表达pdx1的内胚层的制作方法

专利名称：表达pdx1的内胚层的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和细胞生物学领域，尤其是包含哺乳动物PDX1-阳性内胚层细胞的组合物及其产生、分离和使用此类细胞的方法。
背景技术：
人多能性干细胞(pluripotent stem cell)，如胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(EG)，于1994年首先从无成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Bongso et al.，1994)，1997年从含成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Hogan，1997)。随后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有丝分裂失活的小鼠饲养层连续培养人ES和EG细胞的方法(Reubinoffet al.，2000；Shamblott et al.，1998；Thomson et al.，1998)。
人ES和EG细胞(hESC)为研究人类早期发育和为治疗性干预一些疾病状态(如糖尿病和帕金森氏症)提供了极难得的机会。例如，在采用细胞疗法治疗糖尿病的过程中，使用衍生自hSEC的产生胰岛素的β细胞会比目前利用来自供者胰腺的细胞治疗糖尿病有很大进步。但目前还不知道如何从hSEC得到产生胰岛素的β细胞。因此，目前利用来自供者胰腺的胰岛细胞治疗糖尿病的细胞疗法受限于缺乏移植所需的高质量胰岛细胞。对单一I型糖尿病人的细胞治疗需要移植大约8×108胰岛细胞(Shapiro et al.，2000；Shapiro et al.，2001a；Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰岛细胞至少需要两个健康供者的器官提供。而人胚胎干细胞为开发用于人类细胞治疗的大量的高质量分化细胞提供了起始材料的来源。
多能性和能够维持hSEC细胞较长时间培养这两个性质使其特别适合用于细胞治疗。多能性是指hESC能够分化为所有3种主要胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物，进而在除胚胎外组织(如胎盘)和生殖细胞外还形成成熟器官的所有体细胞类型的能力。尽管多能性赋予了hSEC特殊的用途，但这个性质也给这些细胞及其衍生物的研究和控制带来挑战。由于在分化hSEC培养基中会产生大量细胞类型，所以大部分细胞类型产生效率很低。而且，成功评价任一指定细胞类型的产生关键取决于定义合适的标志物。高效、定向的分化对hESCs的治疗应用非常重要。
解决上述问题对利用hSEC作为起始材料产生用于细胞治疗的细胞非常有利。例如，为获得胰岛细胞移植治疗所需的细胞材料的水平，有利的是在分化的最早期高效地使hESC定向为胰岛/β细胞系。
除了分化过程的高效定向，另外还有利的是在向胰岛/β细胞系分化过程中分离和鉴定中间细胞类型，并利用这些细胞作为进一步分化的合适的前体细胞系。
发明概要本发明的实施方案涉及包含表达PDX1(PDX1-阳性)的内胚层细胞的组合物及产生该组合物的方法。其他实施方案涉及富含PDX1-阳性内胚层细胞的细胞群以及产生该细胞群的方法。其它实施方案涉及增强内胚层细胞PDX1的表达以及鉴别用于进一步分化PDX1阴性和/或PDX1-阳性内胚层的因子的方法。在贯串本申请描述的组合物和方法的一些实施方案中，PDX1-阳性内胚层细胞是PDX1-阳性前肠/中肠内胚层细胞。在贯串本申请描述的组合物和方法的一些优选实施方案中，PDX1-阳性内胚层细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。在其他优选实施方案中，PDX1-阳性内胚层细胞是前肠末端的PDX1-阳性内胚层细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物，其中PDX1-阳性前肠内胚层细胞是多潜能细胞(multipotentcell)，可以分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含人细胞。在此人细胞培养物中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞包含占培养物中人细胞的至少约2％、至少约5％、至少约10％或至少约25％。在一些实施方案中，计算所述至少约2％、至少约5％、至少约10％或至少约25％时没有考虑所述培养物中的饲养细胞。在此处描述的一些细胞培养物的实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可表达选自同源框A13(HOXA13)基因、同源框C6(HOXC6)基因和SOX17的标志物。在其他实施方案中，包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物基本上不含内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞和/或神经细胞。在一些实施方案中，细胞培养物还包含以下物质的一种或几种类视黄醇化合物，如视黄酸(RA)，FGF-10或B27。
本发明其他实施方案涉及富集的、分离的或基本上纯的PDX1-阳性前肠内胚层细胞群，其中PDX1-阳性前肠内胚层细胞是多潜能细胞，可以分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官。在一些实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞衍生自多能性细胞，如人胚胎干细胞。本发明的其他实施方案涉及包含细胞的细胞群，其中至少约90％的细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞，其中PDX1-阳性前肠内胚层细胞是多潜能细胞，可以分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官。在优选实施方案中，细胞群中至少约95％的细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。更优选的实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞在细胞群中的比例为至少约98％。
本发明其它的实施方案涉及产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的方法，此方法通过为包含基本上不表达PDX1的定形内胚层细胞(PDX1-阴性定形内胚层细胞)的细胞培养物或细胞群提供前肠分化因子(例如类视黄醇)来进行。类视黄醇(例如视黄酸)可以约0.01至50μM的浓度添加。在一些实施方案中，通过为细胞培养物或细胞群提供FGF-10和/或B27增加PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性细胞的分化。FGF-10可以约5ng/ml至约1000ng/ml的浓度添加。在一些实施方案中，B27以约0.1％至约20％的浓度添加到细胞培养物或细胞群中。FGF-10和/或B27可以与类视黄醇大致同时加到细胞培养物或细胞群中，或者每种因子也可以间隔几小时分别添加。在一些实施方案中，类视黄醇添加至大约培养4天的PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物中。在一些实施方案中，类视黄醇添加至大约培养5天的PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物中。
其它实施方案还涉及利用前肠分化因子进一步促进细胞培养物或细胞群中PDX1-阳性前肠内胚层细胞产生的方法，所述细胞培养物或细胞群已经与类视黄醇(如视黄酸)接触。在这些实施方案中，为所述细胞培养物或细胞群提供活化素A和/或活化素B可促进PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化。活化素A和/或活化素B可以5ng/ml至1000ng/ml的浓度提供。其他实施方案涉及增加细胞培养物或细胞群中PDX1-阳性前肠内胚层细胞产生的方法，其通过在含有类视黄醇的培养基中分化PDX1阴性细胞来进行，其中所述培养基之前被某些细胞类型的维持或生长条件化。这些细胞类型包括但不限于胚胎干细胞或其他多能性细胞，这些细胞已在含血清或生长因子TGFβ超家族成员(如活化素A、活化素B、Nodal和/或骨形态发生蛋白BMP)的培养基中分化。在一些实施方案中，条件培养基以全部培养基的约1％至约100％添加到细胞培养物或细胞群中。TGFβ超家族生长因子和/或条件培养基可以和类视黄醇大致同时添加到细胞培养物或细胞群中，或者每种因子也可以几小时的间隔分别添加。
本发明的实施方案涉及产生富含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群的方法。在一些实施方案中，这些方法包括获得多能性细胞群的步骤，其中多能性细胞群中至少一个细胞包含至少一个受PDX1启动子控制的核酸拷贝。在一些实施方案中，所述核酸包含编码绿色荧光蛋白或其生物学活性片段的序列。在其它实施方案中，该方法另外的步骤包括使所述多能性细胞分化以便产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞，以及使PDX1-阳性细胞与PDX1阴性细胞分离，其中该PDX1-阳性前肠内胚层细胞是多潜能细胞，可以分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官。此处所述方法的一些实施方案中，分化步骤还包括为所述多能性细胞群提供至少一种TGFβ超家族的生长因子，其量足以促进所述多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层细胞的分化，以及为该PDX1-阴性定形内胚层细胞提供前肠分化因子，其量足以促进该PDX1-阴性定形内胚层细胞向前肠的PDX1-阳性内胚层细胞分化。
本发明的一些实施方案涉及促进表达SOX-17(SOX-17阳性)的定形内胚层细胞中PDX1基因产物表达的方法，其通过使这些细胞与足以促进PDX1基因产物表达的量的分化因子接触。在一些实施方案中，所述分化因子选自RA、FGF-10和B27。
本发明的其它实施方案涉及鉴定能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。在这些方法中，使PDX1-阴性定形内胚层细胞与候选分化因子接触，并确定与在与候选分化因子接触前细胞群中PDX1的表达相比，在与候选分化因子接触后细胞群中PDX1的表达是否增加。细胞群中PDX1表达的增加表明候选分化因子能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。在一些实施方案中，PDX1的表达由定量聚合酶链式反应(Q-PCR)确定。上述方法的一些实施方案还包括确定在与候选分化因子接触前后细胞群中HOXA13和/或HOXC6基因的表达。在一些实施方案中，候选分化因子是小分子，例如类视黄醇，如视黄酸。其它实施方案中，候选分化因子是多肽，例如生长因子，如FGF-10。
本发明的其它实施方案涉及鉴定能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子。在这些方法中，在使PDX1-阳性前肠内胚层细胞与候选分化因子接触，并确定与在与候选分化因子接触前细胞群中标志物的表达相比，在与候选分化因子接触后细胞群中标志物的表达是增加还是降低。标志物表达的增加或降低表明候选分化因子能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。在一些实施方案中，标志物表达通过Q-PCR检测。在一些实施方案中，候选分化因子是小分子，例如类视黄醇，如视黄酸。其它实施方案中，候选分化因子是多肽，例如生长因子，如FGF-10。
一些权限中，术语“包含”可能不具有任何通常所接受的定义。此处使用的术语“包含”是开放式的，可以包括任何其他元素。考虑到这一点，本发明的其他实施方案参考以下编号的段落进行描述1.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约2％的所述人细胞是胰-十二指肠同源框因子-1(PDX1)阳性前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞是能够分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官的多潜能细胞。
2.段落1的细胞培养物，其中至少约5％的所述人细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
3.段落1的细胞培养物，其中至少约10％的所述人细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
4.段落1的细胞培养物，其中至少约25％的所述人细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
