包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方的制作方法

专利名称：：包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有hGH多肽的稳定人生长激素(hGH)配方，所述多肽包含与聚(乙二醇)(PEG)共价连接的非天然氨基酸。
背景技术：
：人生长激素参与许多有关正常人类生长和发育的调控。这一天然产生的单链垂体激素是由191个氨基酸残基组成，并且具有约22kDa的分子量。hGH展现出多种生物作用，包括线性生长(体质形成)、泌乳、巨噬细胞活化和类胰岛素作用与致糖尿病作用等(Chawla,R.等人，34:519-547(1983);Isaksson,O.等人'^"".Zev.47:483-499(1985);Hughes,J.和Friesen,H.,爿朋.P/ywo/.，47:469-482(1985))。众所周知hGH的结构(Goeddel,D.等人,淑騰281:544-548(1979))，并且hGH的三维结构已通过X射线晶体学解释(deVos,A.等人，Sc/ewce255:306-312(1992))。所述蛋白质具有致密的球状结构，包含通过环连接的四个两亲a螺旋束，从N末端起始称为A-D。关于hGH(包括其受体和变异体)和其他GH总科成员的进一步论述提供于标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专禾U申请案第11/046,432号禾口标题为"ModifiedHumanFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses，，的PCT国际专利申请案第PCT/US05/03537号中，所述专利都是以其全文引用的方式并入本文中。重组体hGH可作治疗用，并且已批准用于治疗多种适应症。举例而言，hGH缺乏将引起侏儒症，十多年来，已通过外部投与所述激素成功地治疗所述病症。除hGH缺乏夕卜，也已批准将hGH用于治疗肾衰竭(儿童肾衰竭)、特纳氏综合症(Turner'sSyndrome)和AIDS患者的恶病质。近来，美国食品和药品监督局(FoodandDrugAdministration,FDA)已批准将hGH用于治疗非GH依赖性身材矮小。目甜，也正在对hGH治疗衰老、老年人虚弱、短肠综合症和充血性心力衰竭进行研究。hGH治疗的目标群体包括患有特发性身材矮小(ISS)的儿童和具有类GHD症状的成年人。目前，重组hGH当今是作为可每日注射的产品销售，且当今市场上的五种主要产品为HumatropeTM(EliLilly&Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)禾[]Saizen/SerostimTM(Serono)。然而，使用生长激素作为治疗剂的主要问题在于，所述蛋白质在活体内具有短半衰期，且因此必须通过每日皮下注射投药来使其发挥最大效用(MacGillivray等人，J.C"w.五"心cn'"o/.Afe^^.81:1806-1809(1996))。相当多的成就集中在通过降低制造成本、使得更易于向患者投药、改良功效和安全性概况和引起将提供竞争优势的其他特性來改良投与hGH激动剂和拮抗剂的方式。举例而言，Genentech和AlkermesNutropin曾在市场上销售Depot,即一种适用于儿科生长激素缺乏的储槽式hGH配方。尽管所述储槽允许较不频繁地投药(每2-3周一次而非每日一次)，但也伴有不合需要的副作用，诸如降低的生物利用度和注射部位疼痛，且因此已于2004年退出市场。另一种产品Pegvisomant(Pfizer)也已于近期获FDA批准。PegvisomantTM是一种经基因工程设计的hGH类似物，其对于治疗肢端肥大症起到高选择性生长激素受体拮抗剂的作用(vanderLely等人，r&358:1754-1759(2001))。尽管PegvisomantTM中的若干氨基酸侧链残基都已经聚乙二醇(PEG)聚合物衍生化，但仍需每日一次投与所述产品，此表明医药特性未达到最佳。除PEG化和储槽式配方外，包括hGH吸入剂型和口服剂型的其它投药途径也正处于早期前临床和临床研究中，并且都尚未获得FDA的批准。因此，需要一种展现生长激素活性而且也提供较长血清半衰期且因此具有更优的hGH治疗水平和增加的治疗半衰期的多肽。与亲水性聚合物聚(乙二醇)(縮写为PEG)共价连接是一种增加包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子的多个生物活性分子的水溶性、生物利用度；增加其血清半衰期；增加其治疗半衰期；调节其免疫原性；调节其生物活性；或延长其循环时间的方法。已将PEG广泛用于医药、人工移植物以及生物可相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的'其它应用中。为使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高，从而赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特性，诸如增加的水溶性和循环半衰期，同时也不会对母体分子的生物活性造成不利影响。近来，已对蛋白质科学中的整个新技术进行报导，其将有望克服与蛋白质位点特异性修饰有关的许多缺点。具体说來，已将新组份加入原核生物大肠杆菌(^c/^hc/^aco/z',￡.co/O(例如，L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核生物酿酒酵母(S(3cc/zramycescereWw'ae，5"cereWw'ae)(例如，J.Chin等人，ScisncG301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，其已使得能够于活体内将非基因编码的氨基酸并入到蛋白质中。使用这一方法，已对琥珀密码子TAG起反应以高保真度将大量具有新颖化学、物理或生物学特性的新氨基酸有效地并入Eco"和酵母中的蛋白质中，所述氨基酸包括光亲和性标记和光敏异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看Chin,J.W.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024;禾口Chin,J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如参看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002)，ChemBioChem3(11):1135-1137;J,W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;禾口L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都是以其全文引用的方式并入本文。这些研究己证实，可能选择性地且常规地引入未见于蛋白质中、对见于20种常见、基因编码的氨基酸中的所有官能团具化学惰性且可用于有效且选择性反应形成稳定共价键的化学官能团，诸如酮基、炔基和叠氮基部分。将非基因编码的氨基酸并入蛋白质的能力允许引入可向天然存在的官能团(诸如赖氨酸的s-NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等)提供有价值的替代选择的化学官能团。人生长激素配方可为需要复水的冻干制剂或水性配方。每小瓶ProtropinTMhGH是由复水成pH7.8的5mghGH、40mg甘露糖醇、O.lmg磷酸二氢钠、1.6mg磷酸二氢钠组成(Physician'sDeskReference,MedicalEconomicsCo,,Orawell,N丄,第1049页，1992)。每小瓶HumatropehGH是由复水成pH7.5的5mghGH、25mg甘露糖醇、5mg甘氨酸、1.13mg磷酸二氢钠组成(Physician'sDeskReference,第1266页，1992)。水性人生长激素配方的实例描述于美国专利第5,763,394号；第5,981,485号；第6，448，225号；和美国专利公开案第2003/0013653号中，所述专利的每一者都是以引用的方式并入本文中。有关生长激素配方的基本综述，参看Pearlman等人，CurrentCommunicationsinMolecularBiology,D.Marshak禾口D.Liu编辑，第23-30页，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989，所述文献是以引用的方式并入本文中。有关蛋白质稳定化的其它引人关注的公开案如下。美国专利第4,297,344号(其是以引用的方式并入本文)揭示通过加入所选择的氨基酸(诸如甘氨酸、丙氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺和氨基丁酸)和碳水化合物(诸如单醣、寡醣或糖醇)來使凝血因子II和VIII、抗凝血酶m和纤溶酶原耐热稳定。美国专利第4,783,441号(其是以引用的方式并入本文)揭示一种通过加入多达500ppm包含在pH6.8-8.0下具有交替弱亲水性和弱疏水性区域的链的表面活性物质来防止蛋白质(诸如胰岛素)在水溶液界面处变性的方法。美国专利第4,812,557号(其是以引用的方式并入本文)揭示一种使用人血清白蛋白使白细胞介素-2稳定的方法。欧洲专利申请公开案第0303746号(其是以引用的方式并入本文)揭示用由非还原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Fkoll组成的多元醇、氨基酸、在生理pH值下具有带电侧基的氨基酸聚合物和胆碱盐使生长促进激素稳定。欧洲专利申请公开案第0211601号(其是以引用的方式并入本文)揭示使生长促进激素在由含有聚氧乙烯-聚氧丙烯单元且具有约U00到约40,000的平均分子量的嵌段共聚物所形成的凝胶基质中稳定。欧洲专利申请公开案第0193917号(其是以引用的方式并入本文)揭示一种以蛋白质与碳水化合物的复合物的水溶液为特征用于减缓释放的生物活性组合物。国际专利公开案第89/09614号和澳大利亚专利申请案第30771/89号(其是以引用的方式并入本文)揭示一种含有人生长激素、甘氨酸和甘露糖醇的稳定医药配方。这类制剂在正常加工和以冻干状态储存以及复水后使用期间都展示出经改良的稳定性。美国专利第5,096,885号(其是以引用的方式并入本文)揭示一种含有甘氨酸、甘露糖醇、非离子表面活性剂和缓冲剂的冻干hGH配方。美国专利第4,876,568号(其是以引用的方式并入本文)揭示可以各种稳定剂使动物生长激素稳定以减少水性环境中不溶物质的形成和可溶物质活性的保持。所述稳定剂包括某些多元醇、氨基酸、在生理pH值下具有带电侧基的氨基酸聚合物和胆碱盐。多元醇是选自由非还原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Ficoll组成的群组；氨基酸是选自由甘氨酸、肌氨酸、赖氨酸或其盐、丝氨酸、精氨酸或其盐、甜菜碱、N,N,-二甲基-甘氨酸、天冬氨酸或其盐、谷氨酸或其盐组成的群组；在生理pH值下具有带电侧基的氨基酸聚合物可选自聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸和其盐；且胆碱衍生物是选自由氯化胆碱、柠檬酸二氢胆碱、酒石酸氢胆碱、碳酸氢胆碱、柠檬酸三胆碱、抗坏血酸胆碱、硼酸胆碱、葡萄糖酸胆碱、磷酸胆碱、硫酸二(胆碱)和粘液酸二胆碱组成的群组。美国专利第4,876,568号(其是以引用的方式并入本文)指出可将聚组氨酸用作动物生长激素的潜在稳定剂，但尚未指出其使动物生长激素还是人生长激素稳定。此外，美国专利第4,876,568号指出优选聚-DL-赖氨酸HBr。EP374120(其是以引用的方式并入本文)揭示一种包含包括具有三个羟基的多元醇和缓冲剂的经缓冲多元醇赋形剂的稳定生长激素制剂，用以达成使生长激素能够在一段足够的时间内保持其生物活性的pH值范围。组氨酸被认为是具有三个羟基的多元醇的缓冲剂。具体说来，EP374120教示可将组氨酸盐酸盐用作缓冲剂，以使具有三个羟基的多元醇缓冲，从而改良包含高浓度生长激素和作为稳定剂的多元醇的溶液形式的生长激素制剂的稳定性。此外，组氨酸盐酸盐必须以约3溶液重量％(对应于约0.15M的组氨酸盐酸盐溶液浓度)的量加入。EP374120也教示单独组氨酸将不赋予生长激素制剂以化学和物理稳定性。Sorensen等人的WO93/12812(其是以引用的方式并入本文)中教示可通过组氨酸或组氨酸衍生物的存在使生长激素稳定。如果生长激素经冻干，那么所述组合物也可包含膨胀剂，意即糖醇、二醣和其混合物。Sorensen等人的美国专利第5,849,704号(其是以引用的方式并入本文)中揭示一种医药配方，其包含生长激素和作为添加剂或缓冲物质加入以于生长激素中提供抗脱酰胺化、抗氧化或抗肽键裂解的稳定性的组氨酸或组氨酸衍生物。还揭示，在组氨酸或其衍生物存在下使生长激素结晶将产生比己知方法制造的结晶具有更高纯度的更高产量结晶。人生长激素变异体的配方已描述于美国专利第6,136,563号和第5,849,535号中，其是以引用的方式并入本文中。hGH通过若干降解路径经历分解，包括脱酰胺、聚集、肽主链剪短和甲硫氨酸残基氧化。其它产物是由与水溶性聚合物(诸如PEG)共价连接的hGH接合物降解产生。提供可接受的降解产物对照、已使hGH保持稳定性一段较长时间段且对于剧烈搅动(其诱导聚集)稳定的hGH医药配方将特别有益。
发明内容本发明提供包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的hGH多肽配方。在一些实施例中，hGH多肽包含一种或一种以上翻译后修饰。在一些实施例中，hGH多肽与连接子、聚合物或生物活性分子相连。在一些实施例中，hGH多肽与双官能聚合物、双功能连接子或至少一种额外的hGH多肽相连。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物相连。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸以连接子与水溶性聚合物相连或与水溶性聚合物键接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，本发明为hGH多肽的单剂量冻干配方。在一些实施例中，本发明为hGH多肽的液体配方。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约O.lkDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分枝状聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分枝状聚合物的各个分枝具有介于约1kDa与约100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。在一实施例中，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的hGH多肽的医药配方包含缓冲剂、至少一种载剂、赋形剂或稳定剂和医药量的人生长激素(hGH)。在另一实施例中，所述至少一种载剂、赋形剂或稳定剂是选自由抗氧化剂、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、糖醇、成盐反离子和非离子表面活性剂组成的群组。本发明还提供以有效量的本发明的hGH分子配方治疗患有由hGH介导的病症的患者的方法。在本发明的一个实施例中，提供包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽配方，其使不合需要的聚集物质的形成减到最少或引起降低生物活性或改变受体识别的化学变化。所述配方能够保持活性一段适当的储存时间、易于调配，并且为向患者投与可接受。在一实施例中，包括(但不限于)PEG化hGH、包含一种或一种以上非天然编码的氨基酸的hGH多肽配方为皮下注射使用前复水的冻干配方。本发明的配方可为医药配方，尤其用于皮下投与的配方。在另一实施例中，本发明提供一种治疗(预防性治疗或治疗性治疗)可通过使用本文所揭示的配方调配的蛋白质(包括但不限于经PEG化的hGH)治疗的病症的方法。所述配方尤其可用于皮下投与。还提供一种制造物件，其包含密封本文所揭示的配方的容器以及预充式注射器。图1绘示4'C下6周后配方缓冲液的pH值稳定性分析。图2绘示MetY35pAFhGH的SDS-PAGE还原性凝胶(图2C和图2D)和非还原性凝胶(图2A和图2B)。图2A和图2B中的凝胶装载如下第1道MW;第2道WHOhGH;第3道WHOhGH1%;第4道Al;第5道A2;第6道A3;第7道A4;第8道A5;第9道A6;第10道A7;第ll道A8;第12道MW。图2C和图2D中的凝胶装载如下第l道MW;第2道WHOhGH;第3道WHOhGH1%;第4道Bl;第5道B2;第6道B3;第7道B4;第8道B5;第9道B6;第IO道B7;第ll道B8;第12道MW。图3A-F绘示配方组A-F的差示扫描量热法(DSC)的热概况。图4绘示第B7组(图4A)和第F2组(图4B)的基质的DSC热概况。图5提供概括全部基质的DSC熔解温度和Tm改变的表格。图6绘示全部基质的DSC熔解温度的概要。图7绘示对于配方组AHV/AH比率的分析。图8绘示对于各样本焓(AUC)改变的分析。图9A-D绘示与WHOhGH标准品相比第B组、第C组、第E组和第F组中样本的RP-HPLC数据集。图10A绘示对于第E5组中不同Y35pAF峰的分析(绘制各时间点处所有峰值的相对百分比以观察主要MetY35pAFhGH峰的任何改变和所有改变)，且图10B绘示初级脱酰胺/氧化峰的急剧上升(放大的脱酰胺峰一脱酰胺作用随时间变化(1=0至4周)而增加)。RP-HPLC分析是使用AgilentChemstation软件执行。图11绘示对于横过基质的初级脱酰胺/氧化峰的分析。(对于(C下4周后MetY35pAFhGH的分析)图12绘示对于经配方组次级脱酰胺/氧化的峰的分析。(对于fC下4周后MetY35pAFhGH的分析)图13绘示对于配方组主要GH峰的分析。(对于4'C下4周后MetY35pAFhGH的分析)图14绘示对于配方组B和C中已经历冷冻-解冻循环的样本的初级脱酰胺/氧化的峰的RP-HPLC分析(对于经5个冷冻/解冻循环后MetY35pAFhGH峰的分析)。图15绘示对于配方组B和C中已经历冷冻-解冻循环的样本的次级脱酰胺的峰的RP-HPLC分析(对于经5个冷冻/解冻循环后MetY35pAFhGH的分析)。图16绘示对于配方组B和C中已经历冷冻-解冻循环的样本的主要GH峰的RP-HPLC分析(对于经5个冷冻/解冻循环后MetY35pAFhGH的分析)。图17绘示RP-HPLC分析的结果。图18绘示SEC-HPLC分析的结果。图19绘示cIEX-HPLC分析的结果。图20绘示SEC-HPLC积分的实例。图21绘示RP-HPLC积分的实例。图22绘示对配方研究(t=0)中对照样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道标记12;第2道Ref.Std;第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道:S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。图23绘示对配方研究(t=0)中对照样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道标记12;第2道Ref.Std;第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图24绘示对配方研究(t=0)中对照样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图24而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图24而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图25绘示对于在(C下储存1周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图25而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道.-S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图25而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG陽hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图26绘示对于在4'C下储存1周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图26而g，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图26而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图27绘示对于在4t:下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图27而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图27而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图28绘示对于在4'C下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图28而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图28而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图29绘示对于在4'C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图29而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图29而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图30绘示对于在4'C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图30而^，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10填P6MS。对于图30而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图31绘示对于在4'C下储存6周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图32绘示对于在4卩下储存6周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图33绘示对于在4'C下储存2个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(1(Xg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图34绘示对于在4。C下储存2个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(l吗)；第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图35绘示对于在4"下储存3个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道:PEG-hGH标准品；第3道hGH(lMg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图36绘示对于在4r下储存3个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(lpg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet*(污染)；第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图37绘示对于在25"C下储存1周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图37而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图37而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图38绘示对于在25'C下储存1周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图38而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图38而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图39绘示对于在25'C下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图39而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图39而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图40绘示对于在25。