专利名称：：具有降低的后酸化作用的ami-缺陷型嗜热链球菌菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及食品工业中应用的乳酸菌的领域。更准确地，本发明涉及嗜热链球菌(5^印加c^cc"s幼erw印/^7附)的天然菌林或这种菌林的天然变体，所述菌林或变体是具有降低的后酸化作用的AMI缺陷型。本发明还涉及所述菌抹在制备发酵的食品中的用途以及由此制备的发酵的食品。
背景技术：
：对用于生产食品，尤其是生产发酵的乳制品的乳酸菌的选择需要很多标准，包括酸化活性和负责产品感官特性的芳香化合物的形成，以及在质地和乳脂状中发挥作用的增稠剂的产生。酸化活性基本上通过三个参数表征(i)酸化动力学；(ii)可滴定酸度或影响产品感官特性和它的存储适用性的最终发酵pH;和(m)在产品存储期间发展的后酸化。高酸化率使缩短制备物对污染物敏感的期间变成可能并且由此降低细菌污染的风险。增加的酸化率还通过增加工业材料的生产率和适应性而改善了生产过程的经济效益。菌林的后酸化特性对于产品的存储是特别重要的。新鲜发酵的产品通常在4iC到8"C的温度下存储4周时间。虽然细菌的代谢活性由于冷藏而被降低，但是它没有被阻断。这种剩余的活性致使从乳糖产生乳酸并且导致pH降低和酸味的增加，其降低了产品的感官特性。此外，除保持它们有助于产品质量的标准之外，菌林的选择涉及另外更加特定关联的要素，例如发酵温度、酸化率和对噬菌体的抗性。为了降低生产期间的噬菌体事件，对噬菌体的抗性在菌林的选择中是非常重要的标准，因为在实施消除污染的同时，这些事件可能阻断整个生产过程不同的时间。法国专利FR2725212描述了一种以1-1477号保存在国家微生物菌种保藏中心(CNCM，法国巴黎巴斯德研究所)的嗜热链球菌，其具有允许高度酸性的快速的酸化动力学并且其在存储新鲜发酵的乳制品期间没有后酸化作用。在法国专利FR2771600中描述了另一种嗜热链球菌(在1994年12月30日以1-1520号在CNCM登记),其同样具有降低的后酸化能力。尽管如此，应用这样的菌林来制造功能性食品(即对生物体中一种或多种目标功能具有有益作用的食品)、尤其是那些包含基于蛋白质和/或肽的生物活性的感兴趣的食物成分是没有优势的。这些菌林仍能代谢(换句话说，被分解用作氮源)包括我们明显希望保留的感兴趣的功能性蛋白质和/或肽在内的蛋白质和/或肽。这是为什么对于食品工业而言(i)具有极佳的生存力；(ii)非常低的或实际上不存在的后酸化活性；和(iii)非常低的代谢蛋白质和/或肽的能力的可利用发酵细菌的重要性。当开发其中掺入微生物、更具体说是活的微生物的用于人和/或动物的食物时，食品工业也必须考虑到第四方面的限制。经遗传修饰(GMO或突变体)的生物体(在此情形下是微生物)通常引起消费者的注意和担心。通常GMO所遭遇的负面印象意味着公众趋向于抵制含有GMO的食物。因此，倘若消费者总是希望了解越来越多有关出售食品的内容物和这些产品中成分的来源，那么制造商最好提供无GMO的产品。因此，对于含有微生物的工业生产的食品而言，只使用天然菌林或天然菌林天然变体进行制备是必要的。
发明内容准确地针对上述各个限制，本发明通过提出应用嗜热链球菌的天然菌林或该菌林的天然变体作出了应答，所述菌林或变体是具有降低的后酸化作用的AMI缺陷型。嗜热链球菌在乳中的生长能够被分为3个生长阶段画不依赖于乳的絲白的第一指数生长阶段；-第二所谓的过渡生长阶段；和-第三指数生长阶段，其确定的受限于肽的转运(LetortW2002)。在嗜热链球菌中的寡肽转运系统是由四种蛋白质(AmiC、AmiD、AmiE和AmiF)和三种高度相似的结合蛋白质(AmiAl、AmiA2和AmiA3)的易位子组成的ABC转运蛋白(ATP结合盒)。