专利名称：用于解除烟曲霉毒素的毒性的微生物及其用途、用于解除烟曲霉毒素的毒性的方法和包 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于解除烟曲霉毒素(Fumonisin)和烟曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，以及细菌或酵母以单独或者两种或更多种株系相组合的形式在解除食物和/或饲料中的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，还涉及使用微生物来解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的方法，以及用于使真菌毒素特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物失活的饲料添加剂。
包括许多不同毒素的真菌毒素在现代食物和饲料工业中产生了越来越多的问题，因为随后被加工成食物或饲料或者直接给动物喂食的许多植物以各种浓度受到各种各样的毒素的侵害，这样，除了必须检测各种毒素外，还必须采用或发现用于相应毒素的解毒或降解的有效且无害的方法。
一种获得无毒素的植物的方法是尝试培养所谓的抗特定毒素的转基因植物，或通过使用“经基因操作的”植物来获得食物，所述食物由于相应植物对所述毒素的抗性而不含有这些毒素。
除了极其复杂和麻烦外，该方法在全世界许多国家中并不是毫无争议的，并且一直在努力寻找使植物解毒的其他方法。
特别是在玉米中经常碰到的且在摄取所述玉米后导致严重损害的毒素是烟曲霉毒素或烟曲霉毒素衍生物，虽然其在实验室试验中可被已知的微生物降解，然而，对于所述毒素，迄今还未发现能够在不同的毒素浓度下和在不同的营养环境中进行此类降解的微生物。此外，已知的微生物需要超过24小时的相当长的时间来进行该降解，这样在工业或商业规模上使用此类微生物是不现实的。
和食物或饲料中的真菌毒素相关的另一个问题在于，由于制备了越来越多的包含多种谷物或谷物品种的混合饲料或食物，多种真菌毒素将在同一种食物或饲料中同时存在，并且所述真菌毒素的有意义的或靶向的降解显得十分必要。此外，重新的研究证实，所述毒素在相互之间可显示出组合的相互作用，该相互作用可进一步加强单种毒素的有害效应。例如在1996年，Harvey报导了，烟曲霉毒素和脱氧瓜萎镰菌醇在猪中的协同作用。此外，认为大多数例如可在饲料中包含的毒素将在动物中导致免疫抑制作用，这归因于真菌毒素的同时出现。
因而，本发明目的在于提供用于解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，所述微生物一方面能够极快地降解所述毒素，另一方面，除了该快速降解外，还能在各种各样营养物浓度存在的情况下进行所述降解。最后，本发明目的是提供微生物或微生物组合，除烟曲霉毒素外，所述微生物或微生物组合还能够单独地或组合地降解其他毒素，从而获得无毒素的饲料，特别是当使用各种各样的饲料植物时。
为实现该目的，根据本发明提供了用于解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，其中使用在单步骤或多步骤反应中将烟曲霉毒素酶促转化成脱氨基代谢物的具有解除毒性作用的细菌或酵母，所述细菌或酵母选自可归类于鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)这一分类单位的株系DSM 16254和DSM 15257、可归类于根瘤菌目(Rhizobiales)这一分类单位的株系DSM 16255、可归类于微杆菌科(Microbacteriaceae)这一分类单位的株系DSM16256、可归类于根瘤菌科(Rhizobiaceae)这一分类单位的株系DSM16253、可归类于产碱菌科(Alcaligenaceae)这一分类单位的株系DSM 16252和毕赤酵母属物种(Pichia sp.)DSM 16562。上述微生物不仅能够在单步骤或多步骤反应中将烟曲霉毒素酶促转化成脱氨基代谢物，而且还能在极其短的时间内和还在复杂的环境例如饲料或食物存在的情况下，即在多种或各种各样碳源存在的情况下，特别是在营养物供给过多的情况下，进行该过程。
逐个地，可如下来概述所述微生物。在用正向引物27对16S rDNA进行部分测序(序列长度689bp)后将株系DSM 16254归类为鞘氨醇单胞菌科这一分类单位。部分16S rDNA序列具有下列碱基序列1 GAACGCTGGS GGCATGCCTA ACACATGCAA GTCGAACGAA GTCTTCGGAC TTAGTGGCGC61 ACGGGTGCGT AACGCGTGGG AATCTGCCCT TGGGTACGGA ATAACTCAGA GAAATTTGTG121 CTAATACCGT ATAATGTCTT CGGACCAAAG ATTTATCGCC CAAGGATGAG CCCGCGTAAG181 ATTAGCTAGT TGGTGGGGTA AAGGCCCACC AAGGCGACGA TCTTTAGCTG GTCTGAGAGG241 ATGATCAGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG301 AATATTGGAC AATGGGCGAA AGCCTGATCC AGCAATGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCCCTA361 GGGTTGTAAA GCTCTTTTAC CCGGGATGAT AATGACAGTA CCGGGAGAAT AAGCTCCGGC421 TAACTCCGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG GAGGGAGCTA GCGTTGTTCG GAATTACTGG481 GCGTAAAGCG CGCGTAGGCG GTTTTTCAAG TCAGAGGTGA AAGCCCGGGG CTCAACCCCG541 GAATTGCCTT TGAAACTGGA AGACTTGAAT CTTGGAGAGG TCAGTGGAAT TCCGAGTGTA601 GAGGCGAAAT TCGTAGATAT TCGGAAGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGACTG ACTGGACAAG661 ATTGACGCTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGA其中所述微生物是革兰氏阴性的，并形成小的小杆状体，所述小杆状体主要以单个细胞存在，和部分地构成丝状链结构。
在16S rDNA的部分测序(用反向引物30，获得的序列长度426bp)后，株系DSM 16257同样属于鞘氨醇单胞菌科这一分类单位。结果得到下列序列1 GATCCTGGCT CAGAACGAAC GCTGGCGGCA TGCCTAACAC ATGCAAGTCG AACGAAGTCT61 TCGGACTTAG TGGCGCACGG GTGCGTAACG CGTGGGAATC TGCCCTTGGG TACGGAATAA121 CTCAGAGAAA TTTGTGCTAA TACCGTATAA TGACTTCGGT CCAAAGATTT ATCGCCCAAG181 GATGAGCCCG CGTAAGATTA GCTAGTTGGT GGGGTAAAAG CCTACCAAGG CGACGATCTT241 TAGCTGGTCT GAGAGGATGA TCAGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG301 GGAGGCAGCA GTGGGGAATA TTGGACAATG GGCGAAAGCC TGATCCAGCA ATGCCGCGTG361 AGTGATGAAG GCCCTAGGGT TGTAAAGCTC TTTTACCCGG GATGATAATG ACAGTACCGG421 GAGAAT该微生物形成绝大多数以长的丝状细胞结构排列的小的小杆状体。
在用正向引物27对16S rDNA进行部分测序后，DSM 16255提供了下列720bp长的序列
1 ACGCTGGCGG CAGGCTTAAC ACATGCAAGT CGAACGGTCT CTTCGGAGGC AGTGGCAGAC61 GGGTGAGTAA TGCATGGGAA TCTACCGTTC TCTACGGAAT AACTCAGGGA AACTTGTGCT121 AATACCGTAT ACGCCCTTTT GGGGAAAGAT TTATCGGAGA ATGATGAGCC CATGTTGGAT181 TAGCTAGTTG GTAGGGTAAA GGCCTACCAA GGCGACGATC CATAGCTGGT CTGAGAGGAT241 GATCAGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA301 TATTGGACAA TGGGCGCAAG CCTGATCCAG CCATGCCGCG TGAGTGATGA AGGCCCTAGG361 GTTGTAAAGC TCTTTCACCG GTGAAGATAA TGACGGTAAC CGGAGAAGAA GCCCCGGCTA421 ACTTCGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGAA GGGGGCTAGC GTTGTTCGGA TTTACTGGGC481 GTAAAGCGCA CGTAGGCGGA CTTTTAAGTC AGGGGTGAAA TCCCGGGGCT CAACCCCGGA541 ACTGCCTTTG ATACTGGAAG TCTTGAGTAT GGAAGAGGTA AGTGGAATTG CGAGTGTAGA601 GGTGAAATTC GTAGATATTC GCAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGGCTTAC TGGTCCATTA661 CTGACGCTGA GGTGCGAAAG CGTGGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC该微生物属于根瘤菌目这一分类单位，是革兰氏阴性的，并且主要以单个细胞的形式形成小的小杆状体。
微生物DSM 16256可归类于微杆菌科这一分类单位。