C下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图40而，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图40而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图41绘示对于在25。C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图41而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图41而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图42绘示对于在25。C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图42而言，图A第1道:'标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图42而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG陽hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图43绘示对于在25。C下储存6周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图44绘示对于在25。C下储存6周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图45绘示对于在25X:下储存2个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(1ng);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图46绘示对于在25'C下储存2个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(lpg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图47绘示对于在25'C下储存3个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(1jag);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图48绘示对于在25"C下储存3个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第3道hGH(l|_ig);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT陽P。图49绘示对于在40。C下储存1周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图49而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图49而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图50绘示对于在4(TC下储存1周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图50而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图50而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图51绘示对于在4(TC下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图51而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图51而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图52绘示对于在4(TC下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图52而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图52而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图53绘示对于在40'C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图53而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图53而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图54绘示对于在40'C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图54而言，图A第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图54而言，图B第1道标记12标准品；第2道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图55绘示对于在4(TC下储存6周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图56绘示对于在4(TC下储存6周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S5MT;第5道S5GT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第11道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图57绘示对于在4(TC下储存2个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(1pg);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT陽P。图58绘示对于在4(TC下储存2个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第3道hGH(l^g);第5道P6MT;第6道H6MT;第7道P6GT;第8道P6MS;第9道P6MTMet;第10道P6MT;第ll道P7GT;第12道P6MGT;第13道P6MGT-P;第14道P6MT-P;第15道P6GT-P。图59绘示对于在4'C下储存1周的复水样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图59而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图59而言，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图60绘示对于在4'C下储存1周的复水样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图60而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图60而言，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图61绘示对配方研究(搅动/UV对照)中对照样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图61而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图61而言，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT陽P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图62绘示对配方研究(搅动/UV对照)中对照样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图62而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图62而言，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图63绘示对于在环境温度下搅动4小时的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图63而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图63而言，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图64绘示对于在环境温度下搅动4小时的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图64而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图64而自'，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图65绘示对于在环境温度下曝露至UV光4小时的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。对于图65而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图65而g，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT陽P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图66绘示对于在环境温度下曝露至UV光4小时的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。对于图66而言，图A第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MT;第4道S4MT;第5道S5MT;第6道S5GT;第7道H6MT;第8道P6GT;第9道P6MA;第10道P6MS。对于图66而言，图B第1道PEG-hGH标准品；第3道P6MTMet;第4道P7MT;第5道P7GT;第6道P6MGT;第7道P6MGT-P;第8道P6MT-P;第9道P6GT-P。图67绘示对于经历冷冻/解冻条件的样本(H7MT-P)的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(1^g);第3道H7MT-P8mg/mLt=0;第4道H7MT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MT-P8mg/mLF/T2;第6道H7MT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MT-P14mg/mLt=0;第11道H7MT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MT-P14mg/mLF/T5。图68绘示对于经历冷冻/解冻条件的样本(H7MT-P)的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lng);第3道H7MT-P8mg/mLt=0;第4道H7MT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MT-PSmg/mLF/T2;第6道H7MT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MT-P14mg/mLt=0;第11道H7MT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MT-P14mg/mLF/T5。图69绘示对于经历冷冻/解冻条件的样本(H7MGT-P)的SDS-PAGE分析(非还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lng);第3道H7MGT-P8mg/mLt=0;第4道H7MGT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MGT-P8mg/mLF/T2;第6道H7MGT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MGT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MGT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MGT-P14mg/mLt=0;第11道H7MGT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MGT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MGT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MGT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MGT-P14mg/mLF/T5。图70绘示对于经历冷冻/解冻条件的样本(H7MGT-P)的SDS-PAGE分析(还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lpg);第3道H7MGT-P8mg/mLt=0;第4道H7MGT-P8mg/mLF/T1;第5道H7MGT-P8mg/mLF/T2;第6道H7MGT-P8mg/mLF/T3;第7道H7MGT-P8mg/mLF/T4;第8道H7MGT-P8mg/mLF/T5;第10道H7MGT-P14mg/mLt=0;第11道H7MGT-P14mg/mLF/T1;第12道H7MGT-P14mg/mLF/T2;第13道H7MGT-P14mg/mLF/T3;第14道H7MGT-P14mg/mLF/T4;第15道H7MGT-P14mg/mLF/T5。图71绘示对于对照样本和经历搅动6小时和UV光4小时的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lpg);第4道涡旋/UV对照H7MT-P8mg/mL;第5道涡旋/UV对照H7MT-P14mg/mL;第6道涡旋/UV对照H7MGT-P8mg/mL;第7道涡旋/UV对照H7MGT-P14mg/mL;第8道涡旋H7MT-P8mg/mL;第9道涡旋H7MT-P14mg/mL;第10道涡旋H7MGT-P8mg/mL;第11道涡旋H7MGT-P14mg/mL;第12道UVH7MT-P8mg/mL;第13道UVH7MT-P14mg/mL;第14道UVH7MGT-P8mg/mL;第15道UVH7MGT-P14mg/mL。图72绘示对于对照样本和经历搅动6小时和UV光4小时的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lpg);第4道涡旋/UV对照H7MT-P8mg/mL;第5道涡旋/UV对照H7MT-P14mg/mL;第6道涡旋/UV对照H7MGT-P8mg/mL;第7道涡旋/UV对照H7MGT-P14mg/mL;第8道涡旋H7MT-P8mg/mL;第9道涡旋H7MT-P14mg/mL;第10道涡旋H7MGT-P8mg/mL*(已污染)；第11道涡旋H7MGT-P14mg/mL;第12道UVH7MT-P8mg/mL;第13道UVH7MT-P14mg/mL;第14道UVH7MGT-P8mg/mL;第15道UVH7MGT-P14mg/mL。图73绘示对于在4T:或4(TC下储存1周的样本和暴露至热伸展条件的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第2道hGH(1pg);第4道H7MT-P8mg/mL4°C;第5道H7MT-P14mg/mL4°C;第6道H7MGT-P8mg/mL4°C;第7道H7MGT陽P14mg/mL4'C;第8道H7MT-P8mg/mL40°C;第9道H7MT-P14mg/mL40°C;第10道H7MGT墨P8mg/mL40°C;第11道H7MGT-P14mg/mL40°C;第12道H7MT-P8mg/mL热伸展条件；第13道H7MT-P14mg/mL热伸展条件；第14道H7MGT-P8mg/mL热伸展条件；第15道H7MGT-P14mg/mL热伸展条件。图74绘示对于在4'C或4(TC下储存1周的样本和暴露至热伸展条件的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(1貼)；第4道H7MT-P8mg/mL4'C;第5道H7MT-P14mg/mL4°C;第6道H7MGT-P8mg/mL4。C;第7道H7MGT-P14mg/mL4°C;第8道H7MT-P8mg/mL40°C;第9道H7MT墨P14mg/mL40°C;第10道H7MGT陽P8mg/mL40°C;第11道H7MGT-P14mg/mL40。C;第12道H7MT-P8mg/mL热伸展条件；第13道H7MT-P14mg/mL热伸展条件；第14道H7MGT-P8mg/mL热伸展条件；第15道H7MGT-P14mg/mL热伸展条件。图75绘示对于在4。C或40。C下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第l道PEG-hGH标准品；第2道hGH(1pg);第3道H7MT-P8mg/mL4°C;第4道H7MT-P14mg/mL4°C;第5道H7MGT-P8mg/mL4'C;第6道H7MGT-P14mg/mL4°C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT-P8mg/mL40。C;第10道H7MGT-P14mg/mL40°C。图76绘示对于在4'C或4(TC下储存2周的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lpg);第3道H7MT-P8mg/mL4°C;第4道H7MT-P14mg/mL4°C;第5道H7MGT-P8mg/mL4°C;第6道H7MGT-P14mg/mL4'C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT-P8mg/mL40。C;第10道H7MGT-P14mg/mL40°C。图77绘示对于在4'C下储存4个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lpg);第4道P6MT;第5道H6MT;第6道P6GT;第7道P6MS;第8道P6MTMet;第9道P6MT;第10道P7GT;第11道P6MGT;第12道P6MGT-P;第13道P6MT-P;第14道P6GT-P。图78绘示对于在4。C下储存4个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(l|Llg);第4道P6MT;第5道H6MT;第6道P6GT;第7道P6MS;第8道P6MTMet;第9道P6MT;第10道P7GT;第11道P6MGT;第12道P6MGT-P;第13道P6MT-P;第14道P6GT-P。图79绘示对于在25'C下储存4个月的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(1貼)；第3道P6MT;第4道H6MT;第5道P6GT;第6道P6MS;第7道P6MTMet;第8道P6MT;第9道P7GT;第10道P6MGT;第ll道P6MGT-P;第12道P6MT-P;第13道P6GT-P。图80绘示对于在25°〇下储存4个月的样本的SDS-PAGE分析(还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(lpg);第3道P6MT;第4道H6MT;第5道P6GT;第6道P6MS;第7道P6MTMet;第8道P6MT;第9道P7GT;第10道P6MGT;第ll道P6MGT-P;第12道P6MT-P;第13道P6GT-P。图81绘示对于在4。C或40。C下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(0.5pg);第3道H7MT-P8mg/mL4。C;第4道H7MT-P14mg/mL4'C;第5道H7MGT墨P8mg/mL4°C;第6道H7MGT-P14mg/mL4°C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT匿P8mg/mL4CTC;第10道H7MGT-P14mg/mL40°C。图82绘示对于在4。C或4(TC下储存4周的样本的SDS-PAGE分析(非还原性)。第1道PEG-hGH标准品；第2道hGH(0.5pg);第3道H7MT-P8mg/mL4。C;第4道H7MT-P14mg/mL4°C;第5道H7MGT-P8mg/mL4°C;第6道H7MGT-P14mg/mL4°C;第7道H7MT-P8mg/mL40°C;第8道H7MT-P14mg/mL40°C;第9道H7MGT-P8mg/mL40。C;第10道H7MGT-P14mg/mL40。C。图83绘示对于样本的SDS-PAGE分析。第1道PEG-hGH标准品(第2批)；第2道hGH(1pg);第4道39.9mg/mL非还原性；第5道24.3mg/mL非还原性；第6道1.1mg/mL非还原性；第8道39.9mg/mL还原性；第9道24.3mg/mL还原性；第10道1.1mg/mL还原性。具体实施例方式定义应了解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂且因此其可变化。还应了解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不意欲限制将仅受随附权利要求书限制的本发明的范畴。除非本文中另作清楚指示，否则如本文和随附权利要求中所使用的单数形式"一"和"所述"包括复数个参考物。因此，例如提及一种"hGH"是对一种或一种以上所述蛋白质的参考，且包括所属领域技术人员己知的所述蛋白质的等效物等。除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的含义相同的含义。尽管可使用与本文所述者相似或相同的任何方法、装置和材料实施或测试本发明，但现描述优选方法、装置和材料。本文所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中以达到描述和揭示(例如)所述公开案中所述的可能与本发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文所讨论的公开案仅提供本申请案申请R期之甜的揭示内容。本文在任何方面都不应解释为承认本发明者无权由于现有发明或任何其他原因使所述揭示案的日期提前。美国专利申请案第11/046,432号是以其全文引用的方式并入本文。因此，美国专利申请案第11/046,432号中标号为79-153的段落中所提供的揭示内容完全适用于制造、纯化、表征和使用本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸hGH多肽和经修饰的非天然氨基酸hGH多肽的方法、组合物、技术和策略，所述适用的程度就如同这里揭示内容完全是本发明所提供的一样。如本文所使用的"生长激素"或"GH"应包括那些具有人生长激素的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，以及GH类似物、GH同功异型物、GH模拟物、GH片段、杂交GH蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、其同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白质，不管是否具有相同生物活性且也不管其合成或制造方法如何；所述合成或制造方法包括(但不限于)重组方法(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸制造)、活体外方法、活体内方法、通过微注射核酸分子方法、合成法、转基因法和基因活化方法。