5.段落1的细胞培养物，其中在所述培养物中存在人饲养细胞，其中除了所述人饲养细胞以外，至少约2％的人细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
6.段落1的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达同源框A13(HOXA13)基因。
7.段落1的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达同源框C6(HOXC6)基因。
8.段落1的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达SOX17。
9.段落1的细胞培养物，其中在所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
10.段落1的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本上不含选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞和神经细胞的细胞。
11.段落1的细胞培养物，其中所述细胞培养物中约每10个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约一个PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
12.段落1的细胞培养物，其中所述细胞培养物中约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约一个PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
13.段落1的细胞培养物，其中所述细胞培养物中约每4个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约一个PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
14.段落1的细胞培养物，还包含胚胎干细胞。
15.段落14的细胞培养物，其中所述胚胎干细胞衍生自选自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴的组织。
16.段落1的细胞培养物，还包含类视黄醇。
17.段落16的细胞培养物，其中所述类视黄醇是视黄酸(RA)。
18.段落1的细胞培养物，还包含FGF-10。
19.段落1的细胞培养物，还包含B27。
20.段落1的细胞培养物，还包含RA和FGF-10。
21.段落20的细胞培养物，还包含B27。
22.包含细胞的细胞群，其中至少约90％的所述细胞是人PDX1-阳性前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞是能够分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官的多潜能细胞。
23.段落22的细胞群，其中至少约95％的所述细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
24.段落22的细胞群，其中至少约98％的所述细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
25.段落22的细胞群，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达HOXA13基因。
26.段落22的细胞群，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达HOXC6基因。
27.段落22的细胞群，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达SOX17。
28.段落22的细胞群，其中在所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
29.产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的方法，所述方法包含以下步骤获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群；为所述细胞群提供足以促进至少部分所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的量的类视黄醇，其中所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞是能够分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官的多潜能细胞。
30.段落29的方法，还包括给予足够时间供PDX1-阳性前肠内胚层细胞形成的步骤，其中所述供PDX1-阳性前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中PDX1-阳性前肠内胚层细胞的存在来确定。
31.段落29的方法，其中至少约2％的所述PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
32.段落29的方法，其中至少约5％的所述PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
33.段落29的方法，其中至少约10％的所述PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
34.段落29的方法，其中至少约25％的所述PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
35.段落29的方法，其中在所述细胞群中检测PDX1-阳性前肠内胚层细胞的存在包括检测PDX1的表达。
36.段落35的方法，其中在所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
37.段落35的方法，其中所述PDX1的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)来测定。
38.段落35的方法，其中所述PDX1的表达通过免疫细胞化学来测定。
39.段落29的方法，其中所述类视黄醇是RA。
40.段落39的方法，其中RA以约0.01μM至约50μM的浓度范围提供。
41.段落39的方法，其中RA以约0.04μM至约20μM的浓度范围提供。
42.段落39的方法，其中RA以约0.1μM至约10μM的浓度范围提供。
43.段落39的方法，其中RA以约0.2μM至约2.5μM的浓度范围提供。
44.段落39的方法，其中RA以是约0.5μM至约1.5μM的浓度范围提供。
45.段落39的方法，其中RA以约1μM的浓度提供。
46.段落39的方法，其中RA在所述培养进行约4天时提供。
47.段落29的方法，还包括向所述培养物中提供足以增强PDX1-阳性前肠内胚层细胞的产生的量的因子，所述因子选自FGF-10、FGF-4、活化素A、活化素B、B27、条件培养基和所述因子的组合。
48.段落47的方法，其中所述因子选自FGF-10、FGF-4、活化素A和活化素B。
49.段落48的方法，其中所述因子以约10ng/ml至约500ng/ml的浓度范围提供。
50.段落48的方法，其中所述因子以约20ng/ml至约200ng/ml的浓度范围提供。
51.段落48的方法，其中所述因子以约25ng/ml至约75ng/ml的浓度范围提供。
52.段落48的方法，其中所述因子约50ng/ml的浓度提供。
53.段落48的方法，其中所述因子与所述类视黄醇大致同时提供。
54.段落47的方法，其中所述因子是B27。
55.段落54的方法，其中B27以全部培养基的约0.1％至约20％的浓度范围提供。
56.段落54的方法，其中B27以全部培养基的约0.2％至约5％的浓度范围提供。
57.段落54的方法，其中B27以全部培养基的约0.5％至约2％的浓度范围提供。
58.段落54的方法，其中B27以全部培养基的约1％的浓度提供。
59.段落54的方法，其中B27与所述类视黄醇大致同时提供。
60.段落47的方法，其中所述因子是条件培养基。
61.段落60的方法，其中条件培养基以全部培养基的约10％至约100％的浓度范围提供。
62.段落60的方法，其中条件培养基以全部培养基的约20％至约80％的浓度范围提供。
63.段落60的方法，其中条件培养基以全部培养基的约40％至约60％的浓度范围提供。
64.段落60的方法，其中条件培养基以全部培养基的约50％的浓度提供。
65.段落60的方法，其中条件培养基与所述类视黄醇大致同时提供。
66.段落60的方法，其中条件培养基通过使分化的人胚胎干细胞(hESC)与细胞培养基接触约24小时来制备。
67.段落66的方法，其中所述hESC在选自补加3％血清的RPMI、补加活化素A的低血清RPMI和补加BMP4的低血清RPMI的培养基中分化约5天。
68.段落29的方法产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
69.产生富集PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤获得多能性细胞群，其中所述多能性细胞群中至少一个细胞包含至少一个拷贝的受PDX1启动子控制的核酸，所述核酸包含编码绿色荧光蛋白(GFP)或其生物学活性片段的序列；分化所述多能性细胞以便产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞是能够分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官的多潜能细胞；以及使所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞与PDX1-阴性细胞分离。
70.段落69的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约95％的PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
71.段落69的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约98％的PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
72.段落69的方法，其中所述分化步骤还包括为所述多能性细胞群中提供足以促进所述多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层细胞分化的量的至少一种TGFβ超家族的生长因子，以及为所述PDX1-阴性定形内胚层细胞提供足以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的量的类视黄醇。
73.段落72的方法，其中所述类视黄醇是RA。
74.段落69的方法产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞的富集群。
75.在表达SOX17的定形内胚层细胞中增加PDX1基因产物的表达的方法，所述方法包括使所述定形内胚层细胞与足以增加所述PDX1基因产物表达的量的分化因子接触。
76.段落75的方法，其中所述分化因子是类视黄醇。
77.段落76的方法，其中所述分化因子是RA。
78.段落75的方法，其中所述分化因子选自FGF-10、FGF-4、活化素A、活化素B、B27、条件培养基和所述因子的组合。
79.鉴定能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的群；使所述包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的群与候选分化因子接触；以及与在与所述候选分化因子接触之前所述细胞群中PDX1的表达比较，确定在与所述候选分化因子接触之后所述细胞群中PDX1的表达是否增加，其中在所述细胞群中所述PDX1表达的增加表明所述候选分化因子能够促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化，所述PDX1-阳性前肠内胚层细胞是能够分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官的多潜能细胞。
80.段落79的方法，其中所述PDX1表达通过Q-PCR检测。
81.段落79的方法，还包括在与所述候选分化因子接触前后测定所述细胞群中HOXA13基因的表达的步骤。
82.段落79的方法还包含在添加所述候选分化因子前后检测所述细胞群中HOXC6基因的表达的方法。
83.段落79的方法，其中所述候选分化因子是小分子。
84.段落83的方法，其中所述小分子是类视黄醇。
85.段落84的方法，其中所述类视黄醇是RA。
86.段落79的方法，其中所述候选分化因子是多肽。
87.段落79的方法，其中所述候选分化因子是生长因子。
88.段落79的方法，其中所述候选分化因子是FGF-10。
