高的BPG100柱)床高所有的柱子都装成标准10cm床高。第二步骤的优化SPSepharoseHP纯化进样条件丁基洗出物用pH4.0，20mM柠檬酸钠缓冲液稀释5倍，进样的pH调至4.0。进行5倍稀释步骤以确定疏水作用色谱洗脱液适用于离子交换色谱的条件。我们发现最好的毒素回收率的最佳进样pH在pH4.0±0.2的范围内。冲洗步骤上样后，冲洗柱子，用1)5CV的20mM柠檬酸钠，pH4.0，之后，用2)3-5CV的20mM柠檬酸钠、300mMNaCl，pH4.0在毒素洗脱前除去杂质。洗脱步骤用20mM柠檬酸钠、400mMNaCl，pH4.0洗脱。高盐冲洗步骤洗脱后，柱子用20mM柠檬酸钠、1MNaCl、pH4.0冲洗以除去结合较牢的杂质。柱子清洗柱子用～3CV的0.1NNaOH清洗使得在处理用过的树脂前残留的毒素失活。流速典型流速为100cm/h。上样丁基柱的所有洗出物上到SP柱上。床高柱子全部装成标准10cm床高。实施例12中所述的关于肉毒毒素复合物两柱纯化方法的详细操作步骤在下文给出。1.丁基疏水作用所用的材料和试剂色谱系统AKTA纯化仪100，AmershamBiosciences树脂类型丁基琼脂糖凝胶FF，AmershamPharmacia检测UV(280nm)平衡缓冲液/冲洗缓冲液#150mMNaPi，4MNaCl，pH6.0冲洗缓冲液#250mMNaPi，2MNaCl，pH6.0洗脱缓冲液50mMNaPi，1MNaCl，pH6.0低盐冲洗缓冲液50mMNaPi，pH6.0清洗溶液0.1NaOH滴定缓冲液500mMNaPi，pH7.2步骤装柱和条件调节用至少5-10CV的平衡缓冲液平衡柱子或直至流出液的pH等于进液的pH。样品制备测定起始原料的pH。向澄清的培养物中加入固体NaCl至最终NaCl浓度为4M。加入4MNaCl是一个怎样使澄清培养物达到适用于作为疏水相互作用色谱进样液澄清培养物条件的一个例子。如有需要，用滴定缓冲液调节pH至5.0到6.0。柱上样将澄清培养物上样(含4MNaCl)并且收集流出的部分用于分析。柱清洗#1(4MNaCl冲洗)用5CV的平衡缓冲液冲洗柱蛋白质除去杂质。收集冲洗部分用于分析和记录体积。3.5.柱冲洗#2(2MNaCl冲洗)用15CV的冲洗缓冲液#2冲洗柱子以除去额外的杂质蛋白质。收集冲洗部分用于分析和记录体积。洗脱(1MNaCl毒素峰洗脱)用5CV洗脱缓冲液洗脱结合毒素。监测在280nm处的洗出物吸光度，当280nm处的吸光度开始增大时开始收集洗出物，当280nm处的吸光度回到基线时停止收集。记录毒素洗脱的部分的体积。低盐冲洗(0MNaCl杂质峰洗脱)用4CV的低盐冲洗缓冲液冲洗柱子以除去残留的杂质蛋白质。收集该部分用于分析和记录体积。柱清洗(0.1NNaOH)用3CV的清洗缓冲液清洗柱子，在处理用过的树脂之前使得残留毒素失活。2.SP阳离子交换树脂(丁基后)柱所用的材料和试剂色谱系统AKTA纯化仪100，AmershamBiosciences树脂类型SP琼脂糖凝胶HP，AmershamPharmacia检测UV(280nm)稀释，平衡和冲洗缓冲液#120mM柠檬酸钠，pH4.0冲洗缓冲液#220mM柠檬酸钠，300mMNaCl，pH4.0洗脱缓冲液20mM柠檬酸钠，400mMNaCl，pH4.0高盐缓冲液20mM柠檬酸钠，1MNaCl，pH4.0清洗溶液0.1NNaOH步骤装柱和条件调节用5-10CV的平衡缓冲液平衡柱子或直至流出液的pH等于进液的pH。