使用正向引物27对16S rDNA所进行的部分测序提供了下列706pb长的序列1 GAACGCTGGC GGCGTGCTTA ACACATGCAA GTCGAACGAT GAAGCTGGAG CTTGCTCTGG61 TGGAAGAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGAGTAACCT GCCCCAGACT CTGGGATAAG121 CGCTGGAAAC GGCGTCTAAT ACTGGATATG ACCCCTACAG GCATCTGTTG GGGGTGGAAA181 GATTTATCGG TCTGGGATGG GCTCGCGGCC TATCAGCTAG ATGGTGAGGT AACGGCTCAC241 CATGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG GGTGACCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG301 GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGCA CAATGGGCGA AAGCCTGATG361 CAGCAACGCC GCGTGAGGGA TGACTGCCTT CGGGTTGTAA ACCTCTTTTA GTAGGGAAGA421 AGCGAAAGTG ACGGTACCTG CAGAAAAAGC ACCGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT481 AATACGTAGG GTGCAAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGAGCTCG TAGGCGGCTT541 GTCGCGTCTG CTGTGAAAAC CCGAGGCTCA ACCTCGGGCC TGCAGTGGGT ACGGGCAGGC601 TAGAGTGCGG TAGGGGAGAT TGGAATTCCT GGTGTAGCGG TGGAATGCGC AGATATCAGG661 AGGAACACCG ATGGCGAAGG CAGATCTCTG GGCCGCTACT GACGCT该微生物是革兰氏阳性的，并具有小而短的小杆状体，所述杆状体部分地以链状细胞联合体排列。
在16S rDNA的部分测序(反向引物530，序列长度392bp)后，DSM 16253属于根瘤菌科这一分类单位。所述序列如下
1 TCCTGGCTCA GAACGAACGC TGGCGGCAGG CTTAACACAT GCAAGTCGAG CGCCCCGCAA61 GGGGAGCGGC AGACGGGTGA GTAACGCGTG GGAATCTACC GAGCCCTGCG GAATAGCTCC121 GGGAAACTGG AATTAATACC GCATACGCCC TACGGGGGAA AGATTTATCG GGGTTTGATG181 AGCCCGCGTT GGATTAGCTA GTTGGTGGGG TAAAGGCCTA CCAAGGCGAC GATCCATAGC241 TGGTCTGAGA GGATGATCAG CCACATTGGG ACTGAGACAC GGCCCAAACT CCTACGGGAG301 GCAGCAGTGG GGAATATTGG ACAATGGGCG CAAGCCTGAT CCAGCCATGC CGCGTGAGTG361 ATGAAGGCCC TAGGGTTGTA AAGCTCTTTC AC所述微生物是革兰氏阴性的，并具有主要作为单个细胞存在的小的小杆状体。
微生物DSM 16252可归类于产碱菌科这一分类单位。16S rDNA的部分测序提供了具有下列核苷酸序列的476bp长的DNA片段1 TCCTGGCTCA GATTGAACGC TAGCGGGATG CCTTACACAT GCAAGTCGAA CGGCAGCACG61 GACTTCGGTC TGGTGGCGAG TGGCGAACGG GTGAGTAATG TATCGGAACG TGCCTAGTAG121 CGGGGGATAA CTACGCGAAA GCGTAGCTAA TACCGCATAC GCCCTACGGG GGAAAGCAGG181 GGATCGCAAG ACCTTGCACT ATTAGAGCGG CCGATATCGG ATTAGCTAGT TGGTGGGGTA241 ACGGCTCACC AAGGCGACGA TCCGTAGCTG GTTTGAGAGG ACGACCAGCC ACACTGGGAC301 TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATTTTGGAC AATGGGGGAA361 ACCCTGATCC AGCCATCCCG CGTGTGCGAT GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GCACTTTTGG421 CAGGAAAGAA ACGTCATGGG CTAATACCCC GTGAAACTGA CGGTACCTGC AGAATA所述微生物是革兰氏阴性的，并具有小而直的小杆状体，所述小杆状体部分地以块状的多细胞联合体存在。
DSM 16562，即毕赤酵母属物种，呈示出椭圆形的、相对较小的酵母细胞，其单个地而不以细胞联合体存在。
逐个地，可证明，尽管这些微生物相互之间相对不同，但除了能够极快地解除毒性外，还共同具有甚至在复杂的环境中快速且可靠地进行烟曲霉毒素的该解毒过程的特性。
根据本发明的一个进一步方面，以粉末、液体或凝胶的形式来稳定细菌或酵母，由此提供能够在任何时候用于各自用途的稳定产品。
与本发明的一个进一步方面相应地，以无细胞提取物或粗提物的形式使用所述细菌或酵母，由此可快速且可靠地制备可用的微生物产品。
为了尽可能完全地从食物或饲料中除去毒素，根据本发明的一个进一步方面，用本发明的微生物可以解除除了烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物之外的至少一种其他真菌毒素的毒性，所述其他真菌毒素选自玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素或赭曲毒素。逐个地，已证明本发明的微生物能够解除至少一种其他毒素的毒性，其中该解毒过程可和烟曲霉毒素的解毒过程一样快速且有效地完成。因此，通过提供所述微生物，可完全降解食物或饲料特别是食物或饲料混合物中的大多数毒素而无需任何其他添加剂，从而获得高价值的、无毒素的食物或饲料。