术语"hGH多肽"涵盖包含一种或一种以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。有关完整的天然存在的全长GH氨基酸序列以及成熟的天然存在的GH氨基酸序列和天然存在的突变体的内容，分别参看美国专利申请案第11/046,432号中的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3，所述专利是以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本发明的hGH多肽与生长激素多肽的这些序列或任何其它序列实质相同。术语"hGH多肽"还包括医药学上可接受的盐和前药，和所述盐的前药、天然存在的hGH的多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在的hGH的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体和其多肽融合物。术语"hGH多肽"涵盖在氨基端、羧基端或二者处包含额外氨基酸的融合物。示范性融合物包括(但不限于)例如甲硫氨酰基生长激素，其中甲硫氨酸因重组表达而与hGH的N末端相连；用于纯化的目的的融合物(包括但不限于，聚组氨酸或亲和性表位)；具有血清白蛋白结合肽的融合物；和具有血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合物。美国专利第5,750,373号(以引用的方式并入本文中)描述一种用于选择新颖蛋白质(诸如生长激素和对于个别受体分子具有已改变的结合特性的抗体片段变异体)的方法。所述方法包含将编码所需蛋白质的基因与丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基端结构域融合。多个参考文献都已揭示通过聚合物接合或糖基化来修饰多肽。术语"hGH多肽"包括与诸如PEG的聚合物接合的多肽，且可包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一种或一种以上额外衍生作用。此外，hGH多肽可包含连接子或聚合物，其中与所述连接子或聚合物接合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或可利用此项技术中已知的技术(诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合)使其与天然编码的氨基酸接合。已报导hGH多肽的聚合物接合。例如参看美国专利第5,849,535号、第6,136,563号和第6,608,183号，所述专利是以引用的方式并入本文中。美国专利第4,904,584号揭示耗尽PEG化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基己缺失或经任何其它氨基酸残基置换。WO99/67291揭示一种用于使蛋白质与PEG接合的工艺，其中所述蛋白质上至少一个氨基酸残基已缺失，并且所述蛋白质是在足以达成与所述蛋白质接合的条件下与PEG接触。WO99/03887揭示属于生长激素总科的PEG化多肽变异体，其中半胱氨酸残基己经位于所述多肽指定区域中的非基本氨基酸残基取代。WO00/26354揭示一种制造具有降低的致过敏性的糖基化多肽变异体的方法，与相应的母体多肽相比，所述多肽变异体包含至少一个额外的糖基化位点。美国专利第5,218,092号(其是以引用的方式并入本文中)揭示对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽进行修饰从而当与天然多肽相比时引入至少一个额外的碳水化合物链。术语"hGH多肽"还包括糖基化hGH，诸如但不限于，在任何氨基酸位置处经糖基化的多肽、N连接或O连接糖基化形式的多肽。也可将含有单核苷酸改变的变异体看作hGH多肽的生物活性变异体。此外，还包括剪接变异体。术语"hGH多肽"还包括通过化学方式连接或以融合蛋白形式表达的任一种或一种以上hGH多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配位体或任何类型的其它生物活性分子的hGH多肽杂二聚体、均二聚体、杂多聚体或均多聚体，以及例如含有特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。除非另作特定说明(意即，当声明所述比较是基于诸如SEQIDNO:1、3的另一hGH序列时)，否则有关本文所述的hGH中氨基酸位置的所有相关内容都是基于如标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专禾U申请案第11/046,432号中所列的SEQIDNO:2中的位置，所述专利是以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将了解，与美国专利申请案第11/046,432号(其是以引用的方式并入本文中)中所列的SEQIDNO:1、2、3或任何其它GH序列中的位置对应的氨基酸位置可易于以诸如hGH融合物、变异体、片段等的任何其它hGH分子鉴别。举例而言，可使用诸如BLAST的序列比对程序比对并鉴别蛋白质中与美国专利申请案第11/046,432号(其是以引用的方式并入本文中)的SEQIDNO.1、2、3或其它GH序列中的位置对应的特定位置。预期本文所述的关于美国专利申请案第11/046,432号(其是以引用的方式并入本文中)中的SEQIDNO:1、2、3或其它GH序列中的氨基酸的取代、缺失或添加还指在本文所述或此项技术中已知的诸如hGH融合物、变异体、片段等的任何其它hGH分子中的相应位置处进行的取代、缺失或添加，且都明显地涵盖于本发明中。术语"hGH多肽"或"hGH"涵盖包含一种或一种以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。本发明的hGH多肽可包含一种或一种以上天然氨基酸的修饰与一种或一种以上非天然氨基酸修饰的组合。己对天然存在的hGH多肽中多个氨基酸位置中的示范性取代进行描述，包括(但不限于)调节hGH多肽的一种或一种以上生物活性的取代，所述活性的调节诸如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、降低蛋白酶易感性、将所述多肽转化成拮抗剂等，且其都涵盖于术语"hGH多肽"中。在一些实施例中，hGH多肽另外包含调节hGH多肽的生物活性的添加、取代或缺失。举例而言，所述添加、取代或缺失可调节hGH的一种或一种以上特性或活性。举例而言，所述添加、取代或缺失可调节对hGH多肽受体的亲和性、调节(包括但不限于，增加或降低)受体二聚作用、使受体二聚体稳定、调节循环半衰期、调节治疗半衰期、调节多肽稳定性、调节蛋白酶的裂解、调节剂量、调节释放或生物利用度、便利纯化或改良或改变特定投药路径。类似地，hGH多肽可包含蛋白酶裂解序列、分泌信号序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于，FLAG或聚His)或其它基于亲和性的序列(包括但不限于，FLAG、聚His、GST等)或改良对于多肽的检测(包括但不限于，GFP)、纯化或其它特质的连接分子(包括但不限于，生物素)。术语"hGH多肽"还涵盖均二聚体、杂二聚体、均多聚体和杂多聚体，其与相同或不同非天然编码的氨基酸侧链、天然编码的氨基酸侧链连接，包括(但不限于)通过非天然编码的氨基酸侧链直接连接或通过连接子间接连接。示范性连接子包括(但不限于)小有机化合物；各种长度的水溶性聚合物，诸如聚(乙二醇)或葡聚糖；或各种长度的多肽。"非天然编码的氨基酸"是指不为20种常见氨基酸中的任一种或吡咯赖氨酸或硒半胱氨酸的氨基酸。可以与术语"非天然编码的氨基酸"相同意义使用的其它术语为"非天然氨基酸("non-naturalaminoacid"、"unnaturalaminoacid")"、"非天然存在的氨基酸"和其各种以连字符连接和不以连字符连接的型式。术语"非天然编码的氨基酸"还包括(但不限于)通过对天然编码的氨基酸(包括但不限于，20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸)进行修饰(例如，翻译后修饰)而产生但其本身未通过翻译复合物天然并入到生长多肽链中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和0-磷酸酪氨酸。"氨基端的修饰基团"是指可连接到多肽氨基端的任何分子。类似地，"羧基端的修饰基团"是指可连接到多肽羧基端的任何分子。水端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(诸如血清白蛋白)或增加肽的血清半衰期的其它部分。此项技术中和本文中使用术语"官能团"、"活性部分"、"活化基团"、"离去基团"、"反应位点"、"化学反应性基团"和"化学反应性部分"是指分子中截然不同、可定义的部分或单元。所述术语在某种程度上与化学技术中的含义同义，且用于在本文中表明分子中执行某种功能或活性并与其它分子反应的部分。本文中使用术语"键"或"连接子"是指通常由化学反应形成且通常为共价键的基团或键结。水解稳定的键意思是在水中实质稳定且在有用pH值下(包括但不限于，在生理学条件下)于一段较长时间段内、可能甚至无限期不与水反应的键。水解不稳定或可降解的键意思是在水中或水溶液(例如包括血液)中可降解的键。酶解不稳定或可降解键意思是可经一种或一种以上酶降解的键。如此项技术中所了解，PEG和相关聚合物可在聚合物主链中或聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中包括可降解键。举例而言，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键一般在生理学条件下水解释放所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；由醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与酵的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的縮醛键；作为甲酸与醇的反应产物的原酸酯键；由包括(但不限于)聚合物(诸如PEG)末端处的胺基与肽的羧基形成的肽键；和由包括(但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺基与寡核苷酸的5'羟基所形成的寡核苷酸键。当用于本文中时，术语"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性剂"意思是可影响与有机体相关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生化特性的任何物质，所述有机体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。具体说来，如本文所使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其他动物的疾病或另外增强人类或动物的身体或精神的良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬性药物(harddrug)、软性药物、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶粒。适用于本发明中的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管药、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇药、微生物来源的毒素和其类似物。"双官能聚合物"是指包含两种离散官能团的聚合物，其能够与其它部分(包括但不限于，氨基酸侧基)特异性反应形成共价或非共价键。可使用一个官能团与特定生物活性组份上的基团反应且另一基团与第二生物组份上的基团反应的双功能连接子形成一种接合物，其包括第一生物活性组份、双功能连接子和第二生物活性组份。已知用于使各种化合物与肽连接的多种程序和连接子分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，所述专利是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"是指包含两种或两种以上离散官能团的聚合物，其能够与其它部分(包括但不限于，氨基酸侧基)特异性反应形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可为任何所需长度或分子量，且可经选择以于一种或一种以上与GH连接的分子(例如，hGH分子)之间提供特定所需间隔或构象。如本文所使用的术语"水溶性聚合物"是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与hGH多肽的键可相对于未经修饰形式导致以下改变包括(但不限于)血清半衰期增加或经调节；或治疗半衰期增加或经调节；免疫原性经调节；实体相关特性经调节，诸如聚集和多聚体形成；受体结合改变；和受体二聚化或多聚化改变。水溶性聚合物可或可不具有其自身的生物活性。适当聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单d-do烷氧基或芳氧基衍生物(美国专利第5,252,714号中描述，其是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚顺丁烯二酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、寡醣、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇共聚物和其衍生物、聚乙烯基乙醚和oH3-聚[(2-羟乙基)]-DL-天冬酰胺和其类似物，或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。如本文所使用的术语"聚烷二醇"或"聚(垸二醇)"是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语"聚烷二醇"涵盖线性与分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。举例而言，其它示范性实施例列于商业供应商目录中，诸如ShearwaterCorporation目录"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)中。如本文所使用的术语"经调节的血清半衰期"意思是经修饰hGH的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正或负改变。血清半衰期是通过在投与hGH后于各种时间点时取得血液样本且测定各样本中所述分子的浓度来进行测量。血清浓度与时间的相关性使得能够计算血清半衰期。血清半衰期合意地增加至少约两倍，但较小增加可例如在其允许令人满意的给药方案或避免有毒作用的情况下有益。在一些实施例中，所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。如本文所使用的术语"经调节的治疗半衰期"意思是治疗有效量的hGH的半衰期相对于其未经修饰形式的正或负改变。治疗半衰期是通过投药后在各种时间点时测量所述分子的药代动力学和/或药效特性来进行测量。治疗半衰期增加合意地允许特别有益的给药方案、特别有益的总剂量或避免不合需要的作用。在一些实施例中，治疗半衰期增加是由效力增加、经修饰分子与其目标的结合增加或减少、酶(诸如蛋白酶)对所述分子分解的增加或减少或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或减少引起。术语"实质纯"是指可实质或基本无通常伴有见于天然存在的环境(意即，天然细胞或在重组产生hGH多肽的情况下的宿主细胞)中的蛋白质或与其相互作用的组份的hGH多肽。可实质无细胞材料的hGH多肽包括(以干重计)具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%污染蛋白的蛋白质制剂。当通过宿主细胞重组产生hGH多肽或其变异体时，所述蛋白质可以占细胞干重约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更低的量存在。当通过宿主细胞重组产生hGH多肽或其变异体时，所述蛋白质可以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低细胞干重存在于培养基中。因此，当通过诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法测定时，如通过本发明的方法所制造的"实质纯"hGH多肽可具有至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度水平，尤其至少约75%、80%、85%的纯度水平且更尤其至少约90%的纯度水平、至少约95%的纯度水平、至少约99%或更高的纯度水平。当用于核酸或蛋白质时，术语"经分离"表示所述核酸或蛋白质无至少某些与其天然状态相关的细胞组份，或已将所述核酸或蛋白质浓縮到大于其在活体内或活体外制造时的浓度的程度。其可为均质态。经分离的物质可为干燥或半干燥状态；或在溶液中，包括(但不限于)水溶液。其可为包含其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组份。纯度和均质性通常是使用分析化学技术(诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)测定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质经纯化。特别说来，使经分离基因与侧接到所述基因且编码除所需基因外的蛋白质的丌放式阅读框分离。术语"经纯化"表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中实质产生出一条谱带。具体说来，意思可为所述核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99°/。纯或更高纯度。如本文所使用的术语"受检者"是指作为治疗、观察或实验目标的动物，在一些实施例中为哺乳动物，且在其它实施例中为人类。如本文所使用的术语"有效量"是指所投与的经修饰非天然氨基酸多肽的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病况或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物以达到预防、增强和/或治疗性治疗的目的。术语"增强"意思是增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，就增强治疗剂的作用而言，术语"增强"是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文所使用的"增强有效性的量"是指适于增强所需系统中另一治疗剂的作用的量。当用于患者时，有效用于此用途的量将视疾病、病症或病况的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应和治疗医师的判断而定。如本文所使用的术语"经修饰"是指对指定多肽所作的任何改变，诸如对多肽长度、多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。"(经修饰)"形式的术语意思是所讨论的多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可经修饰或不经修饰。术语"翻译后经修饰"是指己并入多肽链后对天然氨基酸或非天然氨基酸进行的可发生于所述氨基酸的任何修饰。举例而言，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(诸如无细胞翻译系统)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。在预防性应用中，将含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与易受特定疾病、病症或病况影响或另外有患特定疾病、病症或病况风险的患者。所述量定义为"预防有效量"。在此使用中，确切量也视患者的健康状态、体重和其类似情况而定。认为所属领域技术人员将能够通过常规实验(例如，剂量递增临床实验)确定所述预防有效量。在预防性应用中，将含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分抑制所述疾病、病症或病况的症状的量投与已罹患疾病、病症或病况的患者。所述量定义为"治疗有效量"，且将视疾病、病症或病况的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应和治疗医师的判断而定。认为所属领域技术人员将能够通过常规实验(例如，剂量递增临床实验)确定所述治疗有效量。术语"治疗"用于指预防和/或治疗性治疗。当投与需要产生代谢物的有机体时，可代谢非天然编码的氨基酸多肽，随后用于产生所需作用，包括所需治疗作用。除非另作说明，否则使用此项技术中众所周知的常规方法质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学。实施方式"信本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的hGH分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的hGH多肽包括至少一种翻译后修饰。在一实施例中，所述至少一种翻译后修饰包含利用所属领域技术人员己知的适于特定反应性基团的化学方法使包含第二反应性基团的分子与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接，所述分子包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖类、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼锁部分(photocagedmoiety)、光化辐射可激发部分、光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、化学可裂解基团、光可裂解基团、延长的侧链、经碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记部分、生物物理学探针、发磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传导物、放射性核苷酸、无线电传导物、中子俘获剂或上述物质的任何组合或任何其它所需化合物或物质。所需蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白质中可存在包含l个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个或IO个以上不同非天然氨基酸的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个或IO个以上不同位点。在某些实施例中，天然存在型式的蛋白质中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代。本发明提供基于包含至少一种非天然编码的氨基酸的GH超基因家族成员、尤其hGH的方法和组合物。将至少一个非天然编码的氨基酸引入GH超基因家族成员(诸如hGH)中可允许应用涉及特定化学反应(包括但不限于，与一个或一个以上非天然编码的氨基酸反应而不与20种常见氨基酸反应)的接合化学方法。在一些实施例中，通过非天然编码的氨基酸的侧链使包含非天然编码的氨基酸的GH超基因家族成员与水溶性聚合物(诸如，聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种以PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及将非基因编码的氨基酸(包括(但不限于)含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)酮、叠氮基或乙炔部分)选择性并入对选择性密码子起反应的蛋白质，且随后以适当的反应性PEG衍生物对那些氨基酸进行修饰。