专利名称：鉴定样品中的pufa－pks的筛选方法
技术领域：
本发明描述了一种快速和简单鉴定在样品，例如，生物样品中，特别是在微生物中的PUFA-PKS基因(PUFA＝多不饱和脂肪酸；PKS＝多酮化合物合酶)的方法。其特征是对于产生PUFA的PKS特异性的DNA片段的体外复制。除了鉴定适当的DNA序列之外，本发明还基于扩增它们的实验条件的确立。
术语PUFAs(多不饱和脂肪酸)表示具有链长度＞C12和至少两个双键的多重不饱和长链脂肪酸。有两个PUFA的主要家族，其根据相对于烷基末端，第一个双键在ω-3和在ω-6脂肪酸中的位置而区别。它们是细胞膜的重要组分，在那里它们以脂质，特别是磷脂的形式存在。PUFAs还作为在人和在动物中的重要分子，例如，前列腺素，白三烯和环前列腺的初级阶段而起作用(A.P.Simopoulos，essential fattyacids in health and chronic disease，Am.J.Clin.Nutr.1999(70)，pp.560-569)。ω-3脂肪酸族的重要代表是DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)，其可以在鱼油和在海洋微生物中发现。ω-6脂肪酸的重要代表是ARA(花生四烯酸)，其出现在，例如，丝状真菌中，但是也可以从动物组织如肝和肾中分离。DHA和ARA在人母乳中彼此相接出现。
PUFAs对于人来说在适当发育方面，特别是对于发育脑，组织形成及其修复是必需的。因而，DHA是人细胞膜的重要组分，特别是神经的细胞膜。另外，DHA在脑功能的成熟中发育重要作用并且对于视力的发育是必需的。ω-3PUFAs如DHA和EPA被用作营养添加剂，因为具有DHA充分供应的平衡营养对于某些疾病的预防有利(A.P.Simopoulos，Essential fatty acids in health and chronic disease，AmericanJournal of Clinical Nutrition 1999(70)，pP.560-569)。例如，患有非胰岛素依赖型糖尿病的成人呈现与后来出现的心脏问题相关的DHA平衡的缺陷或者至少是失衡的DHA平衡。同样地，神经元疾病如，例如，阿尔茨海默病或精神分裂症伴随着低的DHA水平。有大量的DHA商业提取物的来源，例如，来自海洋冷水鱼的油，蛋黄部分或海洋微生物。适于提取n-3PUFA的微生物发现于，例如，弧菌属(Vibrio)的细菌中(例如，海产弧菌(Vibrio marinus))或腰鞭毛虫(Dinophyta)中，其中特别是Crypthecodinium属，如C.cohnii或在Stramenopiles(或Labyrinthulomycota)中，如Pinguiophyceae例如，Glossomastix，Phaeomonas，Pinguiochrysis，Pinguiococcus和Polypodochrysis。其它生产PUFA的优选微生物特别属于Thraustochytriales目，(Thraustchytriidea)Japonechytrium属，Schizochytrium属，Thraustochytrium属，Althornia属，Labyrinthuloides属，Aplanochytrium属和Ulkenia属。被孢霉属(Mortierell)，Entomophthora属，Phytium属和Porphyridium属的微生物被用于ARA的商业生产。
商业上使用的PUFA的来源如植物或动物的特征经常是提取自它们的油的组成非常不均匀。以这种方式提取的油必须进行昂贵的纯化处理以便能够富集一种或几种PUFAs。来自这些来源的PUFA的供应也会发生不可控制的波动。因而，疾病和天气影响可减少动物也可减少植物的产量。从鱼中提取PUFA出现季节波动并且甚至可以由于过度捕捞或气候变化(例如，厄尔尼诺现象)而暂时性地急剧受限。动物油，特别是鱼油，可以通过食物链从环境中积聚有害物质。已知动物受有机氯化物如，例如，多氯化联苯高度胁迫，特别是在商业性鱼场中，其抵消了鱼类消费的健康方面(Hites等，2004，Globalassessment of organic contaminants in farmed salmon，Science 303，pp.226-229)。鱼产品质量的所得损失导致消费者对于鱼和鱼油作为ω-3PUFA来源的接受度下降。另外，从鱼纯化DHA因为高度技术需要而相对昂贵。另一方面，DHA存在于少数海洋微生物，占细胞总脂肪组分的大约50％，并且它们可在大的发酵罐中进行相对经济地培养。微生物的另一个优点是提取自它们的油组合物限于一些组分。