本发明还涉及细菌或酵母以单独或者两种或更多种株系相组合的形式在解除食物和/或饲料中的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，所述细菌或酵母选自可归类于鞘氨醇单胞菌科这一分类单位的株系DSM 16254和DSM 15257、可归类于根瘤菌目这一分类单位的株系DSM 16255、可归类于微杆菌科这一分类单位的株系DSM16256、可归类于根瘤菌科这一分类单位的株系DSM 16253、可归类于产碱菌科这一分类单位的株系DSM 16252和毕赤酵母属物种DSM16562。通过使用本发明的微生物，不仅可以完全解除食物和/或饲料中的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性，而且，除了所述微生物能够在提供过量碳供给的培养基中进行解毒外，所述微生物还能够在极其短的时间内实施该解毒过程。此外，通过使用上述微生物，还可以解除除了烟曲霉毒素外的至少一种其他真菌毒素的毒性，所述其他真菌毒素选自玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素或赭曲毒素。通过此类用途，特别是在混合饲料或用于人消费的混合的谷物产品中，可以保证借助于本发明的微生物，将几种存在于谷物中的毒素安全且快速地降解。
为了进一步使所述降解完全，根据本发明使用由细菌和/或酵母组成的混合培养物来解除真菌毒素的毒性。通过使用混合培养物，使得能够定向抗击大多数在同一种食物或饲料或饲料混合物中同时存在的毒素，从而可获得所述毒素的完全解毒。此外，通过此类用途，第一次能够安全地防止或阻止由于几种真菌毒素种类的同时存在而导致的不希望的协同作用的发生。
此外，通过使用本发明的微生物，使得能够降解浓度非常低的各种各样的真菌毒素，特别是100μg/kg至500mg/kg，优选地250μg/kg至25mg/kg的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物，10μg/kg至10mg/kg，优选地40μg/kg至2mg/kg的玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物，1μg/kg至2mg/kg，优选地10μg/kg至750μg/kg的黄曲霉毒素，1μg/kg至2mg/kg，优选地5μg/kg至500μg/kg的赭曲毒素，由此，除了通过使用本发明的微生物可解除各种各样的毒素的毒性外，还可确保极低浓度的所述毒素也受到攻击和降解，迄今为止，使用常规的微生物做到这点仍是非常困难的，虽然并不是完全不可能的。
为了尽可能地完全解除例如在混合饲料中包含的所有毒素的毒性，将本发明的用途进一步发展到这样的程度，即使用额外地包含至少一种其他细菌或酵母的组合或混合培养物来解除真菌毒素，特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、单端孢菌毒素和/或黄曲霉毒素的毒性，所述其他细菌或酵母选自鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonas sp.)DSM 14169、Ralstonia eutrophaDSM 14171、真杆菌属物种(Eubacterium sp.)DSM 14197、Trichosporonmycotoxinivorans DSM 14153、隐球酵母属物种(Cryptococcus sp.)DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性丝孢酵母(Trichosporon mucoides)DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM14162或真杆菌DSM 11798。通过使用额外地包含至少一种特别是适合于降解单端孢菌毒素、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、黄曲霉毒素或赭曲毒素的其他细菌或酵母的组合或混合培养物，除了本发明微生物的解毒作用(即烟曲霉毒素的降解)外，能够将其对于其他毒素的降解能力扩展到这样的程度，即通过定向使用几种微生物使得能够一起地和相互独立地快速且完全地降解可能存在于饲料中的所有毒素。
在使用本发明的微生物来解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的方法中，基本上如此进行，即在单步骤或多步骤反应中以特定微生物数目将饲料中的烟曲霉毒素酶促降解成脱氨基代谢物。根据进一步方面，优选地在基本培养基中或在具有过量营养物供给和碳源的复杂环境中，在含水的条件下进行所述解毒过程。这样的方法控制允许本发明的微生物用于这样的方法，即在所述方法中直接在饲料中进行解毒而不考虑可提供给所述微生物使用的碳的量。这是特别重要的，因为绝大部分迄今已知的微生物只能在基本培养基或不具有提高的碳供给的环境中显示其解毒作用，这使得大部分已知的微生物由于过量的碳供给而不适合直接在食物和饲料中使用。
根据一个优选的进一步方面，如此控制所述方法，即在15分钟至12小时，特别是15分钟至2小时内施行所述方法。在此类方法控制的情况下，一个方面能够确保在食物或饲料中存在的所有真菌毒素特别是烟曲霉毒素被降解，另一方面，不仅可降解真菌毒素，而且可在这样短的时间内进行所述降解，从而使得能够大规模地而不仅仅在实验室规模上应用该方法。