89.鉴定能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤获得包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的群；使所述包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的群与候选分化因子接触；以及与在与所述候选分化因子接触之前所述细胞群中标志物的表达比较，确定在于所述候选分化因子接触之后所述细胞群中相同标志物的表达是增加还是降低，其中在所述细胞群中所述标志物表达的增加或降低表明所述候选分化因子能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。
90.段落81的方法，其中所述标志物表达通过Q-PCR测定。
91.段落81的方法，其中所述候选分化因子是小分子。
92.段落81的方法，其中所述候选分化因子是多肽。
93.段落81的方法，其中所述候选分化因子是生长因子。
94.包含可操作地连接到PDX1控制区的报告基因的载体。
95.段落94的载体，其中所述报告基因是EGFP。
96.段落94的载体的细胞。
97.包含可操作地连接到PDX1控制区的报告基因的细胞。
98.段落97的细胞，其中所述可操作地连接到所述PDX1控制区的报告基因整合入染色体。
99.段落97的细胞，其中所述报告基因是EGFP。
100.段落97的细胞，其中所述细胞是多能的。
101.段落100的细胞，其中所述细胞是hESC。
102.段落97的细胞，其中所述细胞是定形内胚层细胞。
103.段落97的细胞，其中所述细胞是PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
104.通过以下步骤制备的条件培养基使新鲜细胞培养基与分化的hESC群接触约24小时，其中所述hESC已经在选自补加3％血清的RPMI、补加活化素A的低血清RPMI和补加BMP4的低血清RPMI的细胞培养基中分化约5天；以及从所述培养基中去除所述分化的hESC群。
105.段落104的条件培养基，其中所述新鲜细胞培养基是RPMI。
106.段落105的条件培养基，其中所述RPMI是低血清RPMI。
107.条件化培养基的方法，所述方法包括以下步骤使新鲜细胞培养基与分化的hESC群接触约24小时，其中所述hESC已经在选自补加3％血清的RPMI、补加活化素A的低血清RPMI和补加BMP4的低血清RPMI的细胞培养基中分化约5天；以及从所述培养基中去除所述分化的hESC群。
108.段落107的方法，其中所述新鲜细胞培养基是RPMI。
109.段落108的条件培养基，其中所述RPMI是低血清RPMI。
应了解上述的方法和组合物与体外培养的细胞有关。但是，上述体外分化的细胞组合物可用于体内用途。
本发明的其他实施方案可参见以下专利申请2003年12月23日提交的第60/532,004号美国临时专利申请，标题为“定形内胚层”；2004年4月27日提交的第60/566,293号美国临时专利申请，标题为“表达PDX1的内胚层”；2004年7月9日提交的第60/586,566号美国临时专利申请，标题为“用于分离定形内胚层的趋化因子细胞表面受体”；2004年12月23日提交的第11/021,618号美国专利申请，标题为“定形内胚层”。


图1是从hESC产生β-细胞的假想的分化途径示意图。途径的第一步负责ES细胞至定形内胚层系，也代表向胰内胚层、内分泌内胚层或胰岛/β-细胞的进一步分化事件前的第一步。途径的第二步显示SOX17-阳性/PDX1-阴性的定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的转化。在介导这些转化中起作用的因子用斜体字表示。定义靶细胞的相关标志物用下划线表示。
图2是人SOX17 cDNA的示意图，显示了保守区的位置并突出显示了用于通过GENOVAC的免疫步骤的区域。
图3是关系树状图，显示SOX17与SOX7关系最近，与SOX18关系稍远。在同源物种中SOX17蛋白质比相同物种中的SOX群F亚族的其它成员的相关性强得多图4是用兔抗SOX17抗体作探针的Western印迹，该印迹证明这个抗体对成纤维细胞(1道)中过表达的SOX17有特异性，而缺乏与EGFP(2道)或最接近的SOX家族成员SOX7(3道)的免疫反应性。
图5A-B是显示大量AFP+共标记细胞的SOX17+细胞簇的显微照片。这与其他SOX17+簇(B)形成显著对比，因为在其他SOX17+簇中只能观察到很少或者就根本没有AFP+细胞。
图6A-C是显示体壁内胚层和SOX17的显微照片。图A显示随机分化的hES细胞培养物中体壁内胚层细胞表面的人血栓调节蛋白(TM)的免疫细胞化学检测。图B显示与图A相同的区域，对TM和SOX17双标记。图C是用DAPI标记核的相同区域的相差图。注意DAPI标记的核和SOX17标记的完全对应。
图7A-B是显示定量PCR(Q-PCR)检测的SOX17基因表达和SOX17-特异性抗体检测的抗SOX17阳性细胞的条形图。图A显示相对于未分化的对照培养基(SR20)活化素A增加SOX17基因表达，而视黄酸(RA)强烈抑制SOX17表达。图B显示在SOX17+细胞数量上反映了相似的模式以及这些变化的相似倍数，表明Q-PCR检测SOX17基因表达可以在单个细胞水平反映出变化。
图8A是条形图，显示活化素A存在下正在分化的hESC培养物保持低水平的AFP基因表达，而在10％小牛血清(FBS)中随机分化的细胞显示AFP的强烈上调。表达水平的差异大约是7倍。
图8B-C是两张显微图片，显示活化素A对AFP表达的抑制在单个细胞水平也很显著，因为相对于单用10％FBS(顶部)，在活化素A处理的条件(底部)下只能观察到非常少和小的AFP+细胞簇。
图9A-B是显示使用流式细胞仪定量的AFP+细胞数的对比图片。这个图证明在活化素A存在(左图)或缺失(右图)的条件下，AFP基因表达(图8A)的改变倍数完全对应于AFP+细胞的数量，进一步支持了使用Q-PCR分析来指示单个细胞水平上发生的变化。
图10A-F是显示使hESC暴露于nodal、活化素A和活化素B(NAA)5天后SOX17+细胞数目显著增加(A-C)的显微图片。通过比较每个区域SOX17+细胞占全部细胞数目(如DAPI染色的核(D-F)所示)的相对丰度，可以看出在用NAA处理5天后约30-50％的细胞对SOX17显示免疫反应性。
图11是证明活化素A(0，10，30或100ng/ml)剂量依赖的增加正在分化的hESC中SOX17基因表达的条形图。在粘附培养时处理3天后增加的表达已经很高，并一直持续到随后悬浮培养的1、3和5天。
图12A-C是证明活化素A对MIXL1(图A)、GATA4(图B)和HNF3b(图C)的表达的影响的条形图。也观察到活化素A剂量依赖的增加定形内胚层3种其他标志物MIXL1、GATA4和HNF3b。与活化素剂量对应的表达增加的倍数与对SOX17所观察到的非常相似，表明活化素A特异化共表达所有4种基因(SOX17+、MIXL1+、GATA4+和HNF3b+)的细胞群。
图13A-C是证明活化素A对AFP(图A)、SOX7(图B)和SPARC(图C)的表达的影响的条形图。内脏内胚层标志物AFP的表达对活化素A显示剂量依赖性的降低。原始内胚层标志物(SOX7)和体壁内胚层标志物(SPARC)保持不变或在一些时间点显示抑制，表明活化素A不起特异化这些胚外内胚层细胞类型的作用。这进一步支持了以下事实SOX17、MIXL1、GATA4和HNF3b表达的增加归因于对应活化素A的定形内胚层细胞数目的增加。
图14A-B是显示活化素A对ZIC1(图A)和Brachyury(图B)的表达的影响的条形图。神经标志物ZIC1稳定的表达证明活化素A对神经分化没有剂量依赖效应。Brachyury的表达降低显示100ng/ml活化素A处理显著抑制了中胚层分化。这可能是从中内胚层前体向定形内胚层特异化增加的结果。相对于未处理的对照培养物，低水平的活化素A(10和30ng/ml)处理在分化的较后期保持brachyury的表达。
图15A-B是显示响应活化素处理的体壁内胚层分化降低的显微图片。在只有血清的条件下分化时，体壁内胚层Tmhi区域存在于所有培养物中(A)，而包含活化素A时，向TM+细胞的分化非常少，TM免疫反应性的总强度较低。
图16A-D是显示响应活化素A和活化素B处理的标志物表达的显微图片。hESC用活化素A和活化素B连续处理4天，用SOX17、AFP和TM抗体三重标记。图A-SOX17；图B-AFP；图C-TM；图DPhase/DAPI。注意到许多SOX17阳性细胞伴随着AFP(B)和TM(C)免疫反应性的完全缺失。
图17是显示在体外从hESC出现定形内胚层和内脏内胚层的显微图片。通过AFPhi/SOX17lo/-鉴定内脏内胚层区域，而定形内胚层显示完全相反的模式SOX17hi/AFPlo/-。因为这两个区域互相靠近，所以选择了这个区域。但是，在从AFPhi细胞的任意区域的完全分离物中经常会观察到SOX17hi/AFPlo/-区域，表明来自内脏内胚层的定形内胚层的单独起源。
图18是描述TGFβ家族的配体和受体的图表。激活AR Smads和BR Smads的因子可以在从人胚胎干细胞产生定形内胚层的过程中起作用(参见J Cell Physiol.187265-76)。
图19是显示作为经单一或组合的TGFβ因子处理结果的SOX17表达的诱导随时间变化的条形图。
图20是显示作为经组合的TGFβ因子处理结果的SOX17+细胞数目随时间变化的条形图。
图21是显示作为经组合的TGFβ因子处理结果的SOX17表达的诱导随时间变化的条形图。
图22是显示活化素A剂量依赖性地诱导SOX17+细胞数目增加的条形图。
图23是条形图，显示向活化素A和活化素B处理的培养物中添加Wnt3a促使SOX17的表达水平高于只用活化素A和活化素B诱导的表达水平。
图24A-C是显示低FBS条件增强向定形内胚层分化的条形图。在含2％FBS的培养基中用活化素A和活化素B处理(2AA)hESC，可导致SOX17的表达水平比在含10％FBS的培养基中经相同处理(10AA)的SOX17的表达水平高2至3倍(图A)。定形内胚层标志物MIXL1(图B)的诱导也以相同方式受影响，在2％FBS中对AFP(内脏内胚层)的抑制比在10％FBS条件下更强(图C)。
图25A-D是显示培养物中SOX17+细胞分裂的显微图片。SOX17免疫反应性细胞存在于hESC克隆的分化边缘(C、D)，被增殖细胞核抗原(PCNA)标记(图B)，但不被OCT4共标记(图C)。此外，在SOX17+细胞(箭头)以及OCT4+细胞，未分化的hESCs(箭头头部)中用DAPI标记核均可看到清晰的有丝分裂图(D)。
图26是显示在不同培养基条件下正在分化的hESC中CXCR4的相对表达水平的条形图。
图27A-D是显示一组定形内胚层标志物在如同图26显示的相同分化处理下如何与CXCR4共享非常相似的表达模式的条形图。
图28A-E是条形图，显示中胚层标志物(BRACHYURY，MOX1)、外胚层标志物(SOX1，ZIC1)和内脏内胚层标志物(SOX7)在如同图26显示的相同处理下如何表现出与CXCR4表达相反的关系。
图29A-F是显示在图26-28中展示的三种培养基条件下SOX17免疫反应性细胞的相对差异的显微图片。
图30A-C是流式细胞点图，证明CXCR4+细胞数目随添加至分化培养基的活化素A的浓度的增加而增加。
图31A-D是条形图，显示从高剂量活化素A处理(A100-CX+)分离的CXCR4+细胞比亲代群(A100)进一步富集定形内胚层标志物。
图32是条形图，显示使用荧光激活细胞分选术(FACS)分离的CXCR4+和CXCR4-细胞的基因表达以及亲代群中的基因表达。这证明CXCR4+细胞基本包含了每个亲代细胞群中所有的CXCR4基因表达，CXCR4-细胞群包含很少或没有CXCR4基因表达。
图33A-D是条形图，证明从高剂量活化素A处理分离的CXCR4+细胞中中胚层(BRACHYURY，MOX1)、外胚层(SOX1，ZIC1)和内脏内胚层(SOX7)基因表达的缺失，这些非定形内胚层标志物的表达已经受到抑制。
图34A-M是显示可用于鉴定定形内胚层细胞的标志物基因的表达模式的条形图。图G-L分别显示了定形内胚层标志物FGF 17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的表达分析。图A-F分别显示了前面描述的细胞系标记基因SOX17、SOX7、SOX17/SOX7、TM、ZIC1和MOX1)的表达分析。图M显示了CXCR4的表达分析。对于图A-M的每一图，标注hESC的列表示来自纯化的人胚胎干细胞的基因表达；2NF表示细胞经过2％FBS处理，不添加活化素；0.1A100表示细胞经0.1％FBS和100ng/ml活化素A处理；1A100表示细胞经过1％FBS和100ng/ml活化素A处理；2A100表示细胞经过2％FBS和100ng/ml活化素A处理。
图35是显示在含有或不含活化素的条件下培养4天和6天的hESC培养物中PDX1基因相对表达的图表，其中在第4天添加视黄酸(RA)和成纤维生长因子(FGF-10)。
图36A-F是显示在含有或不含活化素的条件下培养4天和6天的hESCs培养物中标志物基因相对表达的图表，其中在第4天添加视黄酸(RA)和成纤维生长因子(FGF-10)。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)SOX17；(B)SOX7；(C)AFP；(D)SOX1；(E)ZIC1；和(F)NFM。
图37A-C是显示在含有或不含活化素的条件下培养4天和8天的hESC培养物中标志物基因相对表达的图表，其中在第4天添加视黄酸(RA)、成纤维生长因子(FGF-10)和成纤维生长因子(FGF-4)的组合。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)PDX1；(B)SOX7和(C)NFM。