并入后，可接着通过利用所属领域技术人员已知的适于非天然编码的氨基酸中所存在的特定官能团或取代基的化学方法对氨基酸侧链进行修饰。已知的多种化学方法都适用于本发明中以将水溶性聚合物并入蛋白质中。此项技术中已良好确立可使用PEG修饰生物材料的表面(例如，参看美国专利第6,610,281号；Mehvar，R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1):125-136(2000)，所述专利是以引用的方式并入本文中)。标题为"ModifiedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专利申请案第11/046,432号(其是以其全文引用的方式并入本文中)中提供有关重组核酸方法、选择性密码子、正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和具有各种反应性基团的非天然编码的氨基酸，所述反应性基团包括但不限于羰基、肼、酰肼、氨基氧基、叠氮基和炔基。此申请案中也讨论非天然编码的氨基酸的细胞摄入和生物合成。本申请案也详细描述用于将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入hGH且表达hGH多肽的位点。Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746(2003)(其是以引用的方式并入本文中)中描述含有羰基的非天然氨基酸(诸如对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸)。//.^存#天然賓基澄游多嚴可并入非天然氨基酸以达成各种目的，包括(但不限于)修整蛋白质结构和/或功能的改变、改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶目标位点的可接取性、靶向部分(包括但不限于用于蛋白质阵列)、加入生物活性分子、连接聚合物、连接放射性核、调节血清半衰期、调节组织渗透性(例如肿瘤)、调节活性转运体、调节组织、细胞或器官特异性或分布、调节免疫原性、调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强的或甚至完全新颖的催化或生物物理特性。举例而言，可通过将非天然氨基酸包涵于蛋白质中视情况改变以下特性毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括但不限于，血清半衰期)、与其它分子反应(包括但不限于共价或非共价反应)的能力和其类似特性。包括包含至少一种非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用于包括(但不限于)新颖的治疗、沴断、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于抗体)和包括(但不限于)有关蛋白质结构和功能的研究。例如，参看Dougherty,(2000)t/wwa^ra/Jmzwo爿c/tfe/Vo6eso//Vo/ez'w5Vrac/wawt/F頭"/o"'CurrentOpinioninChemicalBiology，4:645-652。在本发明的一个方面中，组合物包括至少一种具有至少一个(包括但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，包括但不限于，包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上不同非天然氨基酸的蛋白质中可存在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个或IO个以上不同位点。另一方面，组合物包括具有至少一种(但小于全部)蛋白质中所存在的特定氨基酸的蛋白质经非天然氨基酸取代。对于具有一个以上非天然氨基酸的指定蛋白质而言，非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于，所述蛋白质可包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括相同非天然氨基酸中的两种)。对于具有两种以上非天然氨基酸的指定蛋白质而言，非天然氨基酸可相同、不同或为多种相同种类的非天然氨基酸与至少一种不同非天然氨基酸的组合。本发明的特征为具有至少一个非天然氨基酸的引人关注的蛋白质或多肽。本发明还包括使用本发明的组合物和方法制造的具有至少一种非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括但不限于医药学上可接受的赋形剂)也可存在于蛋白质中。通过在真核细胞中制造所需的具有至少一种非天然氨基酸的蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一种于活体内由真核细胞所作的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是通过原核细胞进行。举例而言，翻译后修饰包括(但不限于)乙酰化、酰基化、脂质修饰、-棕榈酰化、棕榈酸盐添加、磷酸化、醣酯键修饰、糖基化和其类似修饰。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬氨酸键使寡醣(包括但不限于，(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))与天冬氨酸连接。参看标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolyp印tidesandTheirUses"的美国专利申请案第11/046,432号表1,所述专利是以引用的方式并入本文中，其列出有关真核蛋白的N连接的寡醣的一些实例(也可以存在未展示的额外残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-甲硫氨酸键或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-甲硫胺酸键使寡醣(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或甲硫氨酸连接。另一方面，翻译后修饰包括前体(包括但不限于，降钙素前体、降钙素基因相关的肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、甜阿皮黑素原、阿黑皮素原和其类似物)的蛋白水解加工；组装成多亚基蛋白质或大分子组装；翻译到细胞(包括但不限于，细胞器，诸如内质网、高尔基体(Golgiapparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌路径)中的另一位点。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物或其类似物。美国专利第4,963,495号和第6,436,674号(其是以引用的方式并入本文)中详细描述经设计以改良hGH多肽的分泌的构筑体。非天然氨基酸的一个优势在于其存在可用于加入额外分子的额外化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞中于活体内或活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例而i，翻译后修饰可通过亲核-亲电反应进行。目前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应都涉及于亲核与亲电反应搭配物之间形成共价键，包括(但不限于)a-卤酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下，选择性是通过蛋白质中亲核残基的数量和可接取性测定。在本发明的蛋白质中，可使用其它更多的选择性反应，诸如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物于活体外和活体内进行的反应。例如参看Cornish等人,(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science.276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500;Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024;Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;和Chin等人，(2003)Science,301:964-7，所有参考文献都是以引用的方式并入本文中。这使得能够用大量包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的试剂选择性标记实际上任何蛋白质。也参看标题为"Glycoproteinsynthesis"的美国专利第6,927,042号，其是以引用的方式并入本文中。可与hGH连接的分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括但不限于，聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、聚核苷酸(包括但不限于，DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物和其类似物〃本发明提供通过选择性修饰蛋白质产生的非天然氨基酸多肽配方，其涉及遗传并入非天然氨基酸。///.^体/^产主包##基齿薪码游賓基凝游AG//多it可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶加入或取代并非天然存在的系统中编码的氨基酸于活体内产生本发明的hGH多肽。使用并非天然存在的系统中编码的氨基酸产生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于相对于翻译系统为内源性的合成酶和tRNA起作用(且因此有时称为"正交")的翻译机器。通常，翻译系统包含f.交tRNA(0-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先以翻译系统中的至少一种非天然存在的氨基酸使O-tRNA氨基乙酰化，且O-tRNA识别所述系统中的其它tRNA不识别的至少一种选择性密码子。因此，翻译系统对所编码的选择性密码子起反应将非天然编码的氨基酸插入所述系统中所产生的蛋白质中，由此将氨基酸"取代入"所编码的多肽中的位置中。用于将特定的合成氨基酸插入到多肽中的技术中己描述多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，且一般适用于本发明中。举例而言，酮基特异性O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶己描述于Wang,L.等人，Proc.Wa".爿cad"X4100:56-61(2003)和Zhang，Z.等人，肠cA亂42(22):6735誦6746(2003)中。示范性O-RS或其部分是通过聚核苷酸序列编码，且其包括美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的氨基酸序列，所述专利各自以引用的方式并入本文。与O-RS—起使用的相应O-tRNA分子也描述于例如美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。叠氮基特异性0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶系统的实例摇述于Chin,J.W.等人/爿附.C力亂5bc,124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的示范性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNOs:14-16和29-32和氨基酸序列SEQIDNOs:46-48和61-64，所述专利是以引用的方式并入本文中。其它O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNOs:1-3，所述专利是以引用的方式并人本文中。对特定非天然编码的氨基酸具恃异性的0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，其是以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基氨基酸与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人，Sczewce301:964-967(2003)中。已报导若干其它正交对。已描述潜在并入大肠杆菌中的非天然氨基酸的源自酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰基(例如参看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U,S.A.96:4780-4785)、天冬氨酰基(例如参看Pastrnak，M.等人，(2000)Helv.Chim.Acta83:2277-2286)和酪氨酰基(例如参看Ohno,S.等人，(1998)J.Biochem.(Tokyo.Jpn.)124:1065-1068;禾口Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)系统。已描述源自大肠杆菌谷氨酰基(例如参看Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)和酪氨酰基(例如参看Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶用于酿酒酵母中。已将大肠杆菌酪氨酰基系统用于哺乳动物细胞活体内并入3-碘-L-酪氨酸。参看Sakamoto,K.等人，(2002)NucleicAcidsRes.30:4692-4699。使用0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶涉及选择编码非天然编码的氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但一般需要选择稀少或从未用于表达0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的细胞中的密码子。举例而言，示范性密码子包括无义密码子，诸如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)；四个或四个以上碱基密码子；和稀少或未经使用的其它天然的三碱基密码子。可使用此项技术中已知的突变诱发方法(包括但不限于，位点特异性突变诱发、盒式突变诱发、限制性选择性突变诱发等)将特定的选择性密码子引入hGH多肽编码序列的适当位置中。用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质合成机器组份(诸如0-RS、0-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang,L.等人，Sc/e"ce292:498-500(2001);Chin,j.W.等人，丄4m.C/zem.Soc.124:9026-9027(2002);Zhang,Z等人，历oc力em&^y42:6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然编码的氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，其是以引用的方式并入本文中。用于选择有机体活体内翻译系统中所使用的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。标题为"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的PCT公开案第W004/035743号(其是以其全文引用的方式并入本文中)中描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公开案第W004/094593号(其是以其全文引用的方式并入本文中)中描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。所述方法也于标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专利申请案第11/046,432号中进行详细描述，所述专利是以引用的方式并入本文中。产生正交tRNA和RS对的方法中所使用的有机体包含各种有机体和各种组合。举例而言，所述方法的第一和第二有机体可相同或不同。在一实施例中，有机体视情况为原核有机体，包括(但不限于)詹氏伊谅球^(M"/w"ococo^ya""^c/^)、礞濕^孝伊^^^7^麥(MeZ/w"o&(3Ceri"w^jermoaw^^ro/>/n'cwm)、凝端〃,忿嚴(//a/o6ac化n.wm)、(Esc/^n'c/u^co/0、A/;^才f球蘑(A/w/g,Wiw)、蔵！织游艰蘑(P/w"'o^s)、薪遂仗濕;/身(Z5/^〃义MA")、邀〃氛药/f"裒3一4.磨(/1/7^"/.r)、寧,辨^;韵磨(ZMerwo/力z7z")或其类似物。或者，有机体视情况包括真核有机体，包括(但不限于)植物(包括但不限于，复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括但不限于，酵母等)、动物(包括但不限于，哺乳动物、昆虫、节肢动物等)或其类似动物。在另一实施例中，第二有机体为原核有机体，包括(但不限于)唐"氏伊錄球^"、嗜.熟^养伊;綜,^、极凝寧i蘑、犬應,^、/Vi才f承^、极耢〃#^^、蔵,《欢燕球^、嚴遂汰效球朦、^^礞濕霱賓才f葸、〃氛教^:教慮或其类似物。或者，第二有机体可为真核有机体，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、菌类、哺乳动物细胞或其类似物。在各种实施例中，所述第一有机体与第二有机体不同。K求天然存在效募基麽fAG好多l^游泣f本发明预期将一个或一个以上非天然存在的氨基酸并入hGH多肽。可将一个或一个以上非天然存在的氨基酸并入不破坏多肽活性的特定位置处。这可通过进行"保守性"取代达成，包括(但不限于)以疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，体积大的氨基酸取代体积大的氨基酸、亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或将非天然存在的氨基酸插入为活性不需的位置中。hGH的区域可描述于下，其中hGH中的氨基酸位置是通过中间一行(美国专利申请案第11/046,432号中的SEQIDNO:2，所述专利是以引用的方式并入本文中)指示螺旋A螺旋B螺旋C螺旋D-[34-74]-[75-96]-[97-105〗-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]N端A-B环B-C环C-D环C端可使用各种生物化学方法和结构方法选择hGH多肽内以非天然编码的氨基酸进行取代的所需位点。所属领域技术人员易于显而易见，多肽链的任何位置都适于选择用于并入非天然编码的氨基酸，且选择可基于合理设计或出于任何或非特别需要的目的随机选择。选择所需位点可用于产生具有任何所需特性或活性的hGH分子(包括(但不限于)激动剂、超强激动剂(super-agonist)、反相激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂)、形成二聚体或多聚体、与天然分子相比不改变活性或特性或操纵多肽的任何物理或化学特性(诸如溶解性、聚集或稳定性)。举例而言，可使用此项技术中已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同源物扫描方法鉴别hGH多肽的生物活性所需的多肽位置。例如参看Cunningham,B.和Wells,J.，Sc&wce,244:1081-1085(1989)(鉴别对于hGH生物活性至关重要的14个残基)禾口Cunningham,B.等人Sc/ewce243:1330-1336(1989)(使用同源物扫描突变诱发鉴别抗体和抗体表位)。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6，428,954号和第6,451,561号(其是以引用的方式并入本文)中描述通过用目标物质鉴别影响多肽活性的活性结构域系统性分析多肽(诸如hGH)结构和功能的方法。除那些通过丙氨酸或同源物扫描突变诱发鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可为以非天然编码的氨基酸进行取代的良好候选物，此视所寻求的多肽的所需活性而定。或者，鉴别为对生物活性至关重要的位点也可为以非天然编码的氨基酸进行取代的良好候选物，此也视所寻求的多肽的所需活性而定。另一替代选择将使得能够以非天然编码的氨基酸于多肽链上各位置中进行一系列取代，并且观察多肽活性的作用。所属领域技术人员将易于显而易见，用于将经非天然氨基酸取代的位置选择到任何多肽中的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。也可检验含有缺失的天然存在的hGH多肽突变体的结构和活性，以测定可能耐受以非天然编码的氨基酸进行的取代的蛋白质区域。例如参看Kostyo等人，历oc力e附.^op/y^.925:314(1987);Lewis,U.等人/历o/.C7zera.'253:2679-2687(1978)有关hGH的内容。以类似方式，可使用蛋白酶消化和单克隆抗体鉴别引起hGH受体结合的hGH区域。例如参看Cunningham,B.等人5We"ce243:1330-1336(1989);Mills,J.等人，五"docn'"o/ogy,107:391-399(1980);Li,C,Mo/.Ce〃.历oc/e肌，46:31-41(1982)(表明可缺失残基134与149之间的氨基酸而不会损失活性)。已去除可能不耐受以非天然编码的氨基酸进行的取代的残基后，可由hGH的三维晶体结构和其结合蛋白检验每一剩余位置处所建议的取代的影响。参看deVos,A.等人，Sdewce，255:306-312(1992)有关hGH内容；所有晶体结构的hGH都可于蛋白质数据库(ProteinDataBank)(包括3HHR、1AXI和1HWG)(PDB，.可于国际互联网rcsb.org得到)中得到，所述蛋白质数据库为含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的中央数据库。因此，所属领域技术人员可易于鉴别可经非天然编码的氨基酸取代的氨基酸位。在一些实施例中，本发明的hGH多肽包含一个或一个以上定位于不破坏多肽螺旋或卩折叠二级结构的蛋白质区域中的非天然存在的氨基酸。并入非天然编码的氨基酸的示范性残基可为从潜在受体结合区域(包括但不限于，位点I和位点II)排除、可完全或部分暴露到溶剂、与邻近残基具有最小或无氢键相互作用、可在最小限度上暴露到邻近反应性残基并且可在如通过hGH多肽与其受体结合或未与其结合的三维晶体结构、二级、三级或四级结构所预测具高度灵活性(包括但不限于，C-D环)或结构上具刚性(包括但不限于，B螺旋)的区域中的那些残基。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入与hGH二级结构对应的一个或一个以上以下区域中的任何位置处与SEQIDNO:2中1-5(N端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，g卩A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，即B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，即C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C端)对应的位置。在其它实施例中，GH多肽(例如，本发明的hGH多肽)包含至少一个经位于GH(例如hGH)的至少一个区域中的至少一个氨基酸取代的非天然存在的氨基酸，所述至少一个区域是选自由与SEQIDNO:2中N端(1-5)、A-B环的N末端(32-46)、B-C环(97-105)、C-D环(132-149)和C端(184-191)对应的区域组成的群组。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入GH(例如hGH)以下位置的一个或一个以上位置处SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的第1位前(意即，在N端)、I位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白质的羧基端)。