如果，与本发明方法的一个进一步方面相应地，使用额外地包含至少一种其他细菌或酵母的组合或混合培养物来解除真菌毒素，特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、单端孢菌毒素和/或黄曲霉毒素的毒性，那么除了降解烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物和降解能够另外地被本发明微生物降解的真菌毒素之外，如此控制所述方法，即通过使用定向选择的微生物来实现食物和/或饲料的完全解毒，所述其他细菌或酵母选自鞘氨醇单胞菌属物种DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonasnitritreducens DSM 14168、寡养单胞菌属物种DSM 14169、Ralstoniaeutropha DSM 14171、真杆菌属物种DSM 14197、Trichosporonmycotoxinivorans DSM 14153、隐球酵母属物种DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性丝孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真杆菌DSM 11798。
为了可靠地完全实施所述消毒过程，与本发明的一个进一步方面相应地，为了使食物和/或饲料解毒，将所述微生物各以0.01重量％至1.5重量％，特别是0.05重量％至0.7重量％的量与所述食物和/或饲料混合。
最后，本发明包括用于使真菌毒素特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物失活的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂以2×108/kg饲料添加剂至2×1015/kg饲料添加剂，特别是1×109/kg饲料添加剂至5×1012/kg饲料添加剂的微生物数目包含权利要求1至4中任一项的微生物。通过使用以2×108/kg饲料添加剂至2×1015/kg饲料添加剂的微生物数目包含所述微生物的饲料添加剂，确保了，所有能够被本发明微生物降解的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物被完全解毒，此外还可以降解所有能够被本发明微生物降解的其他毒素。
为了将所述降解扩展至可只部分地或不完全地被本发明微生物降解的真菌毒素，将所述饲料添加剂进一步发展至额外地包含至少一种其他细菌或酵母以解除真菌毒素特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、单端孢菌毒素和/或黄曲霉毒素的毒性，所述其他细菌或酵母选自鞘氨醇单胞菌属物种DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducensDSM 14168、寡养单胞菌属物种DSM 14169、Ralstonia eutropha DSM14171、真杆菌属物种DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM14153、隐球酵母属物种DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性丝孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真杆菌DSM 11798。因而，通过几种微生物的定向组合，成功地完全降解了在同一饲料中的所有毒素，从而能够可靠地避免特别是在食物或饲料中的几种毒素的协同作用。
与本发明的一个进一步方面相应地，本发明的饲料添加剂适合用于使饲料或动物消化道中的烟曲霉毒素B1、B2、B3和烟曲霉毒素衍生物，玉米赤霉烯酮，玉米赤霉烯醇(Zearalenol)，玉米赤霉烯酮-糖苷，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M1，脱氧瓜萎镰菌醇(DON)，T-2毒素，HT-2毒素，瓜萎镰菌醇，Monoacetoxyscirpenol，Diacetoxyscirpenol，木霉菌醇，疣孢菌素，Rorodin，乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇，异木霉菌素，羟基异木霉菌素，Calonectrin，T-2四醇，T-2三醇，脱乙酰基新茄病镰刀菌烯醇，新茄病镰刀菌烯醇，乙酰基新茄病镰刀菌烯醇，孢子丝菌醇(Sporotrichiol)，Trichotriol，接骨木镰菌醇和大镰刀孢菌素和/或赫曲毒素A、B、C、D失活。
在下面，将通过实施例更详细地说明本发明，其中，在实施例1中显示了烟曲霉毒素B1以恒定的毒素浓度在基本培养基中降解的时间过程，在实施例2中显示了烟曲霉毒素B1在不同毒素浓度的情况下的降解，在实施例3中显示了烟曲霉毒素B1在复合培养基中的降解，在实施例4中显示了烟曲霉毒素B1在食物和饲料中的降解，在实施例5中显示了使用本发明的微生物来降解赫曲毒素，和在实施例6中显示了使用本发明的微生物混合物而进行的喂养试验。
实施例1当毒素浓度为2mg/l的烟曲霉毒素B1时，基本培养基中的烟曲霉毒素B1的降解或解毒对于该试验，使用微生物DSM 16254和DSM 16257及用作对照的株系斯平尼弗外瓶柄霉(Exophiala spinifera)DSM 1217。
在所有情况中，在需氧条件下于25℃进行温育。在一般培养基中于存在50mg/l的烟曲霉毒素B1的情况下进行微生物的培养，以使得能够也许可能诱导解除烟曲霉毒素B1的毒性的酶。
从