图38A-G是显示在与50ng/ml FGF-10接触的定形内胚层细胞培养物中标志物基因的相对表达的图表，其中在第4天添加1μM、0.2μM或0.04μM视黄酸(RA)与50ng/ml FGF-10联合使用。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)PDX1；(B)HOXA3；(C)HOXC6；(D)HOXA13；(E)CDX1；(F)SOX1和(G)NFM。
图39A-E显示在含有或不含活化素，存在视黄酸(RA)、成纤维细胞生长因子(FGF-10)和下列之中的一种血清替代物(SR)，小牛血清(FBS)或B27构成的组合的条件下培养4天和8天的hESC培养物中标志物基因的相对表达。各栏显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)PDX1；(B)SOX7；(C)AFP；(D)ZIC1和(E)NFM。
图40A-B是显示6天(刚好在添加RA之前)后和9天(暴露于RA 3天后)时hESC培养物中胰(PDX1、HNF6)和肝(HNF6)的标志物基因的相对表达的图表。包括了不同的条件的比较，在25ng/ml(A25)或50ng/ml(A50)的条件下添加了10ng/ml(a10)、25ng/ml(a25)或50ng/ml(a50)的活化素B。不含任何活化素A和活化素B(NF)的条件作为产生定形内胚层和PDX1-阳性内胚层的阴性对照。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)PDX1和(B)HNF6。
图41A-C显示在含有100ng/ml(A100)、50ng/ml(A50)或不含(NF)活化素A的条件下培养5天(刚好在添加视黄酸之前)时和添加RA后2、4和6天(分别是第7、9和11天)的hESCs培养物中标志物基因的相对表达。每个柱图下直接标记的百分比表明分化3至5天期间的FBS剂量。从第7天开始，用RA处理(R)的细胞在包含0.5％FBS的RPMI培养基中生长。RA的浓度在第7天是2μM，第9天是1μM，第11天是0.2μM。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)PDX1；(B)ZIC1和(C)SOX7。
图42A-B显示首先在低FBS中用活化素A处理诱导定形内胚层(第5天)，然后用包含25ng/ml活化素A和RA或各种条件培养基(MEFCM、CM#2、CM#3和CM#4)和RA的新鲜(A25R)培养基诱导PDX1-表达内胚层。在第5、6、7、8和9天检测标志物表达。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平(A)PDX1和(B)CDX1。
图43显示了首先在低FBS中用活化素A处理诱导定形内胚层，然后用新鲜培养基处理，该新鲜培养基在以新鲜培养基稀释的条件培养基中包含活化素A和视黄酸(A25R)或者不同量的RA。培养基的总体积均是5ml。
图44是Western印迹，显示PDX1在添加RA和50ng/ml活化素A后3天(d8)和4天(d9)时RA-处理的定形内胚层细胞的免疫沉淀。
图45是一个概要图表，显示遗传标记了在PDX1启动子控制下的EGFP报告基因的PDX1-阳性前肠内胚层细胞荧光激活细胞分选术(FACS)的结果。
图46为显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)和EGFP-阳性细胞(GFP+)的群在相对于管家基因校正后的相对PDX1表达水平的图表。
图47为显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)、一半带有最低EGFP信号强度(Lo)的EGFP-阳性细胞群和一半带有最高EGFP信号强度(Hi)的EGFP-阳性细胞群的群相对于管家基因校正后的相对PDX1表达水平。
图48A-E显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)和EGFP-阳性细胞(GFP+)的群相对于管家基因校正后5种胰内胚层标志物的相对表达水平。各图A-NKX2.2；B-GLUT2；C-HNF3β；D-KRT19和E-HNF4α。
图49是显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)和EGFP-阳性细胞(GFP+)的群在相对管家基因校正后两种非胰内胚层标志物的相对表达水平。各图A-ZIC1和B-GFAP。
详细描述称为原肠胚形成的早期人发育中的重要阶段发生于受精后2～3周。原肠胚形成非常重要，因为在这个阶段三种主要胚层第一次特异化和组织化(Lu et al.，2001；Schoenwolf和Smith，2000)。外胚层负责身体外表和整个神经系统的最终形成，而中胚层衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他结缔组织。确定的内胚层被定义为负责整个肠管(包括食道、胃、小肠和大肠)以及肠管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲状旁腺、甲状腺、胆囊和胰腺)形成的胚层(Grapin-Botton和Melton，2000；Kimelman和Griffin，2000；Tremblay et al.，2000；Wells和Melton，1999；Wells和Melton，2000))。定形内胚层与称为原始内胚层的完全分离细胞系有重要区别。原始内胚层主要负责胚外组织的形成，主要是胎盘卵黄囊的腔壁和内脏内胚层部分和Reichert’s膜的胞外基质物质。
在原肠胚形成期，定形内胚层形成过程起始于细胞迁移，其中中内胚层细胞(有形成中胚层或内胚层能力的细胞)迁移穿过称为原条的结构。定形内胚层衍生自一些迁移穿过原条前部及节(在原条最前部区域的特化结构)的细胞。当迁移发生时，定形内胚层首先集中于最前部肠管，随后以肠管后端的形成而终止。
发育过程中PDX1基因表达PDX1(也称为STF-1、IDX-1和IPF-1)是胰和喙十二指肠(rostralduodenum)发育必需的转录因子。PDX1首先在胰内胚层表达，胰内胚层来自后部前肠内胚层，产生外分泌和内分泌细胞，在小鼠中开始于E8.5。其后，PDX1限定于β-细胞和一些δ-细胞。这种表达模式在成年后也保持。发育早期PDX1也在邻近形成中的胰的十二指肠内胚层表达，然后在十二指肠的肠细胞和肠内分泌细胞、胃窦及胆总管、胆囊和胆管中表达。在胰表达受限时，这个表达区域主要限于喙十二指肠。
PDX1阳性细胞和与其相关的步骤本发明的实施方案涉及产生PDX1-阳性内胚层细胞的新的确定明方法，其中PDX1-阳性内胚层细胞是多潜能细胞，能够分化为衍生自肠管的前肠/中肠区域(PDX1-阳性前肠/中肠内胚层)的细胞、组织或器官。此处使用的“多潜能”或“多潜能细胞”涉及这样的细胞类型，其可产生有限数量的其他细胞类型。此处使用的“前肠/中肠”指肠管前部及中部细胞，包括前肠/中肠连接部的细胞。
本发明一些优选的实施方案涉及产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的方法。在一些实施方案中，这些PDX1阳性内胚层细胞是多潜能细胞，能够分化为衍生自肠管前部(PDX1-阳性前肠内胚层)的细胞、组织或器官。
其他优选的实施方案涉及产生肠管后部的PDX1-阳性内胚层细胞的方法。在一些实施方案中，这些PDX1阳性内胚层细胞是多潜能细胞，能够分化为衍生自肠管的前肠区域的后部的细胞、组织或器官。
PDX1-阳性前肠内胚层细胞，例如那些根据此处描述的方法产生的细胞，可用于产生完全分化的产生胰岛素的β细胞。本发明的一些实施方案中，通过分化基本上不表达PDX1的定形内胚层细胞(PDX1-阴性定形内胚层细胞；此处也指定形内胚层)产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞。可使用此处描述的方法或其他任何已知方法分化多能性细胞(如胚胎干细胞)来制备PDX1-阴性定形内胚层细胞。2004年12月23日提交的标题为“定形内胚层”的第11/021,618号美国专利申请描述了一种从多能性细胞方便高效产生PDX1-阴性定形内胚层的方法。
产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的方法为从多能性细胞高效产生胰腺组织(如腺泡细胞、导管细胞和胰岛细胞)提供了基础。在某些优选实施方案中，人PDX1-阳性前肠内胚层细胞衍生自人PDX1-阴性定形内胚层细胞，而这些细胞又衍生自hESC。然后这些人PDX1-阳性前肠内胚层细胞被用于产生功能性的产生胰岛素的β-细胞。为得到有效量的产生的胰岛素β细胞，希望在分化为胰岛/β-细胞终点前每个分化步骤都有高分化效率。因为PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化代表产生功能性胰岛/β-细胞的一个早期步骤(如图1所示)，尤其希望在这一步具有高分化效率。
考虑到需要PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的有效分化，本发明的一些方面涉及体外方法学，它会导致约2％～25％的PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞转化。典型地，该方法包括以确定的和短暂特定的方式使用培养基和生长因子条件。通过使用与PDX1-阳性前肠内胚层细胞特异结合的试剂从细胞群中的其他细胞中分离和/或纯化PDX1-阳性前肠内胚层细胞，可进一步在细胞群中富集PDX1-阳性前肠内胚层细胞。或者，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可用诸如绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因标记，以使得能够检测PDX1表达。这种荧光标记的细胞可用荧光激活细胞分选术(FACS)纯化。本发明更深入的方面涉及细胞培养物和包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的富集的细胞群，以及鉴定在向PDX1-阳性前肠内胚层和从PDX1-阳性前肠内胚层分化中有用的因子。
为测定细胞培养物或细胞群中PDX1-阳性前肠内胚层细胞的数量，需要一种在培养物或细胞群中从其他细胞区分这种细胞类型的方法。相应地，本发明的某些实施方案涉及细胞标志物及检测和确定这些标志物表达的方法，这些标志物的存在、缺失和/或相对表达水平是PDX1-阳性前肠内胚层细胞的指示。此处使用的“表达”指材料或物质的产生以及材料或物质产生的水平或数量。因此，检测特定标志物的表达指测定表达标志物的相对或绝对量，或仅仅检测标志物的存在或缺失。此处使用的“标志物”指任何可被观察或检测的分子。例如，标志物包括但不局限于、核苷酸(如特定基因的转录产物)、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、糖类、糖脂、脂、脂蛋白或小分子(如分子量小于10,000amu的分子)。
本发明的一些实施方案中，用定量PCR(Q-PCR)测定标志物的存在、缺失和/或表达水平。例如，某些遗传标志物，如PDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α-胎蛋白(AFP)、同源框A13(HOXA13)、同源框C6(HOXC6)和/或此处描述的其他标志物产生的转录产物的量用Q-PCR确定。其他实施方案中，用免疫组化方法检测上述基因表达的蛋白。在其他实施方案中，使用Q-PCR和免疫组化两种方法鉴定和检测这些标志物的量和相对比例。
使用此处描述的分化和检测方法就可能在细胞培养物或细胞群中鉴定PDX1-阳性前肠内胚层细胞以及确定这些细胞的比例。例如，本发明一些实施方案中，产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞或细胞群表达PDX1基因的水平比PDX1-阴性细胞或细胞群高至少约2个数量级。其他实施方案中，产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞和细胞群表达PDX1基因的水平比PDX1-阴性细胞或细胞群高2个以上数量级。在其他实施方案中，产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞或细胞群表达一种或多种选自PDX1、SOX17、HOXA13或HOXC6的标志物的水平比PDX1-阴性定形内胚层细胞高约2个或2个以上数量级。
此处描述的组合物和方法有几个有用的特性。例如，包含PDX1-阳性内胚层的细胞培养物和细胞群以及产生该细胞培养物和细胞群的方法有利于模拟人发育的早期阶段。此外，此处描述的组合物与方法也可用于疾病状态(如糖尿病)的治疗性干预。例如，因为PDX1-阳性前肠内胚层用作有限数量组织的来源，它可被用于纯组织或细胞类型的开发。
从多能性细胞产生PDX1-阴性定形内胚层(定形内胚层)从多能性细胞产生包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群，首先要产生PDX1-阴性定形内胚层(也称为“定形内胚层”)。下面简单描述了分化多能性细胞以产生包含定形内胚层的细胞培养物和富集的细胞群的方法，详细步骤见2004年12月23日提交的标题为“定形内胚层”的第11/021,618号美国专利申请。在一些方法中，作为起始材料的多能性细胞是干细胞。某些方法中，定形内胚层细胞培养物和包含定形内胚层细胞的富集的细胞群产自胚胎干细胞。此处使用的“胚胎的”指有机体的一系列发育阶段，开始于单一受精卵，结束于多细胞结构，这种多细胞结构除了发育的配子生殖细胞外不再包含多能或全能细胞。除了来自配子融合的胚胎，术语“胚胎的”也指来自体细胞核转移的胚胎。优选的获得定形内胚层细胞的方法利用人胚胎干细胞作为起始材料产生定形内胚层。该多能性细胞可以是源自桑椹胚、胚胎内细胞团或胚胎生殖嵴的细胞。可使用本领域公知的方法在培养基中维持人胚胎干细胞基本未分化的多能状态。在如第5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806和6,251,671号美国专利中描述了这些方法。
在产生定形内胚层细胞的一些方法中，hESC维持在饲养层上。该方法中，可使用任何能使得hESC维持在多能状态的饲养层。一种常用的培养人胚胎干细胞的饲养层是小鼠成纤维细胞层。最近，人成纤维细胞饲养层已用于培养hESC(参见第2002/0072117号美国专利申请)。产生定形内胚层的被选方法允许不用饲养层就可维持多能hESC。在第2003/0175956号美国专利申请中描述了无饲养层条件下维持多能hESC的方法。
此处使用的人胚胎干细胞可在含或不含血清的培养基中维持。在一些胚胎干细胞维持步骤中，使用血清替代物。在其他步骤中，使用例如第2003/0190748号美国专利申请描述的无血清培养技术。
干细胞在培养基中通过常规传代保持多能状态，直到需要分化为定形内胚层。一些方法中，通过向干细胞培养物中添加有效量的促进向定形内胚层分化的TGFβ超家族的生长因子以获得向定形内胚层的分化。对产生定形内胚层有用的TGFβ超家族的生长因子选自Nodal/活化素(activin)或BMP亚组。在一些优选的分化方法中，生长因子选自Nodal、活化素A、活化素B和BMP4。此外，生长因子Wnt3a和其他Wnt家族成员有利于定形内胚层细胞的产生。某些分化步骤中，可使用任意上述生长因子的组合。
对于多能干细胞向定形内胚层细胞分化的一些方法，添加上述生长因子到细胞中使培养基中生长因子的浓度足以促使至少一部分干细胞向定形内胚层细胞分化。一些方法中，细胞培养基中上述生长因子的浓度是至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、至少约2000ng/ml、至少约3000ng/ml、至少约4000ng/ml、至少约5000ng/ml或多于约5000ng/ml。
在多能干细胞向定形内胚层细胞分化的某些方法中，先添加上述生长因子，然后再从细胞培养物中去除。例如，生长因子可在添加约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天后去除。在一个优选的方法中，生长因子在添加约4天后去除。
定形内胚层的培养物可在含减少的血清或无血清的培养基中生长。在某些培养条件下，血清浓度范围从约0.05％v/v至约20％v/v。例如，在一些分化步骤中，培养基中血清浓度可低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。一些方法中，定形内胚层在无血清或在血清替代物的条件下生长。其他方法中，定形内胚层细胞在含B27的条件下生长。该方法中，B27添加物的浓度范围从约0.1％v/v至约20％v/v。
监控多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层(定形内胚层)的分化通过测定定形内胚层特异标志物的表达可监控hESC培养物向定形内胚层的分化进程。在一些方法中，通过检测标志物的存在或缺失确定某种标志物的表达。或者，某些标志物的表达通过测定细胞培养物或细胞群中细胞的标志物的水平来确定。在该方法中，标志物表达的检测可以是定性的，也可以是定量的。使用定量PCR(Q-PCR)是对标志物基因产生的标志物的表达进行定量的一种方法。进行Q-PCR的方法在本领域是公知的。也可用本领域公知的其他方法对标志物基因的表达进行定量。例如，使用针对感兴趣的标志物基因产物特异的抗体，检测标志物基因产物的表达。某些方法中，确定定形内胚层特异标志物基因的表达及缺乏hECS和其他细胞类型特异标志物基因的显著表达。
如以下实施例进一步描述的，定形内胚层可靠的标志物是SOX17基因。因此，用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因，从而产生SOX17基因产物。定形内胚层其他的标志物是MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因为定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因的水平高于表达SOX7标志物基因的水平，而这是原始和内脏内胚层的特征(见表1)，所以在一些步骤中，SOX17和SOX7的表达均被监控。其他步骤中，监控了hESC特异的SOX17和OCT4标志物基因的表达。此外，因为定形内胚层细胞中SOX17标志物基因的表达水平比AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标志物基因的表达水平高，所以这些基因的表达也被监控。
定形内胚层另一个标志物是CXCR4基因。CXCR4基因编码细胞表面趋化因子受体，这个受体的配体是化学引诱物SDF-1。在成体中含CXCR4受体的细胞的主要作用被认为是造血细胞向骨髓的迁移、淋巴细胞运输以及各种B细胞和巨噬血细胞系的分化[Kim，C.和Broxmeyer，H.J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]。CXCR4受体还作为HIV-1进入T细胞的共受体[Feng，Y.，et al.Science，272，872-877(1996)]。在[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]进行的一系列广泛的研究中，描绘了在小鼠的早期发育和成年时期趋化因子受体CXCR4和它唯一的配体SDF-1[Kim，C.和Broxmeyer，H.，J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]的表达。在发育中CXCR4/SDF1的相互作用非常明显，因为已证实，在转基因小鼠中破坏CXCR4和SDF1中任一基因[Nagasawa et al.Nature，382，635-638(1996)；Ma，Q.，et al Immunity，10，463-471(1999)]，均会导致小鼠在胚胎晚期死亡。McGrath等人利用RNase保护和原位杂交结合的方法证明在原肠形成胚胎早期(E7.5)CXCR4使检测到的最丰富的趋化因子受体信使RNA。在原肠形成胚胎期，CXCR4/SDF-1信号可能主要参与诱导原条胚层细胞的迁移，并在此时的定形内胚层、中胚层和胚外中胚层表达。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4和α-胎蛋白是互斥的，表明内脏内胚层中表达的缺失[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]。
因为通过分化多能性细胞产生的定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因，所以可通过监控CXCR4的表达以追踪定形内胚层细胞的产生。此外，用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞还表达定形内胚层的其他标志物，这些标志物包括但不限于SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因为定形内胚层表达CXCR4标志物基因的水平高于表达SOX7基因的水平，所以可监控CXCR4和SOX7两种基因的表达。其他方法中，CXCR4标志物基因和OCT4标志物基因的表达均被监控。此外，因为定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因的水平高于表达AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标志物基因的水平，也可以监控这些基因的表达。
应了解内胚层细胞中CXCR4的表达不妨碍SOX17的表达。用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞将大量表达SOX17和CXCR4，但不大量表达AFP、TM、SPARC或PDX1。
定形内胚层的富集、分离和/或纯化用任意上述方法产生的定形内胚层细胞，可通过利用对这些细胞特异的亲和标签进行富集、分离和/或纯化。对定形内胚层细胞特异的亲和标签的例子是抗体、配体或其他对标志物分子特异的结合试剂，例如多肽，其中所述标志物分子存在于定形内胚层细胞表面上，而基本上不存在于在用此处描述的方法产生的细胞培养物中可以找到的其他细胞类型上。一些方法中，使用与CXCR4结合的抗体作为亲和标签，以富集、分离或纯化定形内胚层细胞。在其他方法中，使用趋化因子SDF-1或基于SDF-1的其他分子作为亲和标签。这些分子包括但不限于SDF-1片段、SDF-1融合物或SDF-1模拟物。
制备抗体和利用抗体进行细胞分离的方法在本领域是公知的，这些方法可用于此处描述的抗体和定形内胚层细胞。在一个方法中，将结合CXCR4的抗体偶联到磁珠上，然后与细胞培养物中的定形内胚层细胞结合，其中该细胞培养物经过酶处理以减少细胞间和底物的粘附。随后将细胞/抗体/磁珠混合物置于可动磁场中，用于分离与磁珠结合的定形内胚层细胞和未结合的细胞。当培养物中定形内胚层细胞与其他细胞进行了物理分离后，抗体结合被破坏，细胞重新种于合适的组织培养基中。
也可用其他方法获得富集的、分离的或纯化的定形内胚层细胞培养物或群。例如，在一些实施方案中，使CXCR4抗体与含定形内胚层的细胞培养物孵育，其中该培养物经过处理以减少细胞间和底物的粘附。洗涤、离心和重悬细胞。细胞悬浮物与二抗(例如能够与一抗结合的FITC偶联的抗体)孵育。洗涤、离心并在缓冲液中重悬细胞。然后用荧光激活细胞分选术(FACS)对细胞悬浮物进行分析和分选。收集于CXCR4-阴性细胞分离后的CXCR4-阳性细胞，从而分离了这种细胞类型。如果需要，可使用另一亲和方法或增加分选次数对分离的细胞组分进一步纯化，利用的是特异于定形内胚层细胞的相同或不同的标志物。
在其他方法中，利用与CXCR4结合的配体或其他分子富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞。一些方法中，这种分子是SDF-1或其片段、融合物或模拟物。
优选方法中，在诱导干细胞培养物向定形内胚层系分化后，从其他非定形内胚层细胞富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞。应了解上述富集、分离和纯化步骤可用于该培养物分化的任意阶段。
除了刚刚描述的步骤外，还可以用其他细胞分离技术分离定形内胚层细胞。此外，通过在促进定形内胚层细胞选择性存活或选择性扩增的生长条件下进行系列传代培养的方法富集或分离定形内胚层细胞。
使用此处描述的方法，富集的、分离的和/或纯化的定形内胚层细胞群和/或组织可在体外从多能性细胞培养物或细胞群产生，例如已经进行了至少部分分化的干细胞培养物或群。在一些方法中，细胞进行随机分化。但在优选方法中，细胞主要定向分化为定形内胚层。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外从人胚胎干细胞产生定形内胚层。使用此处描述的方法，细胞群或细胞培养物中的定形内胚层含量与未处理的细胞群或细胞培养物相比，至少富集了约2至约1000倍。
包含PDX1-阴性定形内胚层(定形内胚层)的组合物上述方法产生的细胞组合物包括包含定形内胚层的细胞培养物和富集定形内胚层的细胞群。例如，能够产生包含定形内胚层细胞的细胞培养物，其中培养物中至少约50～80％的细胞是定形内胚层细胞。因为分化方法的效率可通过改变某些参数(这些参数包括但不限于，细胞生长条件、生长因子浓度和培养步骤的时间控制)来调整，此处描述的分化方法可导致约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或超过约95％的多能性细胞向定形内胚层的转化。在采用分离定形内胚层细胞的方法中，例如，通过使用结合CXCR4受体的亲和试剂，可获得基本上纯的定形内胚层细胞群。
从PDX1-阴性定形内胚层产生PDX1-阳性前肠内胚层此处描述的包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物和群由PDX1-阴性定形内胚层产生，其中该PDX1-阴性定形内胚层如上所述由多能性细胞产生。一个优选的方法利用人胚胎干细胞作为起始材料。在一个实施方案中，hESC首先转化为PDX1-阴性定形内胚层细胞，然后转化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。但应了解用于PDX1-阳性前肠内胚层细胞产生的起始材料并不限于用多能性细胞分化方法产生的定形内胚层细胞。而且，任何PDX1-阴性定形内胚层细胞都可用于此处描述的方法，与它们的来源无关。
本发明一些实施方案中，包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群可用于进一步向包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或富集的细胞群分化。例如，可使用包含人PDX1-阴性、SOX17-阳性的定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。在一些实施方案中，细胞培养物或细胞群可能包含从前面分化步骤(即分化多能性细胞为定形内胚层细胞的步骤)保留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其他实施方案中，在添加用于PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子前，从细胞培养物或细胞群中去除前面分化步骤中的因子。其他实施方案中，用富集PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞群作为产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的来源。
通过向包含PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物中添加促进细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子(前肠分化因子)，培养基中的PDX1-阴性定形内胚层细胞可分化为PDX1-阳性内胚层细胞。本发明一些实施方案中，前肠分化因子是类视黄醇，例如视黄酸(RA)。一些实施方案中，类视黄醇与成纤维细胞生长因子(例如FGF-4和FGF-10)联用。其他实施方案中，类视黄醇与生长因子TGFβ超家族成员和/或条件培养基联用。
“条件培养基”是指与基本培养基比较发生了改变的培养基。例如，培养基的条件化可能造成从培养基的初始水平添加或去除分子，例如营养物和/或生长因子。在一些实施方案中，通过在一定条件下使一定类型的细胞在培养基中生长或维持一定时间段而使培养基条件化。例如，通过使hESC在一定温度、一定组成的培养基中扩增、分化或维持一定的时间而使培养基条件化。本领域技术人员应了解的是，细胞、培养基类型、持续时间和环境条件的众多组合可用于产生接近无穷排列的条件培养基。本发明的一些实施方案中，通过在包含约1％至约20％血清浓度的培养基中生长或维持分化的多能性细胞来条件化培养基。在其他实施方案中，通过使分化的多能性细胞在包含约1ng/ml至约1000ng/ml活化素A的培养基中的生长或维持来条件化培养基。在其他实施方案中，通过使分化的多能性细胞在包含约1ng/ml至约1000ng/ml BMP4的培养基中生长或维持来条件化培养基。在优选的实施方案中，通过使分化的hESC在包含约25ng/ml活化素A和约2μMRA的培养基(如RPMI)中生长或维持来制备条件培养基。
本发明的一些实施方案中，用于条件化培养基(这些培养基用于增强PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化)的细胞是在含约0％至约20％血清和/或一种或多种TGFβ超家族生长/分化因子的培养基(方案如RPMI)中从多能性细胞(如hESC)分化超过5天的细胞。添加分化因子(例如活化素A和BMP4)的浓度范围从约1ng/ml至约1000ng/ml。本发明的某些实施方案中，用于条件化培养基的细胞在低血清RPMI中从hESC分化超过5天。根据一些实施方案，低血清RPMI指含有低血清的培养基，其中血清浓度在一定时间段内逐渐增加。例如，在一个实施方案中，低血清RPMI在细胞生长第一天包含浓度约0.2％的胎牛血清(FBS)，细胞生长第二天约0.5％FBS，细胞生长第3至5天约2％FBS。在另一个实施方案中，低血清RPMI第一天包含血清浓度约0％，第二天约0.2％，第3～6天约2％。在某些优选的实施方案中，低血清RPMI中添加一种或多种分化因子，方案如活化素A和BMP4。除了制备用于条件化培养基的细胞，低血清RPMI也可用作PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的培养基。
本领域的普通技术人员应了解用于制备条件培养基的培养基不只是RPMI，前提是这种培养基不干扰PDX1-阳性前肠内胚层细胞的生长或维持。还应了解用于条件化培养基的细胞可以是不同的类型。在使用新鲜分化的细胞来条件化培养基的实施方案中，这种细胞可以在不同于RPMI的培养基中分化，前提是这种培养基不会抑制这种细胞的生长或维持。此外，技术人员应了解条件化的持续时间或制备用于条件化的细胞的持续时间不是分别必须是24小时或5天，因为其他的时间长度也足以获得此处报道的效果。
通常，类视黄醇与成纤维细胞生长因子(生长因子TGFβ超家族的成员)、条件培养基或任意这些前肠分化因子的组合联用，都可以造成比单用类视黄醇更强的PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化。在优选的实施方案中，添加RA和FGF-10到PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物中。在另一个优选的实施方案中，PDX1-阴性定形内胚层细胞在含有条件培养基、活化素A、活化素B和RA的培养基中分化。
就此处描述的分化方法的一些实施方案而论，将上述前肠分化因子添加到细胞中，使细胞培养物或细胞群中前肠分化因子的浓度足以促进至少部分PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物或细胞群向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化。当涉及细胞培养物和/或细胞群时，术语“部分”表示细胞培养物或细胞群任意不为零的数量，范围从单个细胞到整个细胞培养物或细胞群。
本发明的一些实施方案中，向培养物的细胞中添加类视黄醇使其浓度至少约0.01μM、至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.3μM、至少约0.4μM、至少约0.5μM、至少约0.6μM、至少约0.7μM、至少约0.8μM、至少约0.9μM、至少约1μM、至少约1.1μM、至少约1.2μM、至少约1.3μM、至少约1.4μM、至少约1.5μM，、至少约1.6μM、至少约1.7μM、至少约1.8μM、至少约1.9μM、至少约2μM、至少约2.1μM、至少约2.2μM、至少约2.3μM、至少约2.4μM、至少约2.5μM、至少约2.6μM、至少约2.7μM、至少约2.8μM、至少约2.9μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM、至少约5μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM或至少约50μM。此处使用的“类视黄醇(retinoid)”指视黄醇、视黄醛或视黄酸以及这些化合物的任何衍生物。在优选的实施方案中，类视黄醇是视黄酸。
本发明其他实施方案中，细胞培养物中存在一种或多种成纤维细胞生长因子家族的分化因子。例如，在一些实施方案中，细胞培养物中FGF-4的浓度至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml或至少约1000ng/ml。本发明进一步实施方案中，细胞培养物中FGF-10的浓度至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、或至少约1000ng/ml。在一些实施方案中，从FGF-4和FGF-10中选择一个与RA一起添加到细胞培养物中。优选的实施方案中，细胞培养物中RA浓度为1μM，FGF-10浓度为50ng/ml。
本发明一些实施方案中，在细胞培养物中存在TGFβ超家族的生长因子和/或条件培养基。这些分化因子可与RA和/或其它中前肠分化因子(包括但不限于FGF-4和FGF-10)联用。例如，在一些实施方案中，细胞培养物中可存在活化素A和/或活化素B，其浓度为至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml或至少约1000ng/ml。本发明的另一实施方案中，细胞培养物中存在条件培养基，其浓度是总培养基的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。一些实施方案中，细胞培养物中添加有活化素A、活化素B以及条件培养基和RA。在优选实施方案中，在包含1μM RA、约25ng/ml活化素A和低血清RPMI培养基(该培养基已被分化的hESC条件化约24小时，其中分化的hESC已在包含100ng/ml活化素A的低血清RPMI中分化约5天)的培养物中PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。在另一优选实施方案中，培养物中还存在活化素B和/或FGF-10，其浓度分别是25ng/ml和50ng/ml。
本发明的某些实施方案中，上述前肠分化因子在添加后从细胞培养物去除。例如，前肠分化因子可以在添加后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天内去除。
PDX1-阳性前肠内胚层细胞可在含有降低血清浓度的培养基中生长。血清浓度范围可从约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。在一些实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞生长在含血清替代物的条件下。例如，在某些实施方案中，培养基的血清浓度可低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。在一些实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可以在无血清的条件下生长。在其他实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。
在其他实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞在B27存在下生长。在这些实施方案中，B27可以从约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的浓度范围或者大于20％(v/v)的浓度添加到培养基中。在某些实施方案中，培养基中B27的浓度约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)、约5％(v/v)、约6％(v/v)、约7％(v/v)、约8％(v/v)、约9％(v/v)、约10％(v/v)、约15％(v/v)或约20％(v/v)。或者，添加的B27添加物的浓度可根据商品化的B27存储液浓度的倍数来计算。例如，Invitrogen(Carlsbad，CA)提供50×的B27存储液。向足够体积的生长培养基中添加足量这种存储液可以产生含所需量B27的培养基。例如，向90ml生长培养基中添加10ml 50×B27存储液将得到添加了5×B27的生长培养基。培养基中B27添加物的浓度可以是约0.1×、约0.2×、约0.3×、约0.4×、约0.5×、约0.6×、约0.7×、约0.8×、约0.9×、约1×、约1.1×、约1.2×、约1.3×、约1.4×、约1.5×、约1.6×、约1.7×、约1.8×、约1.9×、约2×、约2.5×、约3×、约3.5×、约4×、约4.5×、约5×、约6×、约7×、约8×、约9×、约10×、约11×、约12×、约13×、约14×、约15×、约16×、约17×、约18×、约19×、约20×和高于约20×。
监控PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化如同多能性细胞向定形内胚层细胞分化的情况，PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层分化的进程可通过测定这些细胞类型特征性的标志物的表达来监控。这种监控使得能决定在不同条件下(例如一种或多种分化因子浓度和环境条件)足以产生所需量PDX1-阳性前肠内胚层需要的时间。优选的实施方案中，通过检测PDX1的表达来决定足以产生所需量PDX1-阳性前肠内胚层所需的时间。本发明的一些实施方案中，通过检测标志物的存在或缺失来测定某些标志物的表达。或者，通过测定细胞培养物或细胞群的细胞中标志物存在的水平来测定某些标志物的表达。在这些实施方案中，标志物表达的测量可以是定性或定量的。如上所述，优选的定量检测由标志物基因产生的标志物表达的方法是使用Q-PCR。在具体实施方案中，Q-PCR被用于通过定量检测PDX1-阳性前肠内胚层特征性的标志物基因的表达和其他细胞类型特征性的标志物基因表达的缺失，来监控PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层培养物向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的进程。也可以用本领域其他公知的方法定量检测标志物基因表达。例如，可利用对感兴趣的标志物基因产物特异的抗体来检测标志物基因产物的表达。本发明一些实施方案中，测定了PDX1-阳性前肠内胚层特征性的标志物基因的表达以及PDX-1阴性定形内胚层、hESC和其他细胞类型特征性的标志物基因的显著表达的缺失。
如以下实施方案的进一步描述，PDX1是与PDX1-阳性前肠内胚层相关的标志物基因。因此，在本发明的一些实施方案中测定了PDX1的表达。在其他实施方案中，也测定了在PDX1-阳性前肠内胚层表达的其他标志物的表达，这些标志物包括但不限于SOX17、HOXA13和/或HOXC6。因为某些其他细胞类型(即内脏内胚层和某些神经外胚层)也表达PDX1，所以本发明一些实施方案涉及证明与内脏内胚层和/或神经外胚层有关的基因表达的缺失或基本上缺失。例如，在一些实施方案中，在内脏内胚层和/或神经外胚层表达的标志物(包括但不限于SOX7、AFP、SOX1、ZIC1和/或NFM)的表达被测定。
在一些实施方案中，用此处所述方法产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上不含表达SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM标志物基因的细胞。在某些实施方案中，用此处所述步骤产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上不含内脏内胚层、体壁内胚层和/或神经细胞。
PDX1-阳性前肠内胚层的富集，分离和/或纯化根据本发明的其他方面，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可以被富集、分离和/或纯化。本发明的一些实施方案中，富集PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群通过从细胞培养物中分离这种细胞来产生。
本发明的一些实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞用荧光标记，然后用荧光激活细胞分选术(FACS)来与未标记细胞分离。在这类实施方案中，用编码绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸或另一编码可表达荧光标志物基因的核苷酸标记PDX1-阳性细胞。例如，在一些实施方案中，至少一个拷贝的编码GFP或其生物学活性片段的核苷酸被导入多能性细胞(优选的是人胚胎干细胞)PDX1启动子的下游，以便GFP基因产物或其生物学活性片段的表达受PDX1启动子的控制。在一些实施方案中，编码PDX1的核苷酸的整个编码区域被编码GFP或其生物学活性片段的核苷酸替换。在其他实施方案中，编码GFP或其生物学活性片段的核苷酸与编码PDX1的核苷酸的至少一部分进行框内(inframe)融合，从而产生融合蛋白。在这类实施方案中，融合蛋白保留与GFP相似的荧光能力。
如前所述，荧光标记的细胞(例如上述的多能性细胞)分化为定形内胚层，然后是PDX1-阳性前肠内胚层。因为PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达荧光标志物基因，而PDX1-阴性细胞不表达，这两种细胞类型可被分离。在一些实施方案中，用FACS分选包含荧光标记的PDX1-阳性细胞和未标记的PDX1-阴性细胞的混合物的细胞悬浮物。PDX1阳性细胞从PDX1-阴性细胞分离后收集，从而分离这种细胞类型。如果需要，可使用相同的或不同的对PDX1-阳性前肠内胚层特异的标志物增加分选次数，以进一步纯化分离的细胞组合物。
除了刚刚描述的步骤，PDX1-阳性前肠内胚层细胞也可用细胞分离的其他技术进行分离。此外，PDX1-阳性前肠内胚层细胞也可使用在促进上述PDX1-阳性前肠内胚层细胞选择性存活或选择性扩增的生长条件下进行系列传代培养的方法富集或分离定形内胚层细胞。
应了解上述富集、分离和纯化步骤可用于这类培养物的任意分化阶段。
使用此处描述的方法，富集的、分离的和/或纯化的PDX1-阳性前肠内胚层细胞的群和/或组织可在体外从已经进行至少部分分化的PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞培养物或细胞群得到。在一些实施方案中，细胞进行随机分化。但在优选的实施方案中，细胞主要定向分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外从人胚胎干细胞产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
使用此处描述的方法，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，细胞群或细胞培养物中的PDX1-阳性前肠内胚层细胞含量可被富集至少约2至约1000倍。一些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约5至约500倍。其他实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约10至约200倍。其他实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约20至约100倍。其他实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约40至约80倍。某些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约2至约20倍。
包含PDX1-阳性前肠内胚层的组合物本发明的一些实施方案涉及包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中PDX1-阳性前肠内胚层细胞是多潜能细胞(PDX1-阳性前肠内胚层)，可以分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官。根据某些实施方案，PDX1-阳性前肠内胚层是哺乳动物细胞，在优选实施方案中，定形内胚层细胞是人细胞。
本发明的其他实施方案涉及包含一种或多种选自hESC、PDX1-阴性定形内胚层细胞、PDX1-阳性前肠内胚层细胞和中胚层细胞的细胞类型的细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，培养物中hESC少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的全部细胞。其他实施方案中，培养物中PDX1-阴性定形内胚层细胞少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的全部细胞。其他实施方案中，培养物中中胚层细胞少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的占全部细胞。
本发明的其他实施方案涉及用此处描述的方法产生的包含PDX1-阳性前肠内胚层作为主要细胞类型的组合物、例如细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，用此处描述的方法产生包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约52％或至少约51％的PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。优选的实施方案中、细胞培养物或细胞群的细胞包含人细胞。其他实施方案中，用此处描述的方法产生包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。优选实施方案中，细胞培养物或细胞群的细胞包含人类细胞。一些实施方案中，计算细胞培养物或细胞群中PDX1-阳性前肠内胚层细胞的比例时不考虑残留在培养物中的饲养细胞。
本发明的其他实施方案涉及包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞和PDX1-阴性定形内胚层细胞的混合物的组合物，例如细胞培养物或细胞群。例如，能够产生包含约每95个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约5个PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。其他实施方案中，能够产生包含约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约95个PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。此外，预期可以得到包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞和PDX1-阴性定形内胚层其他比例的细胞培养物或细胞群。例如，预期可以得到包含约每1,000,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每100,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每10,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1000个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每500个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每100个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每10个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每4个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每2个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约2个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约4个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约5个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约10个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约20个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约50个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约100个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1000个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约10,000个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约100,000个PDX1-阳性前肠内胚层细胞、和约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞对应至少约1,000,000个PDX1-阳性前肠内胚层细胞的组合物。
本发明一些实施方案中，用于产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的PDX1-阴性定形内胚层细胞衍生自人多能性细胞，例如人多能干细胞。某些实施方案中，人多能性细胞衍生自桑椹胚、胚胎内细胞团或胚胎生殖嵴。某些其他实施方案中，人多能性细胞衍生自发育已经越过胚胎期的多细胞结构的性腺组织或生殖组织。
本发明的进一步实施方案涉及包含人细胞(包括人PDX1-阳性前肠内胚层)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的人细胞中PDX1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其他实施方案中，至少5％的人细胞中、至少10％的人细胞中、至少15％的人细胞中、至少20％的人细胞中、至少25％的人细胞中、至少30％的人细胞中、至少35％的人细胞中、至少40％的人细胞中、至少45％的人细胞中、至少50％的人细胞中、至少55％的人细胞中、至少60％的人细胞中、至少65％的人细胞中、至少70％的人细胞中、至少75％的人细胞中、至少80％的人细胞中、至少85％的人细胞中、至少90％的人细胞中、至少95％的人细胞中或至少98％的人细胞中、PDX1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(其中PDX1的表达高于AFP、SOX7、SOX1，ZIC1和/或NFM的表达)的比例时不考虑饲养细胞。
应了解本发明的一些实施方案涉及包含人PDX1-阳性前肠内胚层细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中从至少约2％到超过约98％的人细胞中一种或多种选自SOX17、HOXA13或HOXC6的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少约95％的人细胞中或至少约98％的细胞中，一种或多种选自SOX17、HOXA13或HOXC6的表达高于AFP、SOX7、SOX1，ZIC1和/或NFM的表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(一种或多种选自SOX17、HOXA13或HOXC6的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达)的比例时不考虑饲养细胞。