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的29位、30位、33位、34位、35位、37位、39位、40位、49位、57位、59位、66泣、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、122位、126位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、159位、183位、186位和187位或其任何组合对应的位点。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的子集包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的29位、33位、35位、37位、39位、49位、57位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、186位和187位或其任何组合对应的位点。对于GH(例如hGH)和其与GH(例如hGH)受体相互作用的晶体结构的检验表明，这些氨基酸残基的侧链完全或部分与溶剂接近且非天然编码的氨基酸的侧链可指向蛋白质表面外并且指向溶剂中。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位置包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、88位、91位、92位、94位、95位、99位、101位、103位、111位、131位、133位、134位、135位、136位、139位、140位、143位、145位和155位或其任何组合对应的位点。对于GH(例如hGH)和其与GH(例如hGH)受体相互作用的晶体结构的检验表明，这些氨基酸残基的侧链完全暴露至溶剂且天然残基的侧链指向溶剂中。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的子集包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的30位、74位、103位或其任何组合对应的位点。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的另一子集包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何组合对应的位点。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的另一子集包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何组合对应的位点。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的又一子集包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何组合对应的位点。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的另一子集包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何组合对应的位点。在某些实施例中，并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的位点包括与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位对应的位点。在一些实施例中，并入GH(例如hGH)中的非天然编码的氨基酸中的至少一者含有羰基，例如酮基。在某些实施例中，至少一个并入GH(例如hGH)中的非天然编码的氨基酸中的为对乙酰苯丙氨酸。在GH(例如hGH)含有多个非天然编码的氨基酸的一些实施例中，一个以上并入GH(例如hGH)中的非天然编码的氨基酸为对乙酰苯丙氨酸。在GH(例如hGH)含有多个非天然编码的氨基酸的一些实施例中，实质所有并入GH(例如hGH)中的非天然编码的氨基酸为对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在一个或一个以上位置处与水溶性聚合物连接，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置第l位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白质的羧基端)(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在一定位置处与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于与一个或一个以上这些位置对应的位置30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在一定位置处与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于与一个或一个以上这些位置对应的位置35位、92位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在一定位置处与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于与一个或一个以上这些位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何组合。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在一定位置处与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于与一个或一个以上这些位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何组合。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在一定位置处与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于一个或一个以上这些位置对应的位置与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何组合。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在对应于(但不限于)SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位的位置处与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，与GH(例如hGH)连接的水溶性聚合物包括一个或一个以上聚乙二醇分子(PEG)。聚合物(例如PEG)可为线性或分枝聚合物。通常，本发明中所使用的线性聚合物(例如PEG)的MW可为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。通常，本发明中所使用的分枝聚合物(例如PEG)的MW可为约1kDa到约100kDa，或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。聚合物(诸如PEG)将于本文中进一歩进行描述。在某些实施例中，GH(例如hGH)与水溶性聚合物(例如PEG)之间的键为肟键。本发明的某些实施例涵盖包括通过共价键与至少一个水溶性聚合物连接的GH(例如hGH)的组合物，其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，水溶性聚合物为PEG，例如线性PEG。在涵盖至少一个通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的一些实施例中，PEG的MW可为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的某些实施例中，PEG的MW为约30kDa。在涵盖至少一个通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的一些实施例中，PEG的MW可为约1kDa到约100kDa,或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG的MW为约40kDa。在一些实施例中，所述GH为GH，例如hGH;且在部分这些实施例中，所述GH(例如，hGH)具有至少约80%与SEQIDNO:2相同的序列；在一些实施例中，所述GH(例如，hGH)具有为SEQIDNO:2序列的序列。在一些实施例中，所述GH(例如，hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸；在部分这些实施例中，至少一个肟键是介于非天然编码的氨基酸与至少一个水溶性聚合物之间。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸含有羰基，诸如酮基；在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，对乙酰苯丙氨酸在与SEQIDNO:2的35位对应的位置处经取代。因此，在一些实施例中，本发明提供通过共价键与至少一个水溶性聚合物连接的GH(例如hGH)，其中所述共价键为后键。在某些实施例中，水溶性聚合物为PEG，且所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG的MW为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的某些实施例中，PEG的MW为约30kDa。在某些实施例中，水溶性聚合物为作为分枝PEG的PEG。在这些实施例中，分枝PEG的MW为约1kDa到约100kDa,或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG的MW为约40kDa。在一些实施例中，本发明提供GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)含有非天然编码的氨基酸，其中所述GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)连接，且其中所述共价键为介于非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将非天然编码的氨基酸并入GH(例如hGH)中与SEQIDNO:2中35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG的MW为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的某些实施例中，PEG的MW为约30kDa。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG的MW为约1kDa到约100kDa，或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG的MW为约40kDa。在一些实施例中，本发明提供GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)含有非天然编码的氨基酸，其为含羰基的非天然编码的氨基酸；其中所述GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)连接，且其中所述共价键为介于非天然编码的含羰基氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将非天然编码的含羰基氨基酸并入GH(例如hGH)中与SEQIDNO:2中35位对应的位置处。2.在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG的MW为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的某些实施例中，PEG的MW为约30kDa。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG的MW为约1kDa到约100kDa，或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG的MW为约40kDa。在一些实施例中，本发明提供含有包括酮基的非天然编码的氨基酸的GH(例如hGH)，其中所述GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)连接，且其中所述共价键为介于含有酮基的非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将含有酮基的非天然编码的氨基酸并入GH(例如hGH)中与SEQIDNO:2中35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG的MW为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的某些实施例中，PEG的MW为约30kDa。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG的MW为约1kDa到约100kDa，或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG的MW为约40kDa。在一些实施例中，本发明提供含有非天然编码的氨基酸(其为对乙酰苯丙氨酸)的GH(例如hGH)，其中所述GH是通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)连接，且其中所述共价键为介于对乙酰苯丙氨酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将对乙酰苯丙氨酸并入GH(例如hGH)中与SEQIDNO:2中35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG的MW为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的线性PEG的某些实施例中，PEG的MW为约30kDa。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，所述PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG的MW为约1kDa到约100kDa，或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。在涵盖通过肟键与GH(例如hGH)连接的分枝PEG的某些实施例中，PEG的MW为约40kDa。在某些实施例中，本发明提供包括SEQIDNO:2的GH(例如hGH)，且其中所述GH(例如hGH)在与SEQIDNO:2中35位对应的位置处经通过肟键与MW为约30kDa的线性PEG连接的对乙酰苯丙氨酸取代。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置第1位前(意即，在N端)、l位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白质的羧基端)(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDN0:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置35位、92位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH),其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处经取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位对应的位置。在PEG为线性PEG的实施例中，所述PEG的MW可为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa,或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置第l位前(意即，在N端)、l位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位.、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、l卯位、191位、192位(意即，在蛋白质的羧基端)(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置30位、35位、74位、92位、103位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置35位、92位、143位、145位(SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO1或3的相应氨基酸的35位、92位、131位、134位、143位、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的30位、35位、74位、92位、103位、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与以下位置对应的位置SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸的35位、92位、143位、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括通过肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)连接的GH(例如hGH),其中所述GH(例如hGH)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其为在一个或一个以上位置处经取代的对乙酰苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35位对应的位置。在PEG为线性PEG的实施例中，所述PEG的MW可为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在一些实施例中，本发明提供GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)含有至少一个非天然编码的氨基酸，其中所述GH是通过共价键与多个水溶性聚合物(例如多个PEG)连接，其中一个或一个以上所述共价键为介于非天然编码的氨基酸的至少一者与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。所述GH(例如hGH)可与约2-100个水溶性聚合物(例如PEG)，或约2-50个水溶性聚合物(例如PEG)，约2-25个水溶性聚合物(例如PEG),或约2-10个水溶性聚合物(例如PEG),或约2-5个水溶性聚合物(例如PEG),或约5-100个水溶性聚合物(例如PEG),或约5-50个水溶性聚合物(例如PEG),或约5-25个水溶性聚合物(例如PEG)，或约5-10个水溶性聚合物(例如PEG),或约10-100个水溶性聚合物(例如PEG),或约10-50个水溶性聚合物(例如PEG),或约10-20个水溶性聚合物(例如PEG),或约20-100个水溶性聚合物(例如PEG),或约20-50个水溶性聚合物(例如PEG)，或约50-100个水溶性聚合物(例如PEG)连接。可将所述一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入GH(例如hGH)中本文所述的任何位置处。在一些实施例中，将至少一个非天然编码的氨基酸并入GH(例如hGH)中与SEQIDNO:2中35位对应的位置处。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括至少一个非天然编码的氨基酸，其为含羰基的非天然编码的氨基酸，例如含酮基的非天然编码的氨基酸，诸如对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，GH(例如hGH)包括对乙酰苯丙氨酸。在一些实施例中，将对乙酰苯丙氨酸并入GH(例如hGH)中与SEQIDNO:2中35位对应的位置处，其中所述对乙酰苯丙氨酸是通过肟键与所述聚合物中的一者(例如所述PEG中的一者)连接。在一些实施例中，水溶性聚合物(例如PEG)中的至少一者是通过与非天然编码的氨基酸中至少一者的共价键与GH(hGH)连接。在一些实施例中，所述共价键为肟键。在一些实施例中，多个水溶性聚合物(例如PEG)是通过与多个非天然编码的氨基酸的共价键与GH(hGH)连接。在一些实施例中，至少一个共价键为肟键；在一些实施例中，多个共价键为肟键；在一些实施例中，实质所有所述键为肟键。所述多个水溶性聚合物(例如PEG)可为线性聚合物、分枝聚合物或其任何组合。在并入一个或一个以上线性PEG的实施例中，所述线性PEG的MW为约0.1kDa到约100kDa，或约1kDa到约60kDa，或约20kDa到约40kDa，或为约30kDa。在并入一个或一个以上分枝PEG的实施例中，所述分枝PEG的MW为约1kDa到约100kDa，或约30kDa到约50kDa，或为约40kDa。应了解，使用多个水溶性聚合物(例如PEG)的实施例大体上将使用MW比使用单一PEG的实施例中PEG的MW低的聚合物。因此，在一些实施例中，多个PEG的总MW为约0.1-500kDa，或约0.1-200kDa，或约0.1-100kDa，或约1-1000kDa，或约1-500kDa，或约1-200kDa，或约1-100kDa，或约10-1000kDa，或约10-500kDa，或约10-200kDa,或约10-100kDa，或约10-50kDa，或约20-1000kDa，或约20-500kDa，或约20-200kDa，或约20-100kDa，或约20-80kDa，约20-60kDa，约5-100kDa，约5-50kDa或约5-20kDa。人GH拮抗剂包括(但不限于)在1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、103位、109位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、123位和127位具有取代或在1位(意即，N端)具有添加或其任何组合(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3中的相应氨基酸，或任何其它GH序列)的拮抗剂。多种非天然编码的氨基酸可在hGH多肽的指定位置经取代或并入hGH多肽的指定位置中。总的说来，选择特定非天然编码的氨基酸用于基于对hGH多肽与其受体的三维晶体结构的检查进行的并入，优先用于保守性取代(意即，取代Phe、Tyr或Trp的含芳基非天然编码的氨基酸，诸如对乙酰苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)和需要引入hGH多肽中的特定接合化学(例如，当需要实现Hmsgen[3+2]与具有炔部分的水溶性聚合物的环加成或与具有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺键随后并入膦部分时，引入4-叠氮基苯丙氨酸)。在一实施例中，'所述方法另外包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；及使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括但不限于，标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖类、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼锁部分、光化辐射可激发部分、光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、化学可裂解基团、光可裂解基团、延长的侧链、经碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记部分、生物物理学探针、发磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传导物、放射性核苷酸、无线电传导物、中子俘获剂或上述物质的任何组合或任何其它所需化合物或物质)接触。