对于长链PUFA的生物合成已知两种不同的生物代谢途径。对于所谓的Sprecher途径来说，通过延长和去饱和步骤以及停止缩短的流程由棕榈酸起始来合成长链PUFAs如DHA和EPA(H.Sprecher，Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids.Biochimica etBiophysica Acta 1486(2000)pp.219-231)。在大多数生物中如所述或以相似的方式采用这种生物合成途径，甚至在人和植物中。不过，某些海洋生物采取不同的生物合成途径进行EPA和DHA的生产。这些生产PUFA的微生物包括γ蛋白细菌的海洋代表和到目前为止的真核原生生物Schizochytrium。它们通过所谓的多酮化合物合酶(PKS)来合成长链PUFA。这些PKSs代表催化由酮化合物(ketide)单位组成的次级代谢产物合成的大酶(G.W.Wallis，J.L.Watts and J.Browse，Polyunsaturated fatty acid synthesiswhat will they think of next？Trendsin Biochemical Sciences 27(9)(2000)pp.467-473)。多酮化合物的合成包含许多与脂肪酸合成类似的酶反应(Hopwood & Sherman Annu.Rev.Genet.24(1990)pp.37-66；Katz & Donadio Annu.Rev.of Microbiol.47(1993)pp.875-912)。
已知不同PUFA-PKSs(PUFA-合成性PKSs)的基因序列。由此，从海洋细菌Shewanella sp.中分离出38kb的基因组片段，其包含生产二十碳五烯酸(EPA)的信息。有可能通过包含在基因组片段中的基因簇的转移而在大肠杆菌(E.coli)和Synechoccus中生产EPA。随后对这一片段的测序导致鉴定了8个开放阅读框(ORFs)(H.Takeyama等，Microbiology 143(1997)pp.2725-2731)。来自Shewanella的这些开放阅读框的其中五个与多酮化合物合酶基因密切相关。另外的PKS样基因簇也发现于其它产生PUFA的海洋细菌如，例如，海产弧菌中(M.Tanaka，等，21(1999)pp.939-945)。类似的产生PUFA的，PKS样ORFs也能够在真核性原生生物Schizochytrium中鉴定(Metz等，Science 293(2001)pp.290-293和WO 00/42195)。在Schizochytrium中确定了三种ORFs，其与来自Shewanella的EPA基因簇呈现部分同一性。在少数原核生物和真核生物Schizochytrium中存在这些保守性PKS基因给出了暗示，PUFA-PKS基因可能在原核生物和真核生物之间进行了水平转移。
目前关于PKS在个别物种之间的分布仍然知之甚少。因而，例如，Schizochytrium的系统发育上的近亲，海洋原生生物Thraustochytriumsp.，似乎没有PKS，即使它像Schizochytrium一样富含DHA。它利用极少出现的δ-4去饱和酶生产长链PUFA(X Qiu等，J.Biol.Chem.(2001)pp.31561-31566)。Thraustochytrium和Schizochytrium二者都属于Thraustochytriales目，但对于生产长链PUFA却具有完全不同的生物合成途径。所以，在确定PUFA-PKS基因在海洋微生物中的分布上有很大兴趣，特别是关于为了以商业规模可能性生产个别PUFAs而发现新的潜在PUFA生产者。此外，当前需要特别有效的筛选方法以便以高通量对大量海洋微生物检查PUFA生产者。另外，许多不同PUFA-PKS的知识应当提供关于基因重排和相应酶的结构的信息并且以此提供生产不同PUFAs的信息。这对于许多其它应用，例如，对于在转基因微生物或植物中生产PUFA特别重要。通过基因的变异可以转基因地生产具有不同PUFA组合的由设计者设计的油。
专利申请WO 02/083870 A2描述了一种鉴定包含PUFA-PKS基因的生物的方法。它在一方面是基于有关脂肪酸范围的五种选择标准，所述范围应当在某些培养条件下给出以便作为PUFA-PKS系统的指示物而起作用。符合的选择标准越多，对于PUFA-PKS系统的指示就越强。它在另一方面是基于DNA印迹分析，其中转移到印迹膜上的限制剪切的基因组DNA由潜在的PUFA-PKS候选物(符合五个选择标准)与PUFA-PKS特异性核酸序列杂交。接下来在示例性实施方案中对此第二个检测步骤进行扩展来确证基因组DNA库的筛选结果。另外，专利申请WO 02/083870描述了富集和选择合适微生物作为上述筛选方法的预选择的策略。
不过，对于本领域技术人员显而易见的是在WO 02/083870 A2中所述的筛选方法非常昂贵并且因此不适于进行高通量筛选。而且，在第一个筛选步骤中的选择参数的评估似乎非常含糊，其可能在第二个筛选步骤中导致阴性结果。