图1中可见，在1小时的温育后，株系DSM 16254和DSM 16257已100％地转化了烟曲霉毒素B1，而对照酵母株系斯平尼弗外瓶柄霉在24小时的温育时间后仅能够转化将近41％的毒素。因此，本发明的微生物不仅能够在基本培养基中极快地解除烟曲霉毒素B1的毒性，而且该解毒作用可100％地发生。
图2显示，在相同的试验设置(即基本培养基和2mg/l的毒素浓度)下，株系DSM 16254、DSM 16256、DSM 16252、DSM 16257以及作为对照的酵母株系斯平尼弗外瓶柄霉DSM 1217随时间进程的转化。这些降解试验已清楚地显示，本发明的微生物极快地进行降解，且在许多情况下即在DSM 16254、DSM 16257、DSM 16252、DSM 16256的情况下甚至达到100％，这在使用对照微生物DSM 1217时是不可能的。
实施例2在不同毒素浓度情况下，烟曲霉毒素B1的降解用DSM 16254、DSM 16257和DSM 16256以及作为对照的酵母株系斯平尼弗外瓶柄霉DSM 1217进行该实验。所用的毒素浓度是2、10、50、100和500mg/l烟曲霉毒素B1。在需氧条件下于25℃进行温育。在温育这些体系5小时后显示结果，因为这样的温育时间是关于饲料中烟曲霉毒素的解毒的在实践上重要的时期。图3显示了该试验的结果。微生物DSM 16254能够在所有浓度范围内100％地降解烟曲霉毒素B1，微生物DSM 16257只能够在100mg/l烟曲霉毒素B1的浓度范围内达到96％的降解，DSM 16256能够在2mg/l的浓度时达到100％的降解，在10mg/l的浓度时达到超过50％的降解，在50mg/l和100mg/l的浓度时分别达到35％和25％的降解。与斯平尼弗外瓶柄霉DSM 1217的比较显示，在该微生物的情况下，特别是当毒素浓度极低时，存在极差的降解能力，在10mg/l时DSM 1217具有最佳活性，降解了大约30％的烟曲霉毒素B1。从该比较中表明，本发明的微生物在所有浓度范围内均优于DSM 1217，并且特别是在低毒素浓度的情况下100％的降解是可能的，迄今为止，这对于现有技术的微生物来说是不可能的。
实施例3在复合培养基中烟曲霉毒素B1的降解在该试验中研究了在高营养物浓度存在的情况下也在复合培养基中所述微生物解除烟曲霉毒素B1的毒性的能力。在复合培养基中进行微生物的培养，所述培养基包含5g/l的来自肉提取物的蛋白胨和3g/l的添加有两种不同浓度即10mg/l和100mg/l的烟曲霉毒素B1的肉提取物。通过在需氧条件下于25℃所进行的72小时温育的开始和结束时比较所述体系中的毒素浓度来确定转化率。在两种情况中，在培养基中存在10mg/l的烟曲霉毒素B1的情况下都获得了烟曲霉毒素B1的100％的解毒或100％的降解。此外，在存在100mg/l烟曲霉毒素B1的情况下，在两种情况中也都达到了100％的解毒。用该试验可以清楚地证明，本发明的微生物适合用于在复合培养基(即具有提高的营养物供给的培养基)中降解烟曲霉毒素。
实施例4在食物和饲料中烟曲霉毒素B1的降解再次使用微生物DSM 16254和DSM 16257以尝试降解在啤酒、玉米糁和小麦糁中毒素浓度为10mg/l的烟曲霉毒素B1。在培养所述微生物后，收获微生物，将其重悬浮于含有毒素的缓冲液中，随后立即与相应的食品或饲料一起进行温育。在所有情况下，烟曲霉毒素B1的降解率为100％，从而可以清楚地证明，本发明的微生物能够在饲料或食物中100％地降解烟曲霉毒素。
实施例5本发明的微生物对其他真菌毒素的降解在该情况下，将赫曲毒素A用作示例性的真菌毒素。使用株系DSM16254、DSM 16255、DSM 16256和DSM 16257。在需氧缓冲液中存在400μg/l赫曲毒素A的情况下进行赫曲毒素的降解，将其温育120小时。株系DSM 16255在2小时后已显示95％的解毒，在24小时后，株系DSM 16254和株系DSM 16255都已100％地解除了赫曲毒素A的毒性，在48小时后可以确定，对于DSM 16256也已达到90％的解毒，在120小时后，株系DSM 16257也已100％地解除了赫曲毒素A的毒性。
实施例6使用不同微生物的组合或混合培养物来使具有真菌毒素的食物或饲料完全解毒的喂养试验仔猪试验I在该试验中，将株系DSM 16254和DSM 14153用作添加剂。所述添加剂具有1×1012KBE/kg添加剂的总微生物数目。试验持续时间为42天。将动物分为4组，每组24只动物。对照组(KG)接受未受污染的无饲料添加剂的标准饲料。毒素组(TG)接受添加有500ppb赫曲毒素A、250ppb玉米赤霉烯酮和1,500ppb烟曲霉毒素B1的饲料。试验组1(VG1)和试验组2(VG2)各接受相同的添加有毒素的饲料，但试验组1具有0.5kg添加剂，试验组2具有1kg添加剂。在试验结束时，获得下列结果。
仔猪试验II在该试验中，将DSM 16254、DSM 11798和DSM 14153用作添加剂。所述添加剂具有2.5×1012KBE/kg添加剂的总微生物数目。试验持续时间为42天。将动物分为4组，每组19只动物。毒素组(TG)接受添加有1.1ppm脱氧瓜萎镰菌醇和2ppm烟曲霉毒素B1但不包含添加剂的饲料。试验组1(VG1)、试验组2(VG2)和试验组3(VG3)各接受相同的添加有毒素的饲料，但试验组1具有0.5kg添加剂，试验组2具有1kg添加剂，试验组3具有2kg添加剂。在试验结束时，获得下列结果。
仔猪试验III在该试验中，将株系DSM 16254用作添加剂。所述添加剂具有1×1011KBE/kg添加剂的总微生物数目。试验持续时间为42天。将动物分为2组，每组30只动物。毒素组(TG)接受添加有4.5ppm烟曲霉毒素B1的饲料。试验组接受相同的添加有毒素的饲料，但具有0.5kg添加剂。在试验结束时，获得下列结果。