样品制备用4体积的稀释液缓冲液稀释1体积的1MNaCl丁基缓冲液。测定所上样的电导率和pH。若需要，调节pH至4.0。柱上样用上述稀释的丁基洗出物洗脱SP柱，并收集流出的部分。柱冲洗#1(平衡缓冲液冲洗)用5CV平衡缓冲液冲洗SP柱，收集洗出物作为流出部分。冲洗柱#2(300mMNaCl冲洗)用4CV的冲洗缓冲液冲洗SP柱以除去杂质蛋白。记录冲洗#2部分的体积。洗脱(400mMNaCl洗脱)用3CV洗脱缓冲液洗脱结合的毒素。监测280nm处洗出物的吸光度，当280nm处的吸光度开始增大时开始收集洗出物峰，当280nm处的吸光度回到基线时停止收集。记录毒素洗脱的部分的体积。高盐洗脱(1MNaCl)用3CV的高盐缓冲液洗脱牢固结合的杂质蛋白质。收集部分用于分析和记录体积。柱清洗用3CV的清洗溶液清洗SP柱，在处理用过的树脂前使得残留的毒素失活。实施例13纯化肉毒毒素复合物的两柱APF色谱方法的稳定性如下所述，于一系列试验中研究了实施例12两柱方法的稳定性。培养物pH评价了培养物pH对毒素纯化的作用。进行一项用在pH5.5和pH6.5生长的培养物作为纯化的起始材料的研究，基于Hc-ELISA的结果发现pH6.5的培养物的回收率比pH5.5的培养物的回收率稍低。贮存时间pH5.5下生长的培养物在收获的当天和在2-8℃贮存4天后纯化得到毒素。基于毒素回收率、丁基和SP色谱图、SDS-PAGE和Hc-ELISA的结果发现没有差异。柱结合容量丁基柱上的建议上样量为每ml树脂12.7ml培养物或者对于BPG100柱(10cm床高)为10L培养物。丁基和SP柱用4×以上培养物上样量测试。SDS-PAGE和Hc-ELISA结果显示丁基和SP柱的流出部分中几乎均不含毒素。丁基和SP柱的容量至少比现用的上样量大4倍。SP洗出物中的毒素在SDS-PAGE上是纯的。基于Hc-ELISA，丁基柱的回收率为48％，SP柱的回收率为74％.基于UV的结果，每L培养物的总产量为16mg毒素。方法所用的时间收获之后，培养物在同一天或过夜保存后过丁基柱。丁基洗出物在上SP柱前常规过夜保存。先前的研究显示丁基洗出物最多稳定4天，此时间肉色谱图和SDS-PAGE图象均一致。SP洗出物的稳定性用毛细管电泳(CE)和SEC-HPLC评价。结果显示保存达两天的样品间没有差异。对这些样品的过滤后毒素回收率进行评价。与0天相比第2天的毒素回收率稍减小，但还不清楚这种减小是因为贮存还是因为实验差异。培养物的细胞密度用丁基柱色谱评价两倍浓缩的培养物和2×稀释的培养物，以研究培养物细胞密度对毒素纯化的影响。从两者过柱的色谱图来看是一致的。SDS-PAGE上两者的杂质和毒素条带一致。Hc-ELISA的结果(表7)显示两者的物料平衡(massbalance)均＞90％，而2×浓缩的培养物的回收率明显低于2×稀释的培养物。与2×稀释的培养物损失4％相比，在2×浓缩培养物毒素洗脱前损失29％的毒素。表7Hc-ELISA分析的APF毒素物料平衡生物负荷研究在方法的不同的步骤中监测生物负荷。对丁基上样、保存3天后丁基洗出物、SP上样、SP洗出物和过夜保存的SP洗出物进行评价。标出某些污染物(～＜1CFU/ml到35CFU/ml)。污染量最高的样品是丁基洗出物。污染物可能是由于进行纯化的过程中没有控制环境。4MNaCl的影响为了评价4MNaCl对培养物毒素的影响，含4MNaCl的培养物保存在4℃过夜，然后过丁基柱和SP柱。