在一些情况下，将使非天然编码的氨基酸取代与hGH多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响hGH多肽的其它生物特质。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加hGH多肽的稳定性(包括但不限于，对蛋白水解降解的抗性)或增加hGH多肽对其受体的亲和性。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加hGH多肽的溶解性(包括但不限于，当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可在大肠杆菌或其他重组宿主细胞中表达后增加多肽的溶解性。在一些实施例中，除对并入在大肠杆菌或其他重组宿主细胞中表达后导致多肽溶解性增加的非天然氨基酸的另一位点进行选择外，还选择经天然编码或非天然编码的氨基酸取代的位点。在一些实施例中，hGH多肽包含调节对hGH多肽受体的亲和性、调节(包括但不限于，增加或降低)受体二聚化、使受体二聚体稳定、调节循环半衰期、调节释放或生物利用度、便利纯化或改良或改变特定投药途径的另一添加、取代或缺失。多种所述改变已于标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专利申请案第11/046,432号中得以描述，所述专利是以其全文引用的方式并入本文中。类似地，hGH多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于，FLAG或聚His)或其它基于亲和性的序列(包括但不限于，FLAG、聚His、GST等)或改良对于多肽的检测(包括但不限于，GFP)、纯化或其它特质的连接分子(包括但不限于，生物素)。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸的取代产生GH(例如hGH)拮抗剂。用于并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的示范性位点的子集包括l位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、103位、109位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、123位、127位或1位前(SEQIDNO:2或SEQIDNO:l、3的相应氨基酸或任何其它GH序列)添加。在一些实施例中，GH(例如hGH)拮抗剂包含至少一个在使GH充当拮抗剂的区域1-5(N端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，即A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，即B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，即C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C端)中进行的取代。在其它实施例中，并入非天然编码的氨基酸的示范性位点包括螺旋A的氨基末端区与一部分C螺旋内的残基。在另一实施例中，以非天然编码的氨基酸(诸如对-叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代G120。在其它实施例中，使上文所列的取代与使GH(例如hGH多肽)成为GH(例如hGH)拮抗剂的额外取代组合。举例而言，非天然编码的氨基酸是在本文所鉴别的一个位置处经取代，且同时在G120(例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)处引入取代。在一些实施例中，GH(例如hGH)拮抗剂包含与存在于GH(例如hGH)分子的受体结合区中的水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸。在一些情况下，l个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个或IO个以上氨基酸经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代。在一些情况下，GH(例如hGH)多肽另外包括以一个或一个以上非天然编码的氨基酸对天然存在的氨基酸进行1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上取代。举例而言，在一些实施例中，GH(例如hGH)的以下区域中的一个或一个残基经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代1-5(N端)、32-46(A-B环的N末端)、97-105(B-C环)禾卩132-149(C-D环)禾D184-191(C端)。在一些实施例中，GH(例如hGH)的以下区域中的一个或一个以上残基经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代1-5(N端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区域，即A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区域，即B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区域，即C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C端)。在一些情况下，所述一个或一个以上非天然编码的残基与一个或一个以上具有较低分子量的线性或分枝PEG(质量为约5-20kDa或更低)连接，从而相对于连接到单一较高分子量PEG的物质使结合亲和性得以增强且具有可比较的血清半衰期。在一些实施例中，以下位置处的GH(例如hGH)残基中至多两个经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代29位、30位、33位、34位、35位、37位、39位、40位、49位、57位、59位、(56位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、122位、126位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、159位、183位、186位和187位。在一些情况下，进行以下取代对的任一者&38乂*与K140X*;K41Xf与K145X*;Y35X承与E88X承；Y35X糸与F92X*;Y35X氺与Y143X*;F92X承与Y143X*,其中乂*表示非天然编码的氨基酸。并入两个或两个以上非天然编码的氨基酸的优选位点包括以下残基的组合29位、33位、35位、37位、39位、49位、57位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、98位、99位、101位、103位、107位、108位、111位、129位、130位、131位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、141位、142位、143位、145位、147位、154位、155位、156位、186位和187位。用于并入两个或两个以上非天然编码的氨基酸的特别优选的位点包括以下残基的组合35位、88位、91位、92位、94位、95位、99位、101位、103位、111位、131位、133位、134位、135位、136位、139位、140位、143位、145位和155位。用于并入具有两个或两个以上非天然编码的氨基酸的GH(例如hGH)中的优选位点包括以下残基的组合SEQIDNO:2第1位前(意即，在N端)、1位、2位、3位、4位、5位、8位、9位、11位、12位、15位、16位、19位、22位、29位、30位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、52位、55位、57位、59位、65位、66位、69位、70位、71位、74位、88位、91位、92位、94位、95位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、111位、112位、113位、115位、116位、119位、120位、122位、123位、126位、127位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、158位、159位、161位、168位、172位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位(意即，在蛋白质的羧基端)或其任何组合。K絲樣主激赠齢激顿就为获得经克隆hGH多肽的高水平表达，将编码本发明的hGH多肽的聚核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有用于直接转录的强启动子、转录/翻译终止子，且如果对于编码蛋白质的核酸而言，还含有用于翻译起始的核糖体结合位点。所属领域技术人员已知适当的细菌启动子，且例如描述于Sambrook等人MolecularCloning,ALaboratoryManual(200l)和Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology(1999)中。用于表达本发明的hGH多肽的细菌表达系统可利用包括(但不限于)丈應,蘑、^"應^蘑(万"c/〃M)、,i俊卓應蘑(AeWomo"似_/7"o,esce/w)、銜绿,卓應蘑(尸"Mrfomoracwaerag/wtm)、恋4俊卓應麥(jRsewt/o歸W(M/wf油)禾口沙/7历虔(5W歸we〃a)中者(Palva等人，Gene22:229-235(1983);Mosbach等人，Nature302:543-545(1983))。所述表达系统的试剂盒为市售。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为己为所属领域技术人员所知且也为市售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上文所述)表达本发明的hGH多肽的情况下，供表达的宿主细胞是基于其使用正交组份的能力选择。示范性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(Gram-positivebacteria)(包括但不限于，顏，潜,^(^e心)、祐草免敏,,(5.w&"fe)或链霉^(幼^o，c"))及革兰氏阴性细菌(丈嚴/,蘑、^i俊卓應蘑(尸^w/卿o"mywomyce/M)、欽泰俊卓應萝(尸sra(io腳rt(Waeragz'wojfl)、,^俊卓應虔(尸sei^omowfiW/n^'&))以及酵母和其他真核细胞。可使用如本文所述的包含0-tRNA/0-RS对的细胞。本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含极大有用量的非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视情况包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包含非天然氨基酸的蛋白质，或可以活体内蛋白质制造方法(详见本文提供的重组蛋白质制造和纯化方法)达成的量的蛋白质。另一方面，所述蛋白质视情况以包括(但不限于)每升包括(但不限于)细胞溶解产物、缓冲剂、医药学缓冲剂或其它液体悬浮液(包括但不限于，包括但不限于约1nl到约100L或100L以上的任一体积)中至少10微克蛋白质、至少50微克蛋白质、至少75微克蛋白质、至少100微克蛋白质、至少200微克蛋白质、至少250微克蛋白质、至少500微克蛋白质、至少1毫克蛋白质或至少10毫克蛋白质的浓度存在于组合物中。在真核细胞中制造大量(包括但不限于，高于以包括但不限于活体外翻译的其它方法通常可能产生的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质为本发明的一个特征。本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包含极大有用量的非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例而言，可制造出包括(但不限于)每升细胞提取液、细胞溶解产物、培养基、缓冲液和/或类似物至少10)!g、至少50pg、至少75pg、至少100pg、至少200ng、至少250|xg或至少500(ig、至少1mg、至少2mg、至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少6mg、至少7mg、至少8mg、至少9mg、至少10mg、至少20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g或10g以上蛋白质的浓度的包含非天然氨基酸的蛋白质。表达系统、载体、宿主细胞、培养条件和培养基和与hGH多肽宿主细胞的分离己于标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专利申请案第11/046,432号中进一步描述，所述专利是以引用的方式并入本文中。K層錄众減本发明的hGH多肽通常是在重组系统中表达后经纯化。可通过此项技术已知的多种方法从宿主细胞中纯化出hGH多肽。细菌宿主细胞中产生的hGH多肽可具有弱溶解性或不溶(包涵体的形式)。可易于利用本文所揭示的方法和此项技术中已知的方法对hGH多肽进行氨基酸取代，所述取代是出于增加重组产生的蛋白质的溶解性的目的选择。在蛋白质不溶的情况下，可通过离心从宿主细胞溶解产物中收集蛋白质，且随后可进一步使细胞均质化。在蛋白质具弱溶解性的情况下，可加入包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱使部分可溶蛋白质沉淀。随后，可通过离心便利地收集已沉淀的蛋白质。可使用所属领域技术人员己知的多种方法破碎重组宿主细胞或使其均质化以从所述细胞内释放包涵体。可使用所属领域技术人员已知的技术执行宿主细胞的破碎或均质化，所述技术包括(但不限于)以酶破碎细胞、超声波处理、杜恩斯均质化(doimcehomogenization)或高压释放破碎。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术破碎大肠杆菌宿主细胞，从而释放hGH多肽的包涵体。当处理hGH多肽的包涵体时，有益的使重复的均质化时间减到最小，以便使包涵体的产量最大化，而不会因诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素而有所损失。接着，可使用此项技术中已知的多种适当增溶剂中的任一种溶解不溶或已沉淀的hGH多肽。可以尿素或盐酸胍溶解hGH多肽。应使溶解的hGH多肽的体积减到最小，从而能够便利地使用易处理的批量大小制造大批量。这一因素对于可以数千升体积成批生长重组宿主的大规模商业工厂而言尤为重要。此外，当在大规模商业工厂中制造hGH多肽、尤其供人类使用的医药时，如可能，应当避免可损坏机器和容器或蛋白制品本身的有害化学物质。本发明的方法中已表明，可使用较温和的变性剂尿素替代较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解hGH多肽包涵体。使用尿素在有效溶解hGH多肽包涵体的同时也显著减小损坏hGH多肽的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备的风险。在可溶hGH蛋白的情况下，可将hGH分泌到细胞周质间隙或培养基中。此外，可溶hGH可存在于宿主细胞的细胞质中。在执行纯化步骤甜可能需要浓縮可溶hGH。可使用所属领域技术人员已知的标准技术从例如细胞溶解产物或培养基中浓縮可溶hGH。此外，可使用所属领域技术人员已知的标准技术破碎宿主细胞，并且将可溶hGH从宿主细胞的细胞质或细胞周质间隙中释放出来。当将hGH多肽制造为融合蛋白时，可去除融合序列。可通过酶裂解或化学裂解实现融合序列的去除。可使用所属领域技术人员已知的方法实现融合序列的酶去除。对于去除融合序列的酶的选择将通过融合物的身份确定，且如所属领域技术人员将显而易见，反应条件将通过酶的选择予以确定。化学裂解可使用所属领域技术人员已知的试剂(包括但不限于溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂)实现。可通过所属领域技术人员已知的方法从经裂解的融合序列中纯化出所裂解的hGH多肽。如所属领域技术人员将显而易见，所述方法将通过融合序列和hGH多肽的身份和特性确定。用于纯化的方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法或透析法，或其任何组合。也可纯化hGH多肽，从而将DNA从蛋白质溶液中去除。DNA可通过此项技术中已知的任何适当方法(诸如沉淀或离子交换色谱法)予以去除，且也可通过用核酸沉淀剂(诸如但不限于硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除。可使用所属领域技术人员已知的标准方法使hGH多肽与已沉淀的DNA分离，包括但不限于，离心或过滤。去除宿主核酸分子对于将使用hGH多肽治疗人类的工厂而言为一重要因素，而且本发明的方法会将宿主细胞DNA减少到医药学上可接受的程度。小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，包括(但不限于)发酵罐、摇瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养系统和搅拌罐生物反应器系统。这些方法的每一种都可在分批、馈料分批或连续模式工艺中执行。一般可使用此项技术中的标准方法回收本发明的人hGH多肽。举例而言，可将培养基或细胞溶解产物离心或过滤以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积，或将其透滤到适当缓冲液中以调节制剂供进一歩纯化。进一步纯化本发明的hGH多肽包括使去酰胺化和剪短形式的hGH多肽变异体与完整形式分离。以下示范性程序中的任一者都可用于纯化本发明的hGH多肽亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(包括但不限于使用DEAESEPHAROSE);二氧化硅色谱；高效液相色谱(HPLC);反相HPLC(RP-HPLC);凝胶过滤色谱(包括但不限于使用SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱焦聚；置换色谱；电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)；差别溶解性(differentialsolubility)(包括但不限于硫酸铵沉淀);SDS-PAGE;或萃取。根据所属领域技术人员已知和使用的标准程序，可部分或实质完全将本发明的蛋白质纯化成均质，所述蛋白质包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等。因此，可通过所属领域技术人员已知的多种方法中的任一种回收并纯化本发明的多肽，所述方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳和其类似方法。可视需要将蛋白质再折叠步骤用于制造正确折叠的成熟蛋白质。当需要高纯度时，可在最终纯化步骤中使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适当方法。在一实施例中，将所制造的抗非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质)的抗体用作纯化试剂包括(但不限于)用于包含一种或一种以上非天然氨基酸的蛋白质的基于亲和性的纯化。部分纯化或纯化成均质后，视需要，将多肽视情况用于多种用处，包括(但不限于)用作检定组份、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为抗体制造的免疫原。除本文所述的其它参考文献外，多种纯化/蛋白质折叠方法也已为所属领域技术人员所知，包括(但不限于)以下参考文献中所述的那些方法R.Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag，N.Y.(1982);Deutscher,MethodsinEnzymologv第182巻GuidetoProteinPurification,AcademicPress,Inc.N.Y,(1990);Sandana,(1997)BioseparationofProteins,AcademicPress,Inc.;Bollag等人(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss,NY;Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ，HarrisandAngal,(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Harris禾口Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag，NY;JansonandRyden,(1998)ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethodsandArmlications,第2版Wiley-VCH,NY;禾口Walker(1998),ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ:和本文所引用的参考文献。在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中以非天然氨基酸制造所需蛋白质或多肽的一个优势在于所述蛋白质或多肽通常将以其天然构象折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域技术人员将认识到，合成、表达和/或纯化后，蛋白质可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明一方面中，视情况使所表达的蛋白质变性且随后使其复性。这是利用此项技术中已知的方法实现，包括(但不限于)通过将伴侣素加入所需蛋白质或多肽中、通过将蛋白质溶解于离液剂(诸如盐酸胍)中、利用蛋白质二硫键异构酶等。总的说来，有时需要使所表达的多肽变性和还原，且随后使所述多肽再折叠成优选构象。举例而言，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣素加入所需翻译产物中。还原、变性和复性蛋白质的方法已为所属领域技术人员所知(参看，上述参考文献和Debinski,等人(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman禾nPastan(1993)Bioconiug.Chem..4:581-585:和Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。举例而言，Debinski等人描述在胍-DTE中变性和还原包涵体蛋白。可在含有包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠蛋白质。可注入或另外移入再折叠试剂以与所述一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或可注入或另外移入所述一种或一种以上多肽或其它表达产物以与再折叠试剂接触。在以原核生物制造hGH多肽的情况下，由此制造的hGH多肽可能折叠异常，且因此缺乏或具有降低的生物活性。所述蛋白质的生物活性可通过"再折叠"恢复。一般说来，通过例如使用一种或一种以上离液剂(例如，尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如，二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中hGH多肽也不溶)、伸展和还原多肽链使折叠异常的hGH多肽再折叠。接着，在适度浓度的离液剂下，加入氧化剂(例如，氧、胱氨酸或胱氨)，这使得再形成二硫键。可使用此项技术中已知的标准方法使hGH多肽再折叠，诸如美国专利第4,511,502号、第4，511，503号和第4,512,922号中所述的方法，所述专利是以引用的方式并入本文中。也可使hGH多肽与其它蛋白质共折叠以形成杂二聚体或杂多聚体。再折叠或共折叠后，可进一步纯化hGH多肽。hGH的纯化可使用所属领域技术人员已知的多种技术实现，包括疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱和其类似技术或其任何组合。