雏鸡(Broiler)试验I在该试验中，将株系DSM 16254用作添加剂。所述添加剂具有2.5×1011KBE/kg添加剂的总微生物数目。将动物分为2组，每组140,000只动物。毒素组(TG)接受添加有300ppb黄曲霉毒素和2ppm烟曲霉毒素的饲料。试验组接受相同的添加有毒素的饲料，但具有1kg添加剂/吨饲料。在试验结束时，获得下列结果。
雏鸡试验II在该实验中，将株系DSM 16254和DSM 11798用作添加剂。所述添加剂具有4×1011KBE/kg添加剂的总微生物数目。将动物分为3组，每组260只动物。对照组接受未受污染的饲料。毒素组(TG)接受添加有3.5ppm烟曲霉毒素和1.8ppm T-2毒素的饲料。试验组接受相同的添加有毒素的饲料，但具有1kg添加剂/吨饲料。在试验结束时，获得下列结果。
PCT申请PCT/AT2005/00453的附件申请人Erber Aktiengesellschaft等人根据专利合作条约实施细则第13条之二第4款的列表所有在本PCT申请PCT/AT2005/00453中提到的微生物都保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(德意志微生物保藏中心)，Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Deutschland(DE)。
权利要求
1.用于解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，其中使用在单步骤或多步骤反应中将烟曲霉毒素酶促转化成脱氨基代谢物的具有解除毒性作用的细菌或酵母，所述细菌或酵母选自可归类于鞘氨醇单胞菌科这一分类单位的株系DSM 16254和DSM 15257、可归类于根瘤菌目这一分类单位的株系DSM 16255、可归类于微杆菌科这一分类单位的株系DSM 16256、可归类于根瘤菌科这一分类单位的株系DSM16253、可归类于产碱菌科这一分类单位的株系DSM 16252和毕赤酵母属物种DSM 16562。
2.权利要求1的微生物，其特征在于，以粉末、液体或凝胶的形式来稳定所述细菌或酵母。
3.权利要求1或2的微生物，其特征在于，以无细胞提取物或粗提取物的形式使用所述细菌或酵母。
4.权利要求1、2或3的微生物，其特征在于，所述细菌或酵母除了解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性之外，还解除至少一种选自玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素或赭曲毒素的其他真菌毒素的毒性。
5.细菌或酵母以单独或者两种或更多种株系相组合的形式在解除食物和/或饲料中的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，所述细菌或酵母选自可归类于鞘氨醇单胞菌科这一分类单位的株系DSM16254和DSM 15257、可归类于根瘤菌目这一分类单位的株系DSM 16255、可归类于微杆菌科这一分类单位的株系DSM 16256、可归类于根瘤菌科这一分类单位的株系DSM 16253、可归类于产碱菌科这一分类单位的株系DSM 16252和毕赤酵母属物种DSM 16562。
6.权利要求5的用途，其特征在于，所述细菌或酵母另外还用于解除至少一种选自玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素或赭曲毒素的其他真菌毒素的毒性。
7.权利要求5或6的用途，其特征在于，使用细菌和/或酵母的混合培养物来解除真菌毒素的毒性。
8.权利要求5、6或7的用途，所述用途为用于对低浓度的真菌毒素，特别是100μg/kg至500mg/kg，优选地250μg/kg至25mg/kg的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物，10μg/kg至10mg/kg，优选地40μg/kg至2mg/kg的玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物，1μg/kg至2mg/kg，优选地10μg/kg至750μg/kg的黄曲霉毒素，1μg/kg至2mg/kg，优选地5μg/kg至500μg/kg的赭曲毒素，进行解毒。
9.权利要求5至8中任一项的用途，其特征在于，使用额外地包含至少一种其他细菌或酵母的组合或混合培养物来解除真菌毒素，特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、单端孢菌毒素和/或黄曲霉毒素的毒性，来解除共同出现的真菌毒素，特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、黄曲霉毒素或赭曲毒素的毒性，所述其他细菌或酵母选自鞘氨醇单胞菌属物种DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168、寡养单胞菌属物种DSM14169、Ralstonia eutropha DSM 14171、真杆菌属物种DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153、隐球酵母属物种DSM14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性丝孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真杆菌DSM 11798。