色谱结果、SDS-PAGE和Hc-ELISA显示4MNaCl对过夜保存的培养物没有影响。培养基(3∶1∶1与5∶1∶1)对2.5升的5∶1∶1和3∶1∶1培养物进行评价。Hc-ELISA对每种纯化的毒素回收率分析总结于表8。两种培养物纯化的毒素在SDS-PAGE上为纯的，这说明用3∶1∶1培养物研究出的方法可用于纯化5∶1∶1培养物的毒素。表8基于Hc-ELISA的毒素回收率SPSepharoseHP色谱的工作pH在不同的pH值3.5、4.2和4.5进行SPSepharoseHP色谱。发现pH3.5引起柱中毒素沉淀，用400mMNaCl洗脱没有毒素，用1MNaCl得到非常少的毒素。在pH4.5时毒素不结合于SP柱。先前在pH4.2所得的结果显示毒素并不如在pH4.0时结合牢固，并且在300mMNaCl冲洗峰之后以宽峰被洗脱。结果显示这步中pH是关键，最佳的pH范围很窄。实施例14对纯化肉毒毒素复合物的两柱APF色谱方法的评价实施例12的两柱纯化方法所得的各种洗脱液按以下所述评价。A.丁基SepharoseFF色谱过滤的3∶1∶1培养基作为进样使用。在将进样(A型肉毒毒素[Hall菌株]Schantz发酵澄清的培养物)向丁基SepharoseFF柱(XK50/10，柱直径5cm，床高10cm，柱体积196ml)上样前，向2500ml培养物中加入584.4gNaCl搅拌～30min。与常规不同，将进样pH调至5.81，将过柱流速定为92cm/h(正常流速是100cm/h)。上样体积为2800ml。上样后，柱子用5CV或1000ml的50mMNaPi，4MNaCl，pH6.0冲洗，之后再用15CV或3000的50mMNaPi，2MNaCl，pH6.0冲洗。然后用5CV或1000ml的50mMNaPi，1MNaCl，pH6.0从柱中洗脱结合的A型肉毒毒素复合物。肉毒毒素复合物洗脱后，牢固结合的杂质用4CV或800ml的50mMNaPi，pH6.0冲洗。接下来，用2CV(400ml)的0.1NNaOH柱子冲洗，在处理用过的树脂前使得残留的毒素失活。毒素洗脱的色谱图显示于图3。图3表明所用的丁基柱可使得肉毒毒素复合物与存在于澄清培养液进样液中的杂质良好地分离。通过UV280nm测得，图3显示流出峰和2MNaCl、1MNaCl、0MNaCl和0.1NNaOH的峰。基于峰的大小，确定大多的杂质在流出的部分中除去。于1MNaCl的毒素部分洗脱前，大量的杂质也在2MNaCl部分中除去。图3是从APF澄清培养物(3.1.1培养物)过丁基疏水柱获得的。X轴表示流过柱子的液体(流出液)体积(ml)。Y轴表示在280nmUV吸光度(mAU)。另外，色谱过程中监测电导率(分离图线)。如图3，流过柱子的许多蛋白杂质在约第一个大约3000mls中。4MNaCl和2MNaCl冲洗缓冲液引起随后的小峰，尽管是小峰也是显示除去额外的杂质。1MNaCl的使用(约7000ml体积)导致结合于柱子的毒素复合物洗脱，并且它是上样到第二根柱的部分。B.SPSepharoseHP色谱图4的轴与图3表示的相同。获得图4色谱所实行的步骤如下(1)从实施例12(图3所得丁基柱洗脱液)所得的100ml丁基洗脱液用pH4.0的400ml20mM柠檬酸钠缓冲液稀释(因此五倍稀释)。稀释的丁基洗脱液的pH为4.1。(2)然后将466ml该进样加到SPSepharoseHP柱(XK26/10，柱直径2.6cm，床高10cm，柱体积53ml)。