其中的寡肽转运系统被改变的突变体在乳中的生长不是最理想的，这证明了该转运系统的重要性(GaraultC2002)。在本发明的范围内，本申请人已经首次发现其中的寡肽转运系统至少部分改变的嗜热链球菌的天然菌林及其天然变体。本申请人还表明所述菌林和变体具有尤其令人感兴趣的乳酸化特性。在一方面，对于AMI缺陷型变体而言，发酵终点时pH变得稳定。事实上，在乳中的第一生长阶段没有受到影响并且这些变体能够保持相对快速的第一酸化阶段，同时具有更加减慢的第二酸化阶段。它们能够表现出的酸化曲线，在较高pH条件下明显比在同样条件下减慢的由AMI功能野生型菌林引起的酸化作用慢很多。这种发酵温度下的"酸化平台"是人们感兴趣的，因为它允许发酵的物质在发酵温度保存更长的时间并且基本没有酸化作用。对于给定尺寸发酵桶的去凝结时间(de-clottingtimes)是相当长的。因此应用AMI缺陷型变体使得在倾析(decantation)(用冷却或直接包装进行去凝结)过程中有可能限制发酵的乳中pH变化。在另一方面，酸化作用被极大减慢的pH临界值取决于游离氨基酸和能够由AMI系统转运并存在于乳中的二-/三-肽的量。因此能够控制pH以便于通过改变乳的肽含量(定性和定量)来停止发酵。本发明因此涵盖具有降低的后酸化作用的AMI缺陷型嗜热链球菌的天然菌林和其具有相似的乳-酸化特征的天然AMI缺陷型变体，以及它们的生物学纯培养物和培养级分。在本发明的背景下，"AMI缺陷型天然菌株"或"AMI缺陷型天然变体"指的是其生长受游离氨基酸混合物刺激但不受到只由寡肽构成的混合物刺激的菌林或变体。术语"具有相似的乳-酸化特征的天然AMI缺陷型变体"指的是以参照天然菌林开始经遗传修饰获得的菌株，同时获得的菌林与参照菌林相同，具有降低了的后酸化作用。在本上下文中，术语"变体"和"天然变体"被用来指定主要通过对参照菌林进行突变和选择获得的菌林，然而术语"突变体"更加具体的用来指定通过定向诱变技术，即使用施加于参照菌林的栽体的基因转化技术获得的菌林。根据一个实施方案，所述天然菌林和/或天然变体对由AMI寡肽转运系统转运的有毒寡肽类似物具有抗性。具体而言，所述有毒类似物能够选自氨基蝶呤、三鸟氨酸(triornithine)和三赖氨酸。该类似物优选氨基蝶呤。术语"对氨基蝶呤的抗性"被规定为在用100nl饱和细菌悬液接种的平皿中在浸有200pg氨基蝶呤的纸盘存在的情况下所观察到的抑菌直径小于或等于约2cm，优选小于或等于约1.8cm。本领域的技术人员根据他的常识对于有关由AMI系统转运的另外的寡肽有毒类似物的所述规定会作出必要的变化。因此，本领域的技术人员也能够以适当的方式和作为所怀疑有毒类似物的函数改变抑菌直径的最大值。优选的，根据本发明的菌林是选自以下的菌林誦在2004年5月10日以1-3211号在CNCM登记保藏的菌林；-在2004年9月16日以1-3301号在CNCM登记保藏的菌林；-在2004年9月16日以1-3302号在CNCM登记保藏的菌林；-在2002年1月24日以1-2774号在CNCM登记保藏的菌林。作为在本发明的背景下感兴趣的并由以下实施例所证明的具有酸化特性的实例，我们指出AMI缺陷型菌林1-3302(2004年9月16日登记保藏于CNCM的AMI功能性母本菌林1-3299的变体)使得可能在培养终点时的pH和保存期终点时产品的pH之间获得0.29的pH变化，而AMI功能性母本菌林1-3299在这两个时间之间引起的0.56pH变化。在此情况中，应用AMI缺陷型菌林而不是AMI功能性菌林的优势由此在于，在培养终点时和产品保存期终点时pH变化降低0.27。如上所述，AMI缺陷型变体从参照母本菌林获得。因此在本发明的范围内，这指的是作为酸化特性的函数例如通过突变和选择获得的天然突变体。