所以根据技术状态本发明具有这样的任务，即提供一种在不同微生物中鉴定PUFA-PKS基因的方法。该方法应当使得有效地，经济地和在短时间内广泛筛选微生物成为可能。所述筛选应当以高通量进行，而无需昂贵的样品制备。
通过本发明的权利要求书中所定义的主题解决了这一任务以及其它未曾被明确地提及但可以从本文件初始讨论的上下文中轻易得到或总结的任务。
通过权利要求1中定义的方法给出了鉴定微生物中PUFA-PKS基因的有利方法。此方法包括利用源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL(SEQID No.5)的降解寡核苷酸(引物)通过聚合酶链式反应(PCR)体外扩增来自样品，优选生物质量(biomass)，特别是来自微生物的核酸。源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL(SEQ ID No.5)的核酸序列代表，例如，序列5’-CTC GGC ATT GAC TCC ATC AAG CGT GTC GAG ATTCTC-3′(SEQ ID No.6)。根据本发明使用这里所述的降解引物导致在产生PUFA的微生物中鉴定了PKS基因片段。
根据本发明的方法令人惊讶地仅仅以源自上述一种氨基酸序列片段的寡核苷酸而得以实施。另外令人吃惊的是，可以在很大程度上省略包含大量N碱基或，例如，肌苷的重度简并的寡核苷酸。
所述方法包含所有能够源自上述氨基酸序列LGIDSIKRVEIL(SEQ ID No.5)的寡核苷酸用于扩增和鉴定PUFA-PKS基因。寡核苷酸的选择独立于选定的部分序列的长度并且独立于其方向(有义或反义或互补或非互补)。
在优选的形式中，将具有10-36bp，优选15-25bp和特别优选18bp长度的寡核苷酸用于本发明的检测方法中。
所用寡核苷酸的量可以变化，只要对于PUFA-PKS存在的检测方法没有副作用。这对于所有其它用于PCR反应中的成分也适用。
在优选的实施方案中，所用寡核苷酸的杂交于退火温度45℃-65℃，优选50℃-60℃和特别优选于53℃-57℃发生。
PCR的个别阶段，即，变性，退火和延伸的持续时间也可以变化，只要对于PUFA-PKS存在的检测方法没有副作用。
PCR循环数也可以变化，但优选在20和40个循环之间，特别优选在25和35个循环之间，并且非常特别优选大约30个循环。
可以将所有来自待研究微生物的可分离DNA和RNA核酸以及产生自mRNA的cDNA用作PCR的模板。在具体的实施方案中，可以将完整的细胞或生物质量用作PCR的模板。
在另一个实施方案中，还可以将根据本发明的寡核苷酸用作杂交探针来检测互补核酸序列。
特别地，根据本发明的方法适于高通量筛选微生物的PUFA-PKS基因。
因此，本发明还包括用权利要求1-7的方法或通过使用根据权利要求9的核酸序列作为杂交探针可获得(可鉴定)的核酸。
还包括含有根据权利要求11的核酸的微生物。
尽管对于产生PUFA的微生物有很大需求，但是在本发明之前尚无已知的基于PCR的有效检测方法来鉴定包含PUFA-PKS的微生物。Gentile等的论文的确描述了寡核苷酸对于扩增PUFA-PKS基因序列的可能的用途；不过，所述的寡核苷酸并非源自ACP结构域或源自本发明所基于的氨基酸序列LGIDSIKRVEIL(Gentile等，2003J.Appl.Microbiol.(95)pp.1124-1133)。
有人怀疑已然以多拷贝存在的序列片段(PKS的APC结构域)的扩增是这里所述PCR方法的高效的基础。在PCR开始时存在大量靶序列可能导致效率的提高。这在筛选过程中对于其部分导致了较高的命中率。不过，令人非常吃惊的是特异性PUFA-PKS基因能够在源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL的寡核苷酸的帮助下分离，因为APC结构域出现在非常多的其它基因中，例如，对于PUFA以及肽合成酶和脂肪酸合成酶一般并非特异性的PKS。这也被视为以往未曾尝试用来自LGIDSIKRVEIL序列的寡聚物进行PUFA-PKS基因克隆测试的原因。
另外，到目前为止仅仅开发了基于鉴定PUFA生产者的生物标记的费时得多和较不可靠的筛选方法(D.S.Nichols和T.A.McMeekin2002J.Microbiol.Methods 48(2-3)，pp.161-170)。
图1显示来自Moritella marina，Photobacterium profundum(菌株SS9)和Schizochytrium的少数几个先前已知的PUFA-PKSs的酰基载体蛋白结构域的位置和数目的比较。还显示了保守序列LGIDSIKRVEIL的重复数。