(3)上样后，用5CV或250ml的20mM柠檬酸钠，pH4.0冲洗(在图4的X轴约450ml的体积点)柱子。(4)然后用4CV或200ml的20mM柠檬酸钠，300mMNaCl，pH4.0(在图4的X轴的725ml体积点)冲洗柱子。(5)结合肉毒毒素复合物毒素的柱子然后用3CV或150ml的20mM柠檬酸钠，400mMNaCl，pH4.0洗脱(在图4X轴约925ml体积点)。(6)柱结合毒素复合物洗脱后，柱子进一步用3CV或150ml的20mM柠檬酸钠，1MNaCl，pH4.0冲洗，以洗脱牢固结合的杂质(在图4X轴的1050ml体积点)。(7)然后用3CV或150ml的0.1NNaOH清洗柱子(图4X轴的1200ml体积点后)。图4色谱图显示在图4X轴上1000ml体积点前，A型肉毒毒素复合物(约900kDa分子量)的洗脱。图4表明高度纯化的复合物可通过使用SPSepharose柱，随后使用丁基柱而获得。图3显示有一个流出的宽峰，一个300mMNaCl冲洗的小峰，400mM毒素洗脱峰和1MNaCl清洗峰。如图5B中的SDS-PAGE所分析，在流出的(宽峰)部分中无可见的蛋白条带，300mMNaCl冲洗部分和1MNaCl清洗部分有一些杂质蛋白条带。毒素在400mMNaCl洗脱部分中洗脱出来。C.分析结果SDS-PAGE丁基柱和SP柱的洗脱部分用SDS-PAGE分析，其典型结果在图5A(丁基柱)和图5B(SP柱)中显示。图5和6是还原SDS-PAGE的凝胶电泳的记录结果。图5和6凝胶电泳记录的左边竖直标记千道尔顿(kDa)表示的递减分子量。图5和6中数字1到6，1到7或1到8表示凝胶上样的部分。在图5A中1项(凝胶泳道1)“标记12”是标准分子量Novex分子量标记；泳道2是澄清的培养物进样液；泳道3是丁基柱流过(“FT”，)和4M的冲洗得到的整分试样。泳道4是从2M冲洗得到的整分试样；泳道5是2M冲洗的尾部分的整分试样；泳道6是1M洗脱部分的整分试样；泳道7是1M洗脱尾部分的整分试样，和；泳道8是0M冲洗而得的整分试样。图5A表明丁基柱除去许多杂质(参见图5A泳道3-5)，并提供了初始纯化的肉毒毒素(参见图5A泳道6-8)。在图5B中1项(凝胶1泳道)“标记12”与图5A所用的分子量标记相同；泳道2为稀释的丁基柱洗脱液；泳道3为柱通流的整分试样；泳道4是300mM冲洗而得的整分试样；泳道5是柱洗脱液的整分试样；泳道6是1M冲洗而得的整分试样。图5B表明使用SP柱随后使用丁基柱可得到高度纯化的毒素(参见图5B中泳道5)。Hc-ELISA用Hc-ELISA(确定毒素重链浓度为基础的毒素浓度的ELISA分析方法)分析毒素浓度，并评估纯化过程中的毒素物料平衡。表9显示在典型的纯化方法的丁基和SP柱中的毒素浓度和步骤回收率。丁基和SP柱后的总回收率为28.6％。SEC-HPLCSEC-HPLC的结果表明与Hc-ELISA的62.5％相比SP色谱步骤回收率为42.9％。这说明SP柱步骤后的肉毒毒素回收率大约为50％。标准化产量毒素产量标准化为过一次丁基色谱后每L培养液22.3mg(经SEC-HPLC)或23.4mg(经Hc-ELISA)，和过一次SP色谱后每L培养液9.6mg(经SEC-HPLC)或8.9mg(经Hc-ELISA)。因此，用本发明所述的两柱系统和方法，可从每10L发酵培养基澄清培养物(按实施例6或7发酵方法获得的)中纯化得到约50mg到约90mg的肉毒毒素复合物。