应用于此的技术是公知的，诸如允许调节酸化特性的检测(即SphmierH.E.，CorrieuG.，1989)。与AMI功能性母本菌林(参考下面的试验部分)的天然AMI缺陷型变体的菌株1-3211、1-3301和1-3302相反，本申请人已经分离并鉴定菌林1-2774是天然的AMI缺陷型。根据本发明的菌林在发酵食品的制备中是尤其令人感兴趣的。优选地，所述发酵食品是乳制品或植物性产品。根据本发明，术语"乳制品"指的是，除了乳之外，源于乳的产品比如奶油、水洪'淋、黄油、奶酪和酸奶，以及二级产品比如抗乳血清和酪蛋白以及任何含有乳或乳组分作为主要成分(例如配方奶)的预制食物。术语"植物性产品(vegetableproduct)"表示其中有获得自植物基本成分比如果汁和包括豆汁、燕麦汁和稻米汁在内的蔬菜汁的产品。此外，上述有关乳制品和植物性产品的定义各自都涵盖任何基于乳制品和植物性产品混合物的产品，例如乳和果汁的混合物。因此，本发明还涉及制备发酵食品的方法，其中用至少一种活的菌林比如上述的菌种发酵底物。该方法的益处在于，期望应用一种或多种例如上述的细菌菌林，主要使用至少一种另外的活细菌菌抹。有益地是，所述另外的细菌菌林是乳酸菌菌林比如链球菌属(5^印toaccwsspp.);乳杆菌属，即保加利亚乳杆菌(丄.^"/gflWc"s)、嗜酸乳杆菌(Z.fl"Vfe/;/h7MS)和干酪乳杆菌(丄.c"se/);乳球菌属(丄fl"(occ"s1spp.)和双歧杆菌属(Jiydo办flcfd7V/附spp.)。优选地，用于上述方法的底物选自乳类底物，即乳，或基于植物性原料成分比如水果、谷物和豆的底物。因此，能够应用以下的底物-如果底物是乳类的一种，天然的或复原乳、脱脂的或没有脱脂的、或基于乳类源的介质或制品的乳；和-如果底物是基于植物性原料成分、果汁和/或蔬菜汁。所述底物还能够有益地包含目前在制备发酵产品的食品加工工业中使用的成分，即基于乳的甜品，尤其是固体成分比如水果、燕麦或谷物，还包括其它变甜的液体或含巧克力的产品。本发明还涉及在贮藏期间保持了其感官特性的发酵食品。术语"在贮藏期间保持了感官特性"表示在时间的进程中，至少是直到产品的有效期截止日期(ED)并且有利地是超过了那个日期，产品的感官特性没有改变。根据一个实施方案，所述产品包含至少一种根据本发明的活的菌根据另一个实施方案，根据本发明的发酵食品能够依据上述方法获得。优选地，根据本发明的发酵食品包含至少一种生物活性成分(或功能性食物成分)，尤其是选自蛋白质、肽和它们的类似物或衍生物。术语"生物活性或功能性食物成分"指的是不依赖于它的营养作用，而有利地影响生物体中一种或多种目标功能的成分。因此该成分的作用可以改善摄入正常量所述成分的消费者的健康和/或舒适和/或降低疾病发生的风险。该定义能够被扩及包含所述成分的食品或产品，由此以后所述食品说明书第7/22页或产品自身变得具有生物活性或功能性。术语"类似物"指的是初始化合物的任何经改变的形式，在此情况中所述初始化合物是蛋白质或肽，所述经改变的形式可能是天然的或合成的，其中一个或多个原子，比如碳、氢、氧原子或杂原子比如氮、硫除，从而获得新的分子化合物。在本发明的背景下"衍生物"是具有与参照化合物(蛋白质或肽)共同的相似性或结构基序的化合物。一方面，该定义还涵盖单独地或与其它化合物缀合可以是用一个或多个化学反应合成参照化合物的过程中作为前体或中间体的化合物，另一方面，该定义同样涵盖能够从所述参照化合物单独地或与其它化合物经由一个或多个化学反应形成的化合物。术语"衍生物"因此至少包含水解产物，即蛋白质和/或肽的胰蛋白酶消化产物，和水解产物组分，以及水解产物和/或水解产物组分的混合物。