图2显示PCR产物(ACP结构域)与来自Schizochytrium的PUFA-PKS的序列同源性，所述PCR产物用源自序列LGIDSIKRVEIL，以及源自Ulkenia sp.SAM 2179的寡核苷酸扩增。
下面利用少数实施例介绍构成根据本发明方法基础的检测方法。不过，所述检测方法和本发明并不限于这些实施例。
实施例实施例1由来自Ulkenia sp.SAM2179的分离的DNA扩增PUFA-PKS特异性序列1.1基因组DNA的分离在250ml带有阻流板的Erlenmeyer烧瓶中用Ulkenia sp.SAM2179(Ulkenia spec BP-5601；WO9803671)接种50ml DH1培养基(50g/l葡萄糖；12.5g/l酵母提取物；16.65g/l Tropic Marin；pH 6.0)并于28℃和150rpm培养48h。随后用灭菌自来水洗涤细胞，离心下去并将细胞沉淀物冷冻于-85℃中。获得大约1.25g干重的细胞质量。为了进一步的检查(workup)，随后将细胞沉淀物转移入研钵中并以研棒在液氮下粉碎成精细粉末。随后，将大约1/10研成粉末的细胞材料与2ml裂解缓冲液(50mM tris/Cl pH 7.2；50mM EDTA；3％(v/v)SDA；0.01％(v/v)2-巯基乙醇)混合并于68℃温育1h。随后加入2ml苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，搅动并于10000rpm离心20min。在除去上层水相后，将后者转移入两个新的反应容器中，每个600μl，并且分别再次与600μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合，搅动并于13000rpm离心15min。随后将特定上层相每个400μl转移入新的反应容器中并在每种情形下加入1ml乙醇(100％)后倒转两到三次。随后，将沉淀的DNA缠绕在玻璃棒上，用70％乙醇洗涤，干燥并溶于50μl蒸馏水中，与2μl RNase A混合并保存于4℃。
1.2利用靶标特异性寡核苷酸的PCR反应将PCR引物MOF1和MOR1用作靶标(motive)特异性寡核苷酸。
MOF15’-CTC GGC ATT GAC TCC ATC-3’(Seq ID No.7)
MOR15’-GAG AAT CTC GAC ACG CTT-3’(Seq ID No.8)将在1.1中所述的来自Ulkenia sp.SAM2179的基因组DNA稀释1∶100。随后将2μl的这种稀释液转移入50μl体积的PCR反应混合物中(1x缓冲液(Sigma)；dNTPs(每种200μM)；MOF1(20pmol)，MOR1(20pmol)和2.5U Taq-DNA聚合酶(Sigma))。在下列条件下实施PCR起始变性94℃3min，随后为30个循环，每个循环于94℃1min，55℃1min，72℃1min和最后8min 72℃。随后通过凝胶电泳分析PCR产物并通过T/A克隆(Invitrogen)将具有合适大小的片段插入载体pCR2.1 TOPO中。在转化大肠杆菌TOP 10F’之后，分离质粒DNA(Qiaprep Spin，QUAGEN)并进行测序。
将获得的序列数据(SEQ ID No.1)与官方的EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/)相比较并进行评估。用FASTAX获得的序列比较对于来自Ulkenia sp.SAM 2179的PCR主要产物与来自Schizochytrium sp.ATCC 20888的PUFA-PKS(ORF A；ORF开放阅读框)的酰基载体蛋白产生部分同一性，其在氨基酸水平上为大约90％(图7)。令人吃惊的是，为了确定在Ulkenia sp.SAM 2179中的这种PUFA-PKS，仅须实施单次PCR实验。
实施例2由来自Schizochytrium sp.SR21的分离DNA扩增PUFA-PKS特异性序列2.1基因组DNA的分离在250ml带有阻流板的Erlenmeyer烧瓶中用Schizochytrium sp.SR21(Schizochytrium spec.，MYA-1381；EP0823475)接种50ml DH1培养基(50g/l葡萄糖；12.5g/l酵母提取物；16.65g/l Tropic Marin；pH6.0)并于28℃和150rpm培养48h。随后用自来水将细胞洗涤两次，离心下去并将细胞沉淀物冷冻于-85℃中。获得大约1.4g干重的细胞质量。随后，为了进一步的检查，随后将细胞沉淀物转移入研钵中并如先前所述(实施例1)进行处理来分离基因组DNA。
2.2利用靶标特异性寡核苷酸进行PCR反应将PCR引物MOF1和MOR1(见实施例1)用作靶标特异性寡核苷酸。
如1.2中所述以2μl来自Schizochytrium sp.SR21的基因组DNA进行PCR。
将获得的序列数据(SEQ ID No.2)与官方EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/)相比较并进行评估。用FASTAX获得的序列比较对于来自Schizochytrium sp.SR21的PCR主要产物与来自Schizochytrium sp.ATCC 20888的PUFA-PKS(ORF A；ORF开放阅读框)的酰基载体蛋白产生大约90％的部分同一性。令人吃惊的是，对于确定在Schizochytrium sp.SR21中的这种PUFA-PKS也仅须进行单次PCR实验。
实施例3直接由Schizochytrium sp.SR21的生物质量扩增PUFA-PKS特异性序列3.1生物质量(biomass)的获得在250ml带有阻流板的Erlenmeyer烧瓶中用Schizochytrium sp.SR21接种50m1 DH1培养基(50g/l葡萄糖；12.5g/l酵母提取物；16.65g/l Tropic Marin；pH6.0)并于28℃和150rpm培养48h。随后用自来水将细胞洗涤两次并离心下去。随后将以此方式获得的生物质量直接加入到相应的PCR反应中。
3.2利用靶标特异性寡核苷酸进行的PCR反应将PCR引物MOF1和MOR1(见实施例1)用作靶标特异性寡核苷酸。
用无菌牙签取等份的在3.1中获得的来自Schizochytrium sp.SR21的生物质量(biomass)并转移入50μl体积的PCR反应混合物中(1x缓冲液(Sigma)；dNTPs(每种200μM)；MOF1(20pmol)，MOR1(20pmol)和2.5U Taq DNA聚合酶(Sigma))。如1.2中所述进行PCR。
将获得的序列数据(SEQ ID No.2)与官方可使用的EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/)相比较并进行评估。用FASTAX获得的序列比较对于来自Schizochytrium sp.SR21的PCR主要产物与来自Schizochytrium sp.ATCC 20888的PUFA-PKS(ORF A；ORF开放阅读框)的酰基载体蛋白产生大约90％的部分同一性。获自Schizochytrium的生物质量的PCR产物的序列与实施例2中的序列相同。
令人吃惊的是，即使是此处对于确定来自Schizochytrium sp.SR21的生物质量的PUFA-PKS也仅须进行单次PCR实验。
实施例4直接由不同ulkenias的生物质量扩增PUFA-PKS特异性序列4.1生物质量的获得在250ml带有阻流板的Erlenmeyer烧瓶中用Ulkenia sp.SAM2179或Ulkenia visurgensis或另一种Ulkenia sp.接种50ml DH1培养基(50g/l葡萄糖；12.5g/l酵母提取物；16.65g/l Tropic Marin；pH6.0)并于28℃和150rpm培养48h。随后用自来水将细胞洗涤两次并离心下去。随后将以此方式获得的生物质量直接加入到适当的PCR反应中。
4.2利用靶标特异性寡核苷酸进行的PCR反应将PCR引物MOF1和MOR1(见实施例1)用作靶标特异性寡核苷酸。
用无菌牙签取等份的在4.1中获得的来自不同ulkenias的生物质量并转移入50μl体积的PCR反应混合物中(1x缓冲液(Sigma)；dNTPs(每种200μM)；MOF1(20pmol)，MOR1(20pmol)和2.5U TaqDNA聚合酶(Sigma))。如1.2中所述进行PCR。
将获得的序列数据(SEQ ID No.1，3和4)与官方EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/)相比较并进行评估。用FASTAX获得的序列比较与来自Schizochytrium sp.ATCC 20888的PUFA-PKS(ORF A；ORF开放阅读框)的酰基载体蛋白产生高度部分同一性。获自Ulkenia sp.SAM 2179的生物质量的PCR产物序列与实施例1中的序列相同。
令人吃惊的是，即使在此处对于确定来自不同ulkenias的生物质量的特定PUFA-PKS，每次也仅须实施单次PCR实验。
序列表序列表<110>努特诺瓦营养产品及食品成分有限公司(Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH)<120>鉴定样品中的PUFA-PKS的筛选方法(Screening method for PUFA-PKS genes)<130>SCT064800-47<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>357<212>DNA<213>Ulkenia sp.