表9典型的丁基和SP色谱方法中毒素浓度和物料平衡实施例15柱色谱后毒素复合物稳定化和贮存方法1.研究原理柱色谱后，优选通过UF/DF步骤先将纯化的肉毒毒素复合物按所需浓度转移到稳定的缓冲液中，之后过滤除菌由此得到适用于配制肉毒毒素药物组合物的毒素。纯化的肉毒毒素或者以可溶的形式在醋酸缓冲液中保存或者作为硫酸铵悬浮液保存。(96)UF/DF步骤在UF/DF步中使用聚醚砜Biomax-10膜(NMWCO10kDa，Millipore)。选择50mMNaAc，pH4.0作为渗滤缓冲液。SP洗出物超滤至1mg/ml，然后用8个渗滤体积(DV)的50mMNaAc，pH4.0渗滤。超滤(UF)是一种将极小粒子和不溶的分子从液体中分离的方法。尽管次要因素如分子形状和电荷有影响，但分离的主要基础是分子大小。分子量大小范围在1,000到1,000,000的物质被超滤膜截留，而盐和水通过膜。胶态和粒状物质也能被截留。渗滤(DF)是将较小的分子冲洗穿过膜并使较大的分子留在渗余物中并最终不改变浓度的分级分离方法。DF可用于除去盐或者交换缓冲液。DF还可除去乙醇和其它小的溶剂和添加剂。进行渗滤有多种方式。在连续的渗滤中，以与滤液产生相同的速率将渗滤溶液(水和缓冲液)加到样品进样储存器中。按这种方法，样品储存器中的的体积保持恒定，但可以自由通过膜的小分子(如盐)被冲走。以除盐为例，每次增加的渗滤体积(DV)进一步降低了盐浓度(渗滤体积是在渗滤溶液加入前的样品体积。)。用5个渗滤体积连续渗滤将离子强度减少99％。在不连续的渗滤中，溶液先被稀释然后浓缩回开始的体积。然后将这个方法重复直至达到留在容器中的要求的小分子浓度。每次增加的渗滤体积进一步减少盐浓度。渗滤体积是稀释液加入前的样品体积。用5个渗滤体积连续渗滤将离子强度减少96％。连续渗滤要求较少的滤过体积以使盐降低的程度达到与不连续渗滤相同。3.0.22μm过滤步骤过滤步骤选用低蛋白结合的0.22μm的醋酸纤维素真空瓶口滤器。4.硫酸铵沉淀步骤然后进行硫酸铵沉淀将3.5M的硫酸铵加到0.22μm过滤的毒素溶液并轻轻搅拌至第一次出现乳光。纯化的原料毒素然后保存于2-8℃。5.典型的柱后过程的结果用PelliconBiomax-10在实验室级别TFF系统(Millipore)上将SP洗出物从70.5ml浓缩到18ml，并用8DV的50mMNaAc，pH4.0渗滤。收集渗余液(UV/DF后)并用Corning0.22μmCA滤器(Corning431154)过滤。UF/DF系统用醋酸缓冲液冲洗。收集冲洗的部分。0.22μm过滤后的10ml滤液保存于2-8℃用于稳定性研究。0.22μm过滤后的8ml滤液用硫酸铵沉淀。直到形成乳白色时总共向滤液中加入了2.8ml3.5M硫酸铵。表10显示基于UV测量评价的毒素回收率。图4显示SDS-PAGE的结果。在图6中所示的泳道表示泳道1为M12，分子量标准。泳道2为SP柱洗出物。泳道3为UF/DF渗余液SP洗出物UF/DF后的UF/DF渗余液，稀释到与泳道2上样蛋白相同的量用以比较。泳道4为UF/DF膜完成后从冲洗UF/DF膜而得UF/DF冲洗液。泳道5为0.2μm过滤后；UF/DF方法后和样品经0.22μm滤器过滤后。泳道6为柱后硫酸铵混悬液；0.22μm滤器过滤后，样品用硫酸铵沉淀，这是因为肉毒毒素复合物在硫酸铵中稳定。泳道7为UF/DF渗余液(与泳道3相同)，但不稀释以表明详细情况。图6告诉我们通过SDS-PAGE的分析确定，柱纯化方法后的UF/DF、0.22μm过滤和硫酸铵沉淀的步骤不影响肉毒毒素复合物的纯度。值得注意的是，MLD50的结果表明纯化的肉毒毒素复合物的效力为2.9-3.7×107MLD50单位/mg。表10基于UV测得的毒素回收率*采自8ml过滤后部分图7是优选的不含动物蛋白，纯化A型肉毒毒素复合物的两柱色谱方法流程图。该法是获得纯化的肉毒毒素900kDa复合物的稳定的、可放大或缩小规模并遵从cGMP的方法。在图7中可注意到通过用pH4的柠檬酸钠缓冲液稀释5倍使丁基洗出物达到适用于离子交换色谱的条件。图7的方法还可用于通过将SP柱洗脱液在pH8缓冲液中加到离子交换色谱柱使得非毒素复合物蛋白与150kDa肉毒毒素分子解离，由此得到(在柱流通液中)大约150kD分子量且特异性效力为1-2×108LD50U/mg或更大的A型肉毒毒素(神经毒素成分)，从而用于获得纯的肉毒毒素(即150kDa的不含非毒素复合物蛋白的肉毒毒素)。该方法也可通过将复合物解离成各个成分且随后纯化解离的成分，用于获得肉毒毒素复合物的其它非毒素成分(即非毒素血凝蛋白和/或非毒素非血凝素蛋白)。我们的方法得到的纯化的毒素复合物符合或优于表1所述的说明。另外，10L细胞培养物中的典型产量大约为100mg900kDa毒素复合物，这比Schantz方法(非APF)获得的产量高。本发明的优点包括1.方法中没有使用动物来源的成分或物质。特别是不使用DNA酶和RNA酶。2.每10升发酵培养基可获得具有表1所述的特征的A型肉毒毒素复合物多于约50mg。3.纯化的毒素是从稳定、可放大或缩小规模、可验证和遵从cGMP的方法得到的。稳定是指方法可重现，甚至在一个或多个方法参数有约±10％的变动时仍可重现。可验证是指方法持续产出表1特征的纯化毒素。cGMP是指方法可易转变成遵从FDA要求的现代药品生产质量管理规范的生产方法。4.最终纯化的肉毒毒素复合物的效力达到或优于由Schantz或改进的Schantz方法纯化得到的肉毒毒素复合物的效力(用MLD50分析测得)。5.省略纯化肉毒毒素复合物的任意沉淀步骤。本发明引用了多种出版物、专利和/或参考文献，其全部内容通过引用的方式纳入本说明书。尽管已经针对某些优选的方法详尽地叙述了本发明，但也有可能采用在本发明范围内的其他实施方案、版本和修改。例如，很多种不含动物产物的系统和方法(包括色谱肉毒毒素纯化方法)均包含于本发明的范围之中。因此，以下权利要求的精神和范围不应局限于上述优选实施方案的说明。权利要求1.一种纯化梭菌毒素的方法，该方法包括如下步骤(a)获得肉毒毒素发酵培养物样品；(b)将培养物样品与第一根色谱柱树脂接触使得第一根柱俘获肉毒毒素；(c)将肉毒毒素从第一根柱洗脱下来，并且；(d)将来自第一根色谱柱的洗脱液加到第二根色谱柱树脂上，由此获得纯化的肉毒毒素；2.权利要求1的方法，其中第一根色谱柱和第二根色谱柱是不同的柱子，并且两种不同的柱子通过不同的纯化机制纯化肉毒毒素。3.权利要求1的方法，其中第一根色谱柱是疏水作用柱。4.权利要求1的方法，其中第二根色谱柱是离子交换柱。5.权利要求1的方法，其中该方法还包括接触步骤之后和洗脱步骤之前，将杂质从第一根柱子冲洗下来的步骤。6.权利要求1的方法，其中该方法还包括加样步骤之后将杂质从第二根柱子冲洗下来的步骤。7.权利要求6的方法，其中该方法还包括将杂质从第二根柱子冲洗下来后，从第二根柱子洗脱肉毒毒素的步骤。8.权利要求1的方法，其中该方法为基本不含动物制品(“APF”)的方法。9.权利要求1的方法，其中该方法为实质上为APF的方法。10.权利要求1的方法，其中该方法为APF方法。11.权利要求1的方法，其中肉毒毒素发酵培养物由基本上为APF的方法获得。12.权利要求1的方法，其中肉毒毒素发酵培养物由实质上为APF的方法获得。13.权利要求1的方法，其中肉毒毒素发酵培养物由APF方法获得。14.权利要求1的方法，其中每10升肉毒毒素发酵培养物纯化的肉毒毒素产量每批大于约50mg。15.权利要求1的方法，其中纯化的肉毒毒素具有以下特征(a)外观呈白色至灰白色混悬液；(b)每ml洗脱液肉毒毒素复合物的浓度为2.0-3.6mg；(c)260nm处的吸光度与278nm处的吸光度比值(A260/A278)小于或等于0.6；(d)特异性效价按MLD50单位/mg计为2.4×107到5.9×107/mg肉毒毒素；(e)免疫学特征为肉毒神经毒素A型复合物；(f)SDS-PAGE特征符合标准；(g)SEC-HPLC特征为900kDa毒素复合物＞总峰的95％，和；(h)方法稳定、可放大或缩减规模、可验证且遵从cGMP。16.由按照权利要求1的方法获得的纯化的肉毒毒素。17纯化肉毒毒素的APF方法，包括(a)获得肉毒毒素发酵培养物样品，其中肉毒毒素发酵培养物由基本上为APF的方法获得；(b)将培养物样品与疏水作用色谱柱树脂接触，使得肉毒毒素被第一根柱俘获；(c)将杂质从疏水作用色谱柱中冲洗下来；(d)将肉毒毒素从疏水作用色谱柱中洗脱下来；(e)将疏水作用色谱的洗脱液加样到离子交换色谱柱；(f)将杂质从离子交换柱上冲洗下来，和；(g)从离子交换柱洗脱肉毒毒素，由此通过基本上为APF纯化方法的纯化肉毒毒素的方法获得纯化的肉毒毒素。18.权利要求17的APF方法，还包括，获得肉毒毒素发酵培养物步骤后和培养物样品与疏水作用色谱树脂接触之前，处理澄清培养物适于疏水作用色谱的步骤。19.权利要求17的方法，还包括从疏水作用柱洗脱肉毒毒素的步骤后和疏水作用色谱柱的洗脱液加样到离子交换树脂的步骤前，处理疏水作用柱的洗脱液适于离子交换色谱的步骤。20.纯化肉毒毒素的APF方法，该方法包括以下步骤(a)获得肉毒毒素发酵培养物的样品，其中肉毒毒素发酵培养物是从基本上为APF的方法获得；(b)处理澄清培养物适于疏水作用色谱；(c)将培养物样品与疏水作用色谱柱树脂接触，使得肉毒毒素被第一根柱俘获；(d)将杂质从疏水色谱柱上冲洗下来；(e)将肉毒毒素从疏水作用色谱柱上洗脱下来；(f)处理疏水作用柱洗脱液适于离子交换色谱；(g)用处理的疏水作用色谱柱的洗脱液加样到离子交换色谱柱树脂上；(h)将杂质从离子交换柱上冲洗下来，和(i)将肉毒毒素从离子交换柱上洗脱下来，由此通过基本上为APF纯化方法的纯化方法获得纯化的肉毒毒素。21.纯化梭菌毒素的系统，该系统包括(a)从发酵培养物俘获肉毒毒素的第一根色谱柱树脂；(b)用于从第一根柱洗脱肉毒毒素的洗脱缓冲液；(c)从第一根色谱柱的洗脱液俘获肉毒毒素的第二根柱色谱柱树脂，和；(d)从第二根柱洗脱肉毒毒素的第二洗脱液。全文摘要纯化来自不含动物产物(APF)发酵培养基的肉毒毒素的色谱方法和系统。文档编号C12N1/20GK1946738SQ20058000685公开日2007年4月11日申请日期2005年3月3日优先权日2005年3月3日发明者向辉,罗明江,王平,S·多诺万申请人:阿勒根公司