在能够用于根据本发明的发酵食品中的生物活性食物成分中，以下的成分能够被引用作为非限制性实例酪蛋白0151的肽91-100(见欧洲专利EP0714910)、肽C6-asU94-199(见美国专利US6514941)、肽C7國pi77-183(见美国专利US6514941)、肽C12-asl23-34(见美国专利US6514941)、酪蛋白磷酸肽、a-酪吗啡肽(a陽casomorphins)、酪蛋白a外啡肽(exorphin)、酪激肽、p-酪吗啡肽、酪蛋白巨肽(CMP)和糖巨肽(GMP)、酪新素(casoxin)、casoplatellins、片段50-53、卩-乳吗啡样肽、乳铁蛋白、肽Val-Pro-Pro(见欧洲专利EP0583074)、Lys-Val-Leu-Pro-Val國Pro-Gln(见申请EP07376卯)、Tyr-Lys-Val-Pro誦Gln-Leu(见申请EP0737690)、Tyr-Pro(见申请EP1302207和专利EP0821968)、Ile-Pro-Pro(见Nakamura""/"1995和日本专利JP6197786)，它们的片段、类似物、衍生物，含有它们和它们的组合的蛋白质和/或肽(有关论述参见DanoneWorldNewsletternumber17datedSeptember1998)。下面的表1列出了人乳和牛乳蛋白的水解作用释放的主要功能性肽。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(*)氨基酸序列不是完全相同。(**)H:人乳-C:牛乳下面的表2列出了源于乳的和当前已知的功能性肽的主要生理活性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>:3表2(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>有利地是，根据本发明的食品是功能性食品。如上简述，术语"功能性食品"指的是不依赖于它的营养性作用，而在生物体中有利地影响一种或多种目标功能的食品。因此它能够导致摄取正常量所述产品的消费者的健康和/或舒适得到改善和/或降低疾病发生的风险。作为"功能性食品"作用的实例，我们能列举以下作用抗癌、免疫刺激、促进骨健康、抗压、安眠镇静、抗高血压、改善钙的生物利用度和抗微生物的作用。这样的功能性食品能够用于人和/或动物。根据一个实施方案，本发明涵盖的食品是新鲜的产品。根据另一个实施方案，本发明涵盖的食品特别选自饮料、酸奶、奶油甜品、发酵的乳或汁液。本发明菌林的纯的或与另外的菌林结合的培养物也能够在人或动物的食品中以益生菌的形式应用或者甚至作为乳酸发酵剂应用，例如在上述的过程中。此外，本发明还涉及具有降低的后酸化作用的AMI缺陷型嗜热链球菌的至少一种天然菌林和/或也具有降低的后酸化作用的AMI缺陷型嗜热链球菌的几种天然变体和/或它们的生物学纯培养物和培养物组分在制备贮藏期间保持了它们的感官特性的发酵食品中的应用。本发明通过以下附图进行举例说明國图1:AMI功能性母本菌林1-3299和AMI缺陷型菌林1-3301的酸化作用动力学的图。乳没有酪蛋白水解产物的乳；乳+N30.2g/L;向每升乳中加入0.2g成分N3(ref.211693，Difco，USA)的乳。-图2:AMI功能性母本菌林1-3299和AMI缺陷型菌林1-3302的酸化作用动力学的图。乳没有酪蛋白水解产物的乳；乳+N30.2g/L;向每升乳中加入0.2g成分N3的乳。-图3:AMI缺陷型菌林1-3301在存在不定量N3的情况下酸化作用动力学的图。乳没有酪蛋白水解产物的乳；乳+0.05N3:向每升乳中加入0.05g成分N3的乳；乳+0.1N3:向每升乳中加入0.1g成分N3的乳；乳+0.2N3:向每升乳中加入0.2g成分N3的乳；乳+0.4N3:向每升乳中加入0.4g成分N3的乳；乳+0.8N3:向每升乳中加入0.8g成分N3的乳。画图4:AMI缺陷型菌林1-3302在存在不定量N3的情况下酸化作用动力学的图。乳没有酪蛋白水解产物的乳；乳+0.05N3:向每升乳中加入0.05g成分N3的乳；乳+0.1N3:向每升乳中加入0.1g成分N3的乳；乳+0.2N3:向每升乳中加入0.2g成分N3的乳；乳+0.4N3:向每升乳中加入0.4g成分N3的乳；乳+0.8N3:向每升乳中加入0.8g成分N3的乳。-图5:AMI功能性母本菌林1-1630(在1995年10月24日登记保藏于CNCM)和AMI缺陷型菌林1-3211在添加氨基酸之后，乳发酵的酸化作用动力学的图。没有另外细节的菌林名乳发酵；菌林名+aa:通过加入20氨基酸(相当于适于嗜热链球菌的合成培养基所规定量的1/40)来实施的发酵(Letort"W.，2001)。-a^一通过向乳中加入成分N3所得的动力学的图。-M^i—用多种成分混合物获得的酸化作用动力学的图。具体实施例方式通过阅读在下面试验部分中所给出的并只用于例证目的的实施例，本发明另外的特征和优势将变得显而易见。试验部分I.材料和方法1.1.获取AMI缺陷型变体a)评估嗜热链球菌中针对^J^呤抗性的生物多样性首先，检验嗜热链球菌菌林对^J^蝶呤的敏感性。为此，将200吗的JtJ^蝶呤沉积在培养皿中的盘片Uisc)上，该培养脏包含其上沉积有100nL细菌悬液的Elliker培养基。如果菌林是敏感的，在过夜培养后抑菌直径将显现在盘片周围。选##本菌林1-1630(在1995年10月24日登记保藏于CNCM)和1-3299(在2004年9月16日登记包藏于CNCM)，因为它们具有令人感兴趣的结构特性。菌林1-1630没有壁蛋白酶(wallprotease),然而菌林1-3299具有。这两种菌林因此具有非常不同的生长特征。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>依赖于所研究的菌林观测到不同的敏感性。在表3中，AMI缺陷型变体在阴影格中以粗体形式给出，在此必要的给出了它们各自的母本菌林。与相应的母本菌林相比，变体对于氨基蝶呤的抗性较大。由于它在AMI转运系统中的缺陷，野生型菌林1-2774显示出对于氨基蝶呤的天然抗性。b)获取AMI缺陷型变体应用有毒肽类似物选择关于肽转运的缺陷型变体的方案已经被描述过(HigginsandGibson,1986)。简单地说，将0至200jig/mL的氨基蝶呤掺入适于嗜热链球菌生长的并含有20游离M酸作为氮源的化学限定培养基(MCDaa)中。用在MCDaa中制成的预培养物以1%的量接种在此范围内的所有试管。在37C培养3天后，应用每个培养试管中的100nL培养物在Elliker琼脂培养基上制备细菌毯^A盖物。将其上沉积有200將M蝶呤的盘片置于平皿的中央。该平皿随后在371C的厌氧条件下培养3天。随后在抑菌区中观察到有集落出现，移去约20个集落并用来接种5mL的Elliker培养基。集落在此培养基中分裂并且在37匸培养16小时后形成细菌悬浮物。这导致在沉积有吸收了200jig^J^呤的盘片的Elliker培养基的表面形成毯状物。随后通过在乳中的发酵来检验所获得的所有集落。酸化作用动力学提供了关于这些变体的乳-酸化能力的信息。1.2.乳的制备用120g的脱脂奶粉在930mL的水中重新构成乳。在30分钟水化作用后，将乳在95"C巴氏消毒30分钟。成分N3以10%水溶液的形式添加，随后通过0.22nm过滤进行消毒。在巴氏消毒前向乳中添加另外的检验成分。在水中配制氨基酸溶液，随后通过0.22nm过滤消毒。1.3.制备用于接下来酸化的发酵剂通过用酵母自溶产物以1%的量接种消过毒的乳并在42t:培育18小时来制备预培养物。接下来，通过在42X:培育lOOmL含有自溶产物的消过毒的乳，并当酸度达到80。D时通过置于冰水中来停止的方法制备所述发酵剂。该发酵剂在4X:保存直到开始接下来的酸化作用。为了启动接下来的酸化作用，以1。/。的量用嗜热链球菌发酵剂接种250mL的乳。1.4.材料N3:蛋白酶胨N。3,ref.R211693,Difco,USA(含有肽和主要为游离氨基酸的酪蛋白水解产物)。奶粉Milex240，AriaFoodIngredients.酵母自溶产物酵母提取物，ref.AEB171109，AESLaboratories.用于接下来酸化作用的CINAC:由G,Corrieu,LGMPA，YSEBAERTbrand开发的用于酸化活性测量的自动系统。Alaco7014:抗乳血清蛋白质7jC解产物，NZMPGmbh,SiemensStrasse，6-14D-25463,Rellingen,Germany.MPH955:酪蛋白水解产物，NZMPGmbh，SiemensStrasse,6-14D-25463,Rellingen，Germany.DSE6441:抗乳血清蛋白质水解产物，NZMPGmbh,SiemensStrasse，6-14D-25463,Rellingen,Germany.MPH917:酪蛋白7K解产物，NZMPGmbh,SiemensStrasse,6-14D-25463,Rellingen,Germany.WPH926:抗乳血清蛋白质水解产物，NZMPGmbh,SiemensStrasse，6-14D-25463,Rellingen,Germany.MPH948:酪蛋白水解产物，NZMPGmbh，SiemensStrasse，6-14D-25463,Rellingen,Germany.C12:乳蛋白水解产物，DMVInternationalNCBLaan80，POBOX135460,BaZeghel，Netherlands.MPH910:酪蛋白水解产物，NZMPGmbh，SiemensStrasse,6-14D-25463,Rellingen,Germany.II.结果II丄在有或没有成分N3存在的情况下AMI功能性母本菌抹1-3299和衍生的AMI缺陷型菌抹的酸化动力学能够从图1和2看到AMI功能性母本菌林1-3299在乳中存在或缺少成分N3的情况下具有相同的动力学。另一方面，AMI缺陷型菌林具有不同的动力学。II.2AMI缺陷型菌株1-3301关于不定量成分N3的酸化动力学菌林1-3301在存在成分N3的情况下显示出具有较短潜伏期的动力学。另外，培养基中存有的成分N3越多，在发酵终点时的pH越高。11.3.AMI缺陷型菌抹1-3302关于不定量成分N3的酸化动力学在培养基中存有的成分N3越多，酸化动力学越快。另外，在培养基中存有的成分N3越多，在发酵终点时的pH越低。11.4.纯菌株(与母本菌抹1-3299相比)的后酸化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>AMI缺陷型菌林使得在培养终点时的pH和产品保存期终点时产品的pH之间可能具有0.29的pH差异(8)，然而母本菌林引起的5pH有0.56。应用AMI缺陷型菌林的益处在于，如果我们在这些条件下比较5pH会得到0.27个单位的pH。11.5.利用AMI功能性母本菌株1-1630(在1995年10月24日登记保藏于CNCM)和衍生的AMI缺陷型菌抹1-3211在加入氨基酸后的乳的发酵获得的酸化动力学由于向乳中加入游离氨基酸所产生的刺激对于母本菌林和AMI缺陷型菌林而言是相同的。在游离氨基酸作为唯一可用氮源范围内对于在这些条件下的两种菌株而言该结果是符合逻辑的。11.6.以乳+成分N3的方式获得的动力学AMI功能性母本菌林1-1630(在1995年10月24日登记保藏于CNCM)明显受到由于向乳中加入成分N3的刺激，然而衍生的AMI缺陷型菌林确没有。母本菌林能够利用N3肽的水解产物，但是AMI缺陷型菌林不能。II.7.AMI缺陷型菌株依照不同成分的酸化动力学MPH955和WPH926的水解产物导致在乳中对AMI缺陷型菌林发酵较好的刺激。它们也是含有最高小肽和游离M酸含量的两种水解产物。参考文献Garault，P,,efa/.,(2002)JournalofBiologicalChemistry277:32-39Letort甜a/.,(2001)丄Appl.Microbiol.91:1023-1029Letort，C.,efa/.,(2002)AppliedandEnvironmentalMicrobiology68:3162-3165SpinnierH.E.,a/.AutomaticmethodtoquantifystarteractivitybasedonpHmeasurement"丄ofDairyResearch,56(1989)755-764);deRois幼rtH.etLuquetF.M.EditionLorica旧BN:2-9507477-0-1Kaysera/"(1996)FEBSLetters383,18-20HataY.甜a/.,(1996)Am.丄Clin.Nutr.64，767-71NakamuraY.甜a/.,(1995)丄DairySci.78，1253-7Migliore-SamourD.甜s/"(1988)Experimentia44，188-93DefilippiC.efa/.,(1995)Nutr.11,7514Tom§D.甜a/.，(1987)Am.丄Physiol.253，G737-44Tom6D.甜a/.,(1988)Reprad.Nutri.D会velop.28,90918BenMansourA.e/s/.，(1988)Pediatr.Res.24，751-5Mah6S.甜a/.，(1989)R印rod.Nutri.D6velop.29，725~32SchusdziarraV.efa/.,(1983)Diabetologia24，113~6YvonM.efa/.，(1994)Reprad.Nutri.D6velop.34,527-37ZuchtH.D.,efa/,,(1995)FEBSLetters372,185-8TomitaM.甜a/"(1994)ActaPaed.Jap.36，585-91LahovE.a/.,(1996)FoodChem.Toxic.34,131-145Migliore-SamourD.a/.,(1989)Int.DairyRes.56，357-62Jo胎sP.甜a/.,(1986)Europ.丄Biochem.158，379-82RahaS.etal.，(1988)Blood772，172~8ChabanceB.efa/.，(1995)Brit.丄Nut.73，582-90KohmuraM.efa/.，(1989)Agric.Biol.Chem.53,2107-14MasudaO.ef3/.，(1996)丄Nutr.126,3063-8YamamotoN.a/"(1994)Biosci-Biotech.Btoch抓.58，776-8ErmischA.s/"(1983)丄Neuroch抓.41，1229UmbachM.efa/.,(1985)R印ul.P叩t.12，22&30SinghM.，etal"(1989)Pediatr.Res.26,34-8Svedberg丄etal.，(1985)Peptides6，825>30TeschemacherH.,a/.，(1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