<400>1ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctctctg aggtccaggc tatgcttaac60gttgaggcca aagatgttga tgctcttagc cgcacccgca ccgttggtga ggttgtcaac120gccacgaagg ctgagattgc tagcagctct ggtgctgctg cccctgctcc ggctgctgcc180gttgcaccgg cccctgctgc tgcccctgct gtcagcagcg ctctccttga gaaggccgaa240tctgttgtca tggaggttct cgccgccaag actggttacg agactgacat gattgaggcc300gacatggagc tcgagactga gctcggcatt gactccatca agcgtgtcga gattctc 357<210>2<211>321<212>DNA<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature<222>(149)..(149)<223>n stand for any base<400>2ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctctctg aggtccaggc tatgcttaac60gttgaggcca aggatgttga tgctcttagc cgcacccgca ccgttggtga ggttgtcaac120gccatgaagg ctgagattgc tagcagctnt ggtgctgctg cccctgctcc tgctgctgcc180gctgcaccgg cccctgctgc tgcccctgct gtcagcagcg ctctccttga gaaggccgaa240
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<400>4ctcggcattg actccatcaa acgtgtcgag atcctcagtg aggtgcaggc caagctgaac60gtagaggcca aagacgtcga tgcactcagc cgcactcgga ccgtaggtga ggtcgtcgac120gcaatgaagg ccgagataca aggatcgccg agtggctctc ctgctcctcc aagtgctccg180aaactgtcta gcccagtctc atcctcacca gccccaacca agttaatctc aaccagcacg240ctagcaatgg ccgagtctgt ggttatggag gtccttgccg caaagactgg ctacgaaccg300gacatgatcg aggcggacat ggagctcgag actgagcttg gcattgactc catcaagcgt360gtcgagattc tc372<210>5<211>12<212>PRT
<213>Ulkenia sp.
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权利要求
1.一种证明样品中PUFA-PKS基因特异性核酸序列的方法，其中(a)利用特异性寡核苷酸并以小部分的样品作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，和(b)对获得的PCR产物进行测序并将获得的序列信息与数据库相比较以便通过与已知序列的部分一致来鉴定新的PUFA-PKS序列信息，其特征是所用的寡核苷酸源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL。
2.根据权利要求1的方法，其特征是所述寡核苷酸是简并性的。
3.根据任一项在前权利要求的方法，其特征是所述寡核苷酸的长度为10-36bp，优选15-25bp并且特别优选18bp。
4.根据任一项在前权利要求的方法，其特征是所用寡核苷酸的量优选为大约20pmol。
5.根据任一项在前权利要求的方法，其特征是退火温度为大约45-65℃，优选为大约50-60℃并且特别优选为大约53-57℃。
6.根据任一项在前权利要求的方法，其特征是循环数为大约20-40，优选为大约25-35并且特别优选为30。
7.根据任一项在前权利要求的方法，其特征是分离自生物质量的核酸或生物质量本身被用作PCR的模板。
8.SEQ ID No.5中所示的氨基酸序列LGIDSIKRVEIL。
9.可衍生自SEQ ID No.5的核酸序列，优选在SEQ ID No.6，7和8中所示的核酸。
10.根据权利要求9的核酸，用作杂交探针。
11.以权利要求1-7的方法或者通过使用根据权利要求9的核酸序列作为杂交探针可以获得的(可以鉴定的)核酸。
12.包含根据权利要求11的核酸的微生物。
全文摘要
本发明涉及快速简单地鉴定微生物中的PUFA－PKS的方法。所述方法的特征在于，代表PKS的特异性生产PUFA(多不饱和脂肪酸)的DNA片段可在体外再现。PUFA－PKS特异的氨基酸序列LGIDSIKRVEIL使之衍生寡核苷酸成为可能，所述寡核苷酸通过PCR有效筛选PUFA－PKS基因或产生PUFA的微生物。本发明方法尤其适用于高通量筛选微生物的PUFA－PKS基因。
文档编号C12Q1/68GK101048514SQ200580018877
公开日2007年10月3日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者马尔库什·卢伊, 马西亚斯·鲁辛 申请人:努特诺瓦营养产品及食品成分有限公司