额外纯化也可包括干燥或沉淀经纯化蛋白质的步骤。纯化后，可于不同缓冲液中交换hGH和/或通过所属领域技术人员已知的多种方法中的任一种加以浓縮，所述方法包括(但不限于)透滤和透析。可使以单一经纯化蛋白质形式提供的hGH经历聚集和沉淀。经纯化hGH可为至少90%纯(如通过反相高效液相色谱、RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE测量)或至少95%纯或至少98%纯，或至少99%纯或更高纯度。不管hGH纯度的确切数字值如何，hGH已具有足够纯度以用作医药产品或用于进一歩加工(诸如与诸如PEG的水溶性聚合物接合)。在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白和其类似物外)的情况下可将某些hGH分子用作治疗剂，或可使其与另一蛋白质或聚合物复合。可对细胞溶解产物、提取液、培养基、包涵体、宿主细胞周质间隙、宿主细胞细胞质或包涵hGH多肽的其它材料或对由任何分离步骤产生的任何hGH多肽混合物执行多种分离步骤中的任一种，所述分离步骤包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱("HPLC")、反相HPLC("RP-HPLC")、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复且以任何适当次序。用于执行本文所述的技术的设备和其它必需材料为市售。泵、部分收集器、监测器、记录仪和全系统是例如从AppliedBiosystems(FosterCity,CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)禾口.AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway,NJ)得至U。色i普材料(包括但不限于交换基质材料、媒质和缓冲液)也是从所述公司得到。可使用专用设备(诸如泵)更快速的实现本文所述的柱色谱方法中的平衡和其它步骤(诸如洗涤和洗提)。市售泵包括(但不限于)HILOADPumpP-50、PeristalticPumpP-l、PumpP-901禾口PumpP-90(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。部分收集器的实例包括RediFracFractionCollector、FRAC-100和FRAC-200FractionCollectors禾口SUPERFRACFractionCollector(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。也可用混合机以形成pH值和线性浓度梯度。市售混合机包括GradientMixerGM-1和In陽LineMixer(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可使用任何市售监测器监测色谱过程。可使用所述监测器搜集类似UV、pH值和传导率等信息。监测器的实例包括MonitorUV-l、UVICORDSII、MonitorUV-MII、MonitorUV-900、MonitorUPC-900、MonitorpH/C-900禾卩ConductivityMonitor(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。实际上，全系统为市售，包括AmershamBiosciences(Piscataway,NJ)的各种AKTA⑧系统。例如，在本发明的一个实施例中，可通过首先以尿素使所得纯hGH多肽变性，随后在适当pH值下于含有还原剂(诸如DTT)的TRIS缓冲液中进行稀释来使hGH多肽还原和变性。在另一实施例中，hGH多肽是在介于约2M到约9M之间的浓度范围内的尿素中变性，随后在约5.0到约8.0的范围内的pH值下于TRIS缓冲液中进行稀释。接着，可培育本实施例中的再折叠混合物。在一实施例中，在室温下培育再折叠混合物四小时到二十四小时。接着，可进一步分离或纯化经还原和变性的hGH多肽混合物。如本文所述，可调节第一hGH多肽混合物的pH值，随后执行任何随后的分离步骤。此外，可使用此项技术中已知的技术浓縮第一hGH多肽混合物或其任何随后的混合物。而且，可使用所属领域技术人员已知的技术以适于下一分离歩骤的缓冲液交换包含第一hGH多肽混合物或其任何随后混合物的洗提缓冲液。离子交换色谱可执行离子交换色谱。一般参看IonExchangeChromatography:PrinciplesANDMethods(目录编号18-1114-21,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))。市售离子交换柱包括HITRAP、HIPREP⑧和HILOADColumns(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。所述柱利用强阴离子交换剂，诸如QSEPHAROSEFastFlow、QSEPHAROSEHighPerformance和QSEPHAROSEXL;强阳离子交换剂，诸如SPSEPHAROSEHighPerformance、SPSEPHAROSEFastFlow禾卩SPSEPHAROSEXL;弱阴离子交换剂，诸如DEAESEPHAROSEFastFlow;和弱阳离子交换剂，诸如CMSEPHAROSEFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化工艺的任何阶段对hGH多肽执行阴离子或阳离子交换柱色谱以实质分离纯hGH多肽。可使用任何适当的阳离子交换基质执行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、非多孔、微粒状、珠状或交联阳离子交换基质材料。所述阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何前述材料的复合物。阳离子交换基质可为任何适当的阳离子交换剂，包括强和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂可在宽pH值范围内保持离子化，且因此能够在宽pH值范围内与hGH结合。然而，弱阳离子交换基可随pH值的变化而失去离子化作用。举例而言，当pH值降到约pH4或pH5以下时，弱阳离子交换剂可失去电荷。适当强阳离子交换剂包括(但不限于)带电官能团，诸如磺丙基(SP)、磺酸甲酯(S)或磺乙基(SE)。阳离子交换基质nJ为具有在约2.5到约6.0内的hGH结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可具有在约pH2.5到约pH5.5内的hGH结合pH值范围。阳离子交换基质可为具有约3.0的hGH结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可为具有在约6.0到约8.0内的hGH结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可为具有在约S.0到约12.5内的hGH结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可具有在约pH8.0到约pH12.0内的hGH结合pH值范围。装载hGH之前，例如可使用若干柱体积稀弱酸(例如，4柱体积20mM乙酸，pH3)平衡阳离子交换基质。平衡后，可加入hGH并且可洗涤柱1次到数次，随后也使用弱酸溶液(诸如弱乙酸或磷酸溶液)实质完全洗提纯hGH。举例而言，可使用约2-4柱体积20mM乙酸(pH3)洗涤柱。例如使用2-4柱体积0.05M乙酸钠(pH5.5)或与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠(pH5.5)进行的额外洗涤也可使用。或者，使用此项技术中己知的方法，可使用若干柱体积稀、弱碱平衡阳离子交换基质。另外，可通过使阳离子交换剂基质与具有足够低pH值或离子强度以从基质中置换出hGH的缓冲液接触来洗提实质纯的hGH。洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH6.0的范围内。更具体的说，洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5至约pH5.5，约pH2.5至约pH5.0范围。洗提缓冲液可具有约3.0的pH值。另外，洗提缓冲液的量可广泛变化，并且一般将在约2至约IO柱体积的范围内。此外，所属领域技术人员已知的合适缓冲液可包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM的范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、HEPES和MES缓冲液。将hGH吸附到阳离子交换剂基质上后，可通过使所述基质与具有足够高pH值或离子强度以从所述基质中置换出hGH的缓冲液接触来洗提实质纯的hGH。洗提缓冲液的pH值可在约pH8.0到约pH12.5的范围内。更具体说来，洗提缓冲液的pH值可在约pH8.0到约pH12.0的范围内。用于高pH值洗提实质纯的hGH的适当缓冲液包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约lOOmM的范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。此外，可使用具有0.1M硼酸钾、0.6M氯化钾、0.1MEDTA的缓冲液，pH8.7。也可使用标准缓冲液洗提实质纯的hGH，诸如二甘氨酸缓冲液，其包括约50到100mM二甘氨酸、约75mM二甘氨酸；25到约100mM氯化钠、约50mM氯化钠；和约0.05到约0.5mMEDTA，约0.1mMEDTA(pH7.5)。反相色谱可遵循所属领域技术人员己知的适当方案执行RP-HPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人，ANALBiOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人，J.CHROM.(1983)268:112-119;Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359:391-402。可对hGH多肽执行RP-HPLC以分离出实质纯的hGH多肽。就此点看来，可使用具有具多种长度的垸基官能团的二氧化硅衍生化树脂，包括(但不限于)至少约C3到至少约C3o、至少约C3到至少约C2。或至少约C3到至少约C,8树脂。或者，可使用聚合树脂。举例而言，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种垸基链长度的氰基或聚合树月旨。此夕卜，可以诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。SourceRP柱为RP-HPLC柱的另一实例。可使用含有离子配对剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的适当洗提缓冲液以从RP-HPLC柱中洗提出hGH多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和三乙基乙酸铵。可使用一种或一种以上优选用于减少分离时间和减小峰宽的梯度或与梯度条件相当的条件执行洗提。另一种方法涉及使用两种具有不同溶剂浓度范围的梯度。本文中使用的适当洗提缓冲液的实例包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。可例如使用SOURCERP柱以乙腈梯度分离或纯化hGH。疏水相互作用色谱纯化技术可对hGH多肽执行疏水相互作用色谱(HIC)。一般参看HydrophobicInteractionChromatographyHandbook:PrinciplesandMethods(Cat.No.18-1020-90,AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)，所述文献是以引用的方式并入本文中。适当HIC基质可包括(但不限于)经垸基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，包括琼脂、交联琼脂、琼脂糖、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质；和混合型树脂，包括(但不限于)聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)树脂。疏水相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)HITRAP、HIPREP⑧和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。简单说来，装载前，可使用所属领域技术人员己知的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)平衡HIC柱。可将硫酸铵用作装载HIC柱的缓冲液。装载hGH多肽后，可使用标准缓冲液和条件洗涤所述柱以去除HIC柱上不合需要的物质但剩下hGH多肽。可用约3到约10柱体积的标准缓冲液洗提hGH多肽，所述缓冲液诸如含有EDTA和浓度比平衡缓冲液低的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液等。例如使用磷酸钾梯度降低线性盐梯度也可用于洗提hGH分子。接着，可例如通过过滤(诸如透滤或超滤)浓縮洗提液。可利用透滤去除用于洗提hGH多肽的盐。可例如使用凝胶过滤(GelFILTRATION:PRINCIPLESANDMethods(Cat.No.18-1022-18，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，所述文献是以引用的方式并入本文)、羟基磷灰石色谱(适当基质包括(但不限于)HA-Ultrogel,HighResolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-GelHTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干和其类似方法对第一hGH多肽混合物或其任何随后的混合物执行分离步骤，以去除任何过量的盐并且以用于下一分离歩骤或甚至最终药物产物配方的适当缓冲液置换所述缓冲液。可使用所属领域技术人员己知的技术在本文所述的各歩骤处监测hGH多肽(包括实质纯的hGH多肽)的产量。也可在最后的分离步骤时使用所述技术评定实质纯的hGH多肽的产量。举例而言，可使用数个具有多种烷基链长度的反相高效液相色谱柱(诸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC监测hGH多肽的产量。纯度可使用诸如SDS-PAGE的标准技术或通过使用蛋白印迹法(Westernblot)和ELISA检定测量hGH多肽来予以测定。举例而言，可产生对抗由阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离出的蛋白质的多克隆抗体。也可使用抗体探査污染宿主细胞蛋白质的存在。RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)是由二氧化硅凝胶颗粒组成，其表面具有C4烷基链。hGH多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差异。洗提是以稀三氟乙酸中的乙腈梯度执行。制备型HPLC是使用不锈钢柱(填充有2.8到3.2升VydacC4硅胶)执行。通过加入三氟乙酸酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液并将其装载于VydacC4柱。就洗涤和洗提而言，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗提馏分并立即以磷酸盐缓冲液进行中和。汇集IPC界限内的hGH多肽部分。DEAE琼脂糖(GEHealthcar)材料是由与琼脂糖珠粒表面共价结合的二乙胺基乙基(DEAE)组成。h(H多肽与DEAE基团的结合是通过离子相互作用介导。乙腈和三氟乙酸穿过柱而无保留。已洗去这些物质后，通过用低pH值下的乙酸盐缓冲液洗涤柱去除痕量杂质。接着，用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱，并且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提hGH多肽。以DEAE琼脂糖的快速流动压紧柱。调节柱体积以确保hGH多肽装载量在每毫升凝胶3-10mghGH多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤柱。装载所汇集的HPLC洗出液馏分，并用平衡缓冲液洗涤柱。接着，用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤随后用平衡缓冲液洗涤柱。随后，以洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸钾)从柱中洗提出hGH多肽，并且根据主要洗提概况收集单一洗提馏分。将DEAE琼脂糖柱洗出液调到指定的传导率。将所得药物无菌过滤到特氟纶瓶(Teflonbottle)中并在-7(TC下储存。可使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的歩骤。内毒素为一种位于革兰氏阴性宿主细胞(诸如大肠杆菌)外膜上的脂多糖(LPS)。用于减少内毒素含量的方法已为所属领域技术人员所知，且包括(但不限于)使用二氧化砝支撑体、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术、反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、这些方法的组合和其类似方法。可能需要修饰或额外方法将污染物(诸如共迁移蛋白)从所需多肽中去除。用于测量内毒素含量的方法已为所属领域技术人员所知，且包括(但不限于)鲎变形细胞溶解产物(LimulusAmebocyteLysate,LAL)检定。可使用多种方法和程序评定包含一种或一种以上非天然编码的氨基酸的hGH蛋白的产量和纯度，所述方法和程序包括(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯染色SDS-PAGE(coomassiestainedSDS-PAGE)、质谱(包括但不限于MALDI-TOF)和所属领域技术人员己知的表征蛋白质的其它方法。其它方法包括(但不限于)与蛋白质染色方法偶联的SDS-PAGE、免疫印迹、基质辅助激光解吸/电离-质谱法(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱法。也可将包括(但不限于)本文所列的有关分离和纯化的程序用于配方研究中，以评定本发明hGH多肽的稳定性、PEG化形式hGH多肽的稳定性和PEG化反应的进程。「//.赠,资顿表这己使用数种策略将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、经突变诱发的宿主细胞或无细胞系统中的蛋白质中。这些系统也适用于制造包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽。以反应侧链使氨基酸(诸如Lys、Cys和Tyr)衍生化将导致赖氨酸转化成N、乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供一种用于并入非天然氨基酸的简单方法。随着近来对于肽片段的酶连接和天然化学连接研究的发展，可能制造出较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,A腿.Rev.Biochem.69:923(2000)。以化学方法肽连接和天然化学连接已描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO02/098902和WO03/042235中，所述专利都是以引用的方式并入本文中。已使用将经所需非天然氨基酸化学酰基化的抑制物tRNA加入能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法将超过100个非天然氨基酸位点特异性并入具有实际任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G,Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34:621(1995);CJ.Noren,SJ.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.GSchultz,爿gewera/me,/zo<i/ors"e,eczycz'wcorpora"'owo/www幽ra/麵fwoac油fwto;rato'眠Science244:182-188(1989);禾口J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,_8/c^_ywMe"cs"e層speciez'wcor/ora"'owo/awow-wWwra/謂/wo"c/<iWoa/o/，e/"'<ie，J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已将广泛多种官能团引入蛋白质中以供有关蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机制和信号转导的研究。己研究出一种称为选择性压力并入的活体内方法来开发混杂的野生型合成酶。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,RM.Dong,L,Moroder禾口R,Huber,FASEBJ.，13:41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢途径己切断的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度天然氨基酸的基本培养基中，同时阻遏目标基因的转录。稳定生长期开始时，耗尽天然氨基酸并以非天然氨基酸类似物加以置换。诱导表达重组蛋白将导致含有非天然氨基酸类似物的蛋白质的积累。举例而言，使用这一策略，已将邻-、间-和对氟代苯丙氨酸引入蛋白质中并且在UV光谱中展现出易于鉴别的两个特征性峰肩，例如参看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000);已使用三氟甲硫胺酸置换噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸，以通过"FNMR研究其与壳低聚糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.RHonek,Biochemistry,36:3404(1997);并且已并入三氟亮氨酸替代亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A,Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem,Int.Ed.Engl.,40:1494(2001)。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白中将会便利对X射线晶体学中各相的解答。例如参看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBOJ.,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda禾口M.Hatada,Nat.Struct.Biol..1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange，C.Eckerskorn,,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995);禾QN.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder禾口R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616(1997)。也已有效并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行额外修饰。例如参看J.C.