本发明的其他实施方案涉及包含哺乳动物内胚层细胞(例如人内胚层细胞)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的内胚层细胞中PDX1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其他实施方案中，至少约5％的内胚层细胞中、至少约10％的内胚层细胞中、至少约15％的内胚层细胞中、至少约20％的内胚层细胞中、至少约25％的内胚层细胞中、至少约30％的内胚层细胞中、至少约35％的内胚层细胞中、至少约40％的内胚层细胞中、至少约45％的内胚层细胞中、至少约50％的内胚层细胞中、至少约55％的内胚层细胞中、至少约60％的内胚层细胞中、至少约65％的内胚层细胞中、至少约70％的内胚层细胞中、至少约75％的内胚层细胞中、至少约80％的内胚层细胞中、至少约85％的内胚层细胞中、至少约90％的内胚层细胞中、至少约95％的内胚层细胞中或至少约98％的内胚层细胞中、PDX1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。
本发明的其他实施方案涉及包含哺乳动物内胚层细胞(例如人内胚层细胞)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的胚胎细胞中一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其他实施方案中，至少约5％的内胚层细胞中、至少约10％的内胚层细胞中、至少约15％的内胚层细胞中、至少约20％的内胚层细胞中、至少约25％的内胚层细胞中、至少约30％的内胚层细胞中、至少约35％的内胚层细胞中、至少约40％的内胚层细胞中、至少约45％的内胚层细胞中、至少约50％的内胚层细胞中、至少约55％的内胚层细胞中、至少约60％的内胚层细胞中、至少约65％的内胚层细胞中、至少约70％的内胚层细胞中、至少约75％的内胚层细胞中、至少约80％的内胚层细胞中、至少约85％的内胚层细胞中、至少约90％的内胚层细胞中、至少约95％的内胚层细胞中或至少约98％的内胚层细胞中，一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。
使用此处描述的方法，可产生基本上不含其他细胞类型的包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的组合物。关于细胞培养物或细胞群中的细胞，术语“基本上不含”表示细胞培养物或细胞群不含的特异细胞类型在细胞培养物或细胞群的所有细胞中占有的比例少于5％。本发明的一些实施方案中，用此处描述的方法产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞群或细胞培养物基本上不含显著表达AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物基因的细胞。
本发明的一个实施方案中，根据标志物基因的表达对PDX1-阳性前肠内胚层细胞的描述如下PDX1高、AFP低、SOX7低、SOX1低、ZIC1低和NFM低。
增加SOX17-阳性定形内胚层细胞中PDX1的表达本发明的一些方面涉及增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中表达PDX1基因产物的方法。在这类实施方案中，向SOX17-阳性定形内胚层细胞中添加足以增加PDX1基因产物表达量的分化因子。与分化因子接触的SOX17-阳性定形内胚层细胞可以是PDX1-阴性或PDX1-阳性。在一些实施方案中，分化因子可以是类视黄醇。某些实施例中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与浓度范围约0.01μM至约50μM的类视黄醇接触。在优选的实施方案中，所述类视黄醇是RA。
在本发明的其他实施方案中，通过使SOX17-阳性定形内胚层细胞与成纤维细胞生长因子家族的分化因子接触来增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中PDX1基因产物的表达。这类分化因子可单独使用或与RA联用。一些实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与浓度范围约10ng/ml至约1000ng/ml的成纤维细胞生长因子接触。一个优选实施方案中，FGF生长因子是FGF-10。
本发明的一些实施方案中，通过使SOX17-阳性细胞与B27接触来增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中PDX1基因产物的表达。这类分化因子可以单独使用或与FGF家族分化因子和类视黄醇中的一种或两种联用。一些实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与浓度范围约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的B27接触。在优选的实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与RA、FGF-10和B27接触。
增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中PDX1基因产物表达的方法可在降低血清浓度或无血清的生长培养基中进行。一些实施方案中，血清浓度范围从约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。一些实施方案中，SOX17-阳性定形内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。
能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子的鉴定本发明的其他方面涉及鉴定一种或多种能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。在这类方法中，获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群，并测定细胞培养物或细胞群中PDX1的表达。在测定PDX1表达后，使细胞培养物或细胞群的细胞与候选分化因子接触。在一些实施方案中，在使细胞与候选分化因子接触时或与候选分化因子接触后不久检测PDX1的表达。然后在使细胞与候选分化因子接触后的一个或多个时间点检测PDX1表达。与接触候选分化因子前的PDX1的表达相比，如果在接触候选分化因子后PDX1的表达增加，候选分化因子可被鉴定为能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。
一些实施方案中，上述鉴定能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法还包括测定细胞培养物或细胞群中HOXA13和/或HOXC6基因的表达。在这类实施方案中，在使细胞与候选分化因子接触前后分别测定HOXA13和/或HOXC6基因的表达。与接触分化因子前PDX1和HOXA13的表达相比，如果在接触候选分化因子后，PDX1和HOXA13的表达增加，就可鉴定候选分化因子能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。相似地，与接触分化因子前比较，如果在接触候选分化因子后，PDX1和HOXC6的表达增加，就可鉴定候选分化因子能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。在优选的实施方案中，通过在使细胞培养物或细胞群的细胞与候选分化因子接触前后分别测定PDX1、HOXA13和HOXC6的表达来鉴定可以促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的候选分化因子。优选实施方案中，用Q-PCR检测PDX1、HOXA13和HOXC6的表达。
应了解在一些实施方案中，在使细胞培养物或细胞群中的细胞与候选分化因子接触时或在接触候选分化因子后不久检测PDX1、HOXA13和HOXC6中一种或多种的表达，而不是在细胞接触候选分化因子之前检测。在这类实施方案中，将在使细胞与候选分化因子接触时或在接触候选分化因子后不久PDX1、HOXA13和HOXC6中的一种或多种的表达与在细胞接触候选分化因子后的一个或多个时间点的PDX1、HOXA13和HOXC6中的一个或多个表达进行比较。
在上述方法的一些实施方案中，在细胞与候选分化因子接触后检测PDX1表达的一个或多个时间点的范围可以从约1小时至约10天。例如，可以在细胞与候选分化因子接触后约1小时、细胞与候选分化因子接触后约2小时、细胞与候选分化因子接触后约4小时、细胞与候选分化因子接触后约6小时、细胞与候选分化因子接触后约8小时、细胞与候选分化因子接触后约10小时、细胞与候选分化因子接触后约12小时、细胞与候选分化因子接触后约16小时、细胞与候选分化因子接触后约24小时，细胞与候选分化因子接触后约2天、细胞与候选分化因子接触后约3天、细胞与候选分化因子接触后约4天、细胞与候选分化因子接触后约5天、细胞与候选分化因子接触后约6天、细胞与候选分化因子接触后约7天、细胞与候选分化因子接触后约8天、细胞与候选分化因子接触后约9天、细胞与候选分化因子接触后约10天或细胞与候选分化因子接触后超过10天检测PDX1的表达。
用于此处描述的方法的候选分化因子可以选自化合物，例如多肽和小分子。例如，候选多肽包括但不限于生长因子、细胞因子、趋化因子、胞外基质蛋白和合成肽。在优选的实施方案中，生长因子来自FGF家族，例如FGF-10。候选小分子包括但不限于从组合化学合成的化合物和天然产物，例如类固醇、类异戊二烯、萜类化合物、类苯基丙烷(phenylpropanoid)、生物碱类和类黄酮。本领域技术人员应了解有数千种天然和合成的小分子可以利用，预期可用于此处描述的方法的小分子不限于以上举例的种类。代表性地，小分子的分子量低于10,000amu。在优选的实施方案中，小分子是类视黄醇，例如RA。
能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子的鉴定本发明的其他方面涉及鉴定一种或多种能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。在这类方法中，获得包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物或细胞群，并测定细胞培养物或细胞群中标志物的表达。在测定标志物的表达后，使细胞培养物或细胞群的细胞与候选分化因子接触。在一些实施方案中，在使细胞与候选分化因子接触时或在接触候选分化因子后不久检测标志物的表达。然后在细胞与候选分化因子接触后的一个或多个时间点检测相同标志物的表达。与接触分化因子前比较，如果在接触候选分化因子后，标志物的表达增加或降低，就可鉴定候选分化因子能够促进PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。在优选的实施方案中，用Q-PCR检测标志物的表达。
在上述方法的一些实施方案中，在使细胞与候选分化因子接触后检测标志物表达的一个或多个时间点的范围可以从约1小时至约10天。例如，可以在使细胞与候选分化因子接触后约1小时、使细胞与候选分化因子接触后约2小时，使细胞与候选分化因子接触后约4小时，使细胞与候选分化因子接触后约6小时，使细胞与候选分化因子接触后约8小时，使细胞与候选分化因子接触后约10小时，使细胞与候选分化因子接触后约12小时，使细胞与候选分化因子接触后约16小时，使细胞与候选分化因子接触后约24小时，使细胞与候选分化因子接触后约2天，使细胞与候选分化因子接触后约3天，使细胞与候选分化因子接触后约4天，使细胞与候选分化因子接触后约5天，使细胞与候选分化因子接触后约6天，使细胞与候选分化因子接触后约7天，使细胞与候选分化因子接触后约8天，使细胞与候选分化因子接触后约9天，使细胞与候选分化因子接触后约10天或使细胞与候选分化因子接触后超过10天检测标志物的表达。
如前面所述，用于此处描述的方法的候选分化因子可以选自例如多肽或小分子的化合物。
尽管此处公开的每种方法都关于PDX1-阳性前肠内胚层细胞，应了解在某些实施方案中，该方法可用于产生包含此处描述的PDX1-阳性前肠/中肠内胚层细胞和/或此处描述的前肠后部的PDX1-阳性内胚层细胞的组合物。此外，本说明书中公开的任何PDX1-阳性内胚层细胞类型都可用在此处描述的筛选方法中。
以上概括描述了本发明，可通过参照此处提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
实施例以下很多实施例描述了人多能性细胞的使用。产生人多能性细胞的方法在现有技术中是公知的，在许多科学出版物中都有描述，包括第5,453,357、5,670,372、5,690,926、6,090,622、6,200,806和6,251,671号美国专利及
发明者凯文·艾伦·达穆尔, 艾伦·D·阿古尼克, 苏珊·埃利泽, 伊曼纽尔·E·贝特格 申请人:赛瑟拉公司