10.使用权利要求1至4中任一项的微生物来解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的方法，其包括以103/g饲料至108/g饲料，特别是2×104/g饲料至5×106/g饲料的微生物数目，在单步骤或多步骤反应中将饲料中的烟曲霉毒素酶促转化成脱氨基代谢物。
11.权利要求10的方法，其特征在于，在基本培养基中或在具有过量营养物供给和碳源的复杂环境中，在含水的条件下进行所述解毒过程。
12.权利要求10或11的方法，其特征在于，在15分钟至12小时内，特别是在15分钟至2小时内进行所述解毒过程。
13.权利要求10、11或12的方法，其特征在于，将至少一种选自玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素或赭曲毒素的其他真菌毒素转化成无毒的降解产物。
14.权利要求10至13中任一项的方法，其特征在于，使用额外地包含至少一种其他细菌或酵母的组合或混合培养物来解除真菌毒素，特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、单端孢菌毒素和/或黄曲霉毒素的毒性，所述其他细菌或酵母选自鞘氨醇单胞菌属物种DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168、寡养单胞菌属物种DSM14169、Ralstonia eutropha DSM 14171、真杆菌属物种DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153、隐球酵母属物种DSM14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性丝孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真杆菌DSM 11798。
15.权利要求10至13中任一项的方法，其特征在于，为了使食物和/或饲料解毒，将所述微生物各以0.01重量％至1.5重量％，特别是0.05重量％至0.7重量％的量与所述食物和/或饲料混合。
16.用于使真菌毒素特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物失活的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂以2×108/kg饲料添加剂至2×1015/kg饲料添加剂，特别是1×109/kg饲料添加剂至5×1012/kg饲料添加剂的微生物数目包含权利要求1至4中任一项的微生物。
17.权利要求16的饲料添加剂，其特征在于，其额外地包含至少一种其他细菌或酵母以解除真菌毒素特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、单端孢菌毒素和/或黄曲霉毒素的毒性，所述其他细菌或酵母选自鞘氨醇单胞菌属物种DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM14168、寡养单胞菌属物种DSM 14169、Ralstonia eutropha DSM 14171、真杆菌属物种DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153、隐球酵母属物种DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性丝孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真杆菌DSM11798。
18.权利要求16或17的饲料添加剂的用途，所述用途为用于使饲料或动物消化道中的烟曲霉毒素B1、B2、B3和烟曲霉毒素衍生物，玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮衍生物，玉米赤霉烯醇，玉米赤霉烯酮-糖苷，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M1，脱氧瓜萎镰菌醇(DON)，T-2毒素，HT-2毒素，瓜萎镰菌醇，Monoacetoxyscirpenol，Diacetoxyscirpenol，木霉菌醇，疣孢菌素，Rorodin，乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇，异木霉菌素，羟基异木霉菌素，Calonectrin，T-2四醇，T-2三醇，脱乙酰基新茄病镰刀菌烯醇，新茄病镰刀菌烯醇，乙酰基新茄病镰刀菌烯醇，孢子丝菌醇，Trichotriol，接骨木镰菌醇和大镰刀孢菌素和/或赫曲毒素A、B、C、D失活。
全文摘要
本发明涉及用于解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，以及细菌或酵母以单独或者两种或更多种株系相组合的形式在解除食物和/或饲料中的烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，还涉及使用微生物来解除烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物的毒性的方法，以及用于使真菌毒素特别是烟曲霉毒素和烟曲霉毒素衍生物失活的饲料添加剂。
文档编号A23L1/015GK101056541SQ200580039126
公开日2007年10月17日 申请日期2005年11月15日 优先权日2004年11月16日
发明者G·沙特兹玛瑞, M·陶贝尔, E·维克鲁, E-M·班德 申请人:爱尔伯股份公司