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett..428:68(1998);J.C..vanHest，K,L.Kiick和D.A.Tirrell,J,Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和K.L.KiickandD.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);关国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097,所述专利文献都是以引用的方式并入本文中。本方法的成就将视氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别而定，总的说来，这需要高选择性来确保蛋白质翻译的保真性。一种扩大本方法的范畴的方式为放松氨酰基tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数量的情况下达成。举例而言，在大肠杆菌苯丙胺酰基tRNA合成酶(PheRS)的情况下以Gly置换Ala29将增加底物结合口袋的尺寸，并且引起对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰基化作用。参看M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。具有此突变体PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来替代苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.He腦cke,FEBSLett.,364:272(1995);禾口N.Sharma,R.Furter，P.KastandD.A.Tirrell，FEBSLett.,467:37(2000)。类似地，已证实邻近大肠杆菌酪胺酰tRNA合成酶的氨基酸结合位点处的点突变Phel30Ser使重氮酪氨酸能够比酪氨酸有效地并入。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito画Yano，K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.SoilandS.Nishimura,J.Biol.Chem..275:40324(2000)。在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶无法区分且因此活化在结构上与同类天然氨基酸类似的氨基酸。这一错误在单独位点处经校正，其使来自tRNA的错误氨基酸脱酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果丧失合成酶的校对活性，那么错误活化的结构类似物可逃离编辑功能并且被并入。近来已以缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这一方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel禾口P.Marliere;Science,292:501(2001)。ValRS可以Cys、Tyr或氨基丁酸(Abu)错误氨酰基化tRNAVal;随后，这些非同类的氨基酸经编辑结构域水解。随机突变诱发X"厲/f廣染色体后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变体乂"應^f慮菌株。这一编辑缺陷型ValRS错误地将Cys装于tRNAVal上。由于Abu在空间上与Cys类似(Cys的-SH基团经Abu中的-13置换)，故当这一突变体^"厲^:廣菌株在Abu存在下生长时，突变体ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析表明，在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24%的缬氨酸经Abu置换。固相合成和半合成方法也已允许合成大量含有新颖氨基酸的蛋白质。举例而言，参看本文引用的以下公开案和参考文献，如下所述Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S,Watts-Tobin,R.Ge/tera/wa加reo/geWccode/orNature,192:1227-1232(1961);Hofmann,K.，Bohn,H.S加cfesow/o/ypep^fes.XOT/,o//^razo/e-f'附/(iazo/ere/7/ace附ew^yoiS-z^o/^/wflC/vw/7.wg/oZewcyo/<2iS-pepride/ragme賊J.AmChem,88(24):5914-5919(1966);Kaiser,E.T.办滋e"'c卿謂c/es《oi>/o/og7.ca〃>"aWvepep^iesproto./wz'wc/w<iz'wgewyzmes，AccChsmRes,22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.尸ep"c/eseg膨Wco"//z.ngc她(yze(isem&声/"/c^n'os由〃z'szXJAmChemSoc,109:3808-3810(1987);Schnolzer,M.，Kent,SBH.Co"Wrac"wg/rato'wsdoveto'〃wg5^w^"/cpe/f油s.'6acM麵-e—講W戸&Science,256(5054):221-225(1992);Chaiken,I.M.Sew一"/A幼.cpe,We5awc_prato>w,CRCCritRevBiochem，11(3):255-301(1981);Offord,R.E.Prato'"ewg/zee"'"gc/譜z.ca/mea肌？ProteinEng.,1(3):151-157(1987);禾口Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C，Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.爿Dw.gwedPe/"(ie丄/gcwe/or7bto/>Syw^e^o/W6owwc/e<xse爿>v"/[/wwWwra/Cafa(y":cScisncc,266(5183):243(1994)。已使用化学修饰在活体外将包括辅助因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看Corey,D.R.，Schultz,P.G.o/a/;^nWsegwewce-57eci!ycw'wg7e-Wrawdec/(ieox"'6owwc/e<xse,Science,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,LawrenceD.S.,Rokita,S.E.TTzec/，z'ca/moA//cfl//o"o/ewz_yma//c，"/z'c"乂AnnuRevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser,E.T.，Lawrence,D.S.C7e附z'ca/扁她ow。/考z附eac"'ve57.败Scisncs,226(4674):505-511(1984);Neet,K.E.,NanciA,Koshland，D.E.尸ra戸"&yo/麵/-油"/我JBiol.Chem,243(24):6392墨6401(1968);Polgar，L.etM.L.Bender,Xwew<a57"Ae"ca〃y/omecac"ve77".o"MZ7"fe.w.J.AmChemSoc.88:3153-3154(1966);禾nPollack,SJ.，Nakayama,G.Schultz,P.G./wfracwc"'owo/"wc/eojo/n'/esadspecfmscoj^'cpraxesz.w,oaw"力o办co附Wm'wgScience,242(4881):1038-1040(1988)。另外，已使用使用化学方法修饰氨酰基tRNA的生物合成方法将数个生物物理探针并入活体外合成的蛋白质中。参看以下专利文献中所引用的以下公开案和参考文献Brunner,J.7VewP/zofo/a6e/z'wgawdtross/z'wfa'"gm"/zoc/s'Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);禾口Krieg，U.C.,Walter,P.,Hohnson，A.E.尸/zWocrcm"wWMgo/hgwa/呵wewceProc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先甜已证实，可通过将经化学方法氨酰基化的抑制物tRNA加入经含有所需琥珀无义突变的基因程式设计的蛋白质合成反应中，在活体外将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中。使用这些方法，使用对特定氨基酸具营养缺陷的菌株，可以结构类似的同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如以氟代苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.，Schultz,P.G.gewera/me^od/ors"e,ec!ycZwcorporadow0/wwwa&m/麵/wo鎖'dsz'wtoScience,244:182-188(1989);M,W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.，Chamberlin,A.R.,Diala，E.S.5z'os，f/幼'cs"e,ec(/i'c/wcorpom"owo/awow-w她ra/謂Z"o/自apo/"ep"(ie,J.AmChemSoc，111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman，J.A.，Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.，Noren，C丄，Schultz,P.G.5z'os戸Ae"'cwef/20(iybrz.w加(i固'wgw，fl^wra/a附,.woa"'(is1s"e-5peczyk^(yz'wtoprato'ws.MethodsinEnz,,第202巻，301-336(1992);禾QMendel，D.,Cornish,V.W.&Schultz,P.G.S"e-Df're"ec/Mi^agewesifsawExpa打(ie(iGene"cCode,AimuRevBiophys.BiomolStruct.24,435-62(1995)。举例而言，制备识别终止密码子UAG的抑制物tRNA,并且用非天然氨基酸以化学方法使其氨酰基化。使用常规定点突变诱发将终止密码子TAG引入蛋白质基因中的所需位点处。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'jB义o""c/eosesz."/^(wp/zorc^A/oflfe-Zmsed0"§70"<:/60"'(3^-<^>^<^6^/mi^agewsk,NucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制物tRNA和突变体基因组合于活体外转录/翻译系统中时，对UAG密码子起反应并入非天然基酸，从而提供在特定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用^H]-Phe进行的实验和以a羟基酸进行的实验证实，仅所需氨基酸被并入UAG密码子指定的位置处，且并未将这一氨基酸并入蛋白质中的任何其它位点。例如参看Noren等人，厨J:文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;禾卩Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz，P.G.S"e-5pecz力'cz'wcoora"'owo/wove/6ac化owez'柳/rato'叫Science,255(5041):197-200(1992)。可通过任何方法或技术(包括但不限于，化学或酶氨酰基化方法)以所需氨基酸使tRNA氨酰基化。氨酰基化可通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于，核糖酶)实现。术语"核糖酶"可与"催化型RNA"互换使用。Cech和其同事(Cech,1987,Science,236:1532-1539;McCorkle等人,1987,ConceptsBiochem.64:221-226)证实可充当催化剂(核糖酶)的天然存在的RNA的存在。然而，尽管仅已证实这些天然RNA催化剂对用于裂解和剪切的核糖核酸底物起作用，但近期有关人工核糖酶进展的研究已扩大对各种化学反应的催化作用的型式。相关研究己鉴别出可催化其自身(2')3'末端的氨酰基RNA键的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)和可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一RNA分子的RNA分子(Lohse等人，1996，Nature381:442-444)。美国专利申请公开案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文)描述构建核糖酶的方法和其对于用天然编码的氨基酸和非天然编码的氨基酸氨酰基化tRNA的用途。可使tRNA氨酰基化的底物固定形式的酶分子(包括但不限于，核糖酶)能够有效地亲和纯化氨酰基化产物。适当基质的实例包括琼脂、琼脂糖和磁珠。供氨酰基化作用的底物固定形式的核糖酶的制造和用途已描述于ChemistryandBiology2003,10:1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，所述专利文献是以引用的方式并入本文。化学氨酰基化方法包括(但不限于)由Hecht和其同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25，545;Heckler,T.G.;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang,P.;Hecht，S.M.Biochemistry1988，27，7254;Hecht,S.M.;Alford,B,L.;Kuroda,Y.;Kitano，S.J.Biol.Chem.1978,253，4517)禾口Schultz，Chamberlin,Dougherty等(Cornish,V.W.;Mendel,D,;Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A,;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz,P.G.Science1989,244,182;Bain，J.D.;Glabe，C.G.;Dix，T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013;Bain,J.D.等人Nature1992，356，537;Gallivan,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740;Turcatti等人J.Biol.Chem.1996，271,19991;Nowak,M.W.等人Science,1995,268，439;Saks,M.E.等人J.Biol.Chem.1996，271,23169;Hohsaka,T.等人J.Am.Chem.Soc.1999，121,34)提出的方法，所述参考文献是以引用的方式并入本文中，所述方法避免使用氨酰基合成酶。所述方法或其它化学氨酰基化方法可用于使tRNA分子氨酰基化。用于产生催化性RNA的方法可涉及产生单独随机核糖酶序列池；对所述池执行定向进化；针对所需氨酰基化活性筛选所述池；和选择那些展现所需氨酰基化活性的核糖酶的序列。核糖酶可包含便利酰基化活性的基元和/或区域，诸如GGU基元和富含U的区域。举例而言，据报导，富含U的区域可便利识别氨基酸底物，且GGU基元可与tRNA3'末端形成碱基配对。总的说来，GGU基元和富含U的区域便利同时识别氨基酸与tRNA，且由此便利使tRNA3'端氨酰基化。可通过使用与tRNAAsncccc接合的部分随机化r24mini进行活体外选择，随后系统性工程设计见于活性克隆中的一致序列来产生核糖酶。由本方法获得的示范性核糖酶称为"Fx3核糖酶"且描述于美国公开申请案第2003/0228593号中，所述专利的内容是以引用的方式并入本文，所述核糖酶充当合成具有同类非天然氨基酸的各种氨酰基tRNA的通用催化剂。可使用固定于底物上以有效亲和纯化氨酰基tRNA。适当底物的实例包括(但不限于)琼脂、琼脂糖和磁珠。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，诸如，可以高碘酸盐氧化RNA的核糖上的3'-顺式-二醇以得到相应二醛以便利将RNA固定于树脂上。可使用各类树脂，包括廉价酰肼树脂，其中还原氨化使得树脂与核糖酶之间以不可逆连接相互作用。可通过柱上氨酰基化技术(on-columnaminoacylationtechnique)显著便利氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人Methods2005;36:239-4描述基于柱的氨酰基化系统。可以多种方式实现氨酰基化tRNA的分离。一种适当方法为用缓冲液从柱中洗提出氨酰基tRNA，所述缓冲液诸如具有10mMEDTA的乙酸钠溶液、含有50mMN-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙垸磺酸)、12.5mMKC1(pH7.0)、10mMEDTA的缓冲液或简单地经EDTA缓冲的水(pH7.0)。可将氨酰基化tRNA加入翻译反应中以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所制造的多肽中选择的位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶解产物。细胞溶解产物提供从输入的mRNA活体外翻译多肽必需的反应组份。所述反应组份的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延长因子和与翻译有关的其它因子。此外，翻译系统可为批量翻译或区域化翻译。批量翻译系统将反应组份组合于单一隔室中，而区域化翻译系统使翻译反应组份与可抑制翻译效率的反应产物分离。所述翻译系统为市售。另外，可使用偶联的转录/翻译系统。偶联的转录/翻译系统允许将输入DNA转录成对应的mRNA，其接着经反应组份翻译。市售偶联转录/翻译的实例为快速翻译系统(RapidTranslationSystem)(RTS,RocheInc.)。所述系统包括含有提供翻译组份(诸如核糖体和翻译因子)的大肠杆菌溶解产物的混合物。此外，还包括RNA聚合酶以将输入的DNA转录成供翻译使用的mRNA模板。RTS可使用借助插入到反应隔室(包括供应/废物隔室和转录/翻译隔室)之间的膜区域化的反应组份。tRNA的氨酰基化可以其它试剂执行，所述试剂包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化抗体、多功能蛋白和其类似物。Lu等人于MolCell.200110月；8(4):759-69中描述一种以化学方式使蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽连接的方法(表达蛋白连接)。也巳使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz，D.A.DoughertyandH.A.Lester,Science,268:439(1995);禾flD.A.Dougherty,Curr.O由.Chem.Biol.,4:645(2000)。将爪蟾卵母细胞与活体外制造的两种RNA物质共注射在所需氨基酸位置处编码具有UAG终止密码子的目标蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制物tRNA。接着，将卵母细胞的翻译机器插入由UAG指定的位置处的非天然氨基酸。本方法已允许对一般不受活体外表达系统作用的完整膜蛋白进行活体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，例如参看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth，F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.ChoUet,J.Biol.Chem..271:19991(1996);并入经生物素标记的氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.BioL4:739(1997);使用笼锁酪氨酸类似物以实时监测离子通道中的构象改变，例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty禾口H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);使用a羟基氨基酸改变离子通道主链以探査其门控机制。例如参看RM.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,，,96:89(1999);和T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan，RG,Schultz禾口J.Yang,Nat.Neurosci..4:239(2001)。在活体内将非天然氨基酸直接并入蛋白质中的能力提供多种益处，包括(但不限于)高突变体蛋白产量、技术简便、研究细胞或可能的活有机体中的突变体蛋白的潜力和使用这些突变体蛋白作治疗性治疗和诊断用。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括于蛋白质中的能力可极大扩大合理且系统性操纵蛋白质结构探查蛋白质功能与产生具有新颖特性的新颖蛋白质或有机体的能力。在有关位点特异性并入对氟苯丙氨酸的一次尝试中，将酵母琥珀抑制物tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型义厲斧賡菌株中。例如参看R.Furter，ProteinSci.,7:419(1998)。还可能使用无细胞(活体外)翻译系统表达本发明的hGH多肽。翻译系统可为细胞翻译系统或无细胞翻译系统，且可为原核细胞或真核生物。细胞翻译系统包括(但不限于)所需核酸序列可转录成mRNA且所述mRNA可经翻译的全细胞制剂，诸如透性化细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统可为市售，且众所周知许多不同的类型和系统。无细胞系统的实例包括(但不限于)原核生物溶解产物(诸如大肠杆菌溶解产物)和真核生物溶解产物(诸如麦芽提取物)、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人类细胞溶解产物。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或另外经修饰时，由于许多所述修饰仅可能在真核生物系统中，故可优选真核生物提取物或溶解产物。这些提取物和溶解产物的一部分可为市售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)。可用于翻译分泌型蛋白的膜提取物(诸如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)也可用。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(活体外转录与翻译的组合)的这些系统中，活体外合成是通过核糖体引导。已将相当多的努力致力于研究无细胞蛋白质表达系统中。例如参看Kim,D,M.禾口J.R.Swartz,伤o化c/mo/ogyam/5z'oewg/ween'wg,74:309-316(2001);Kim，D.M.和J.R.Swartz,历o&c/z"o/ogy丄e"en，22，1537-1542，(2000);Kim,D.M.禾卩J.R.Swartz,5!.o^c/z"o/og;;/V。g薦，16,385-3卯，(2000);Kim，D,M.禾口J.R.Swartz,iz'otec/mo/ogyawd5Zoewg7'ween'wg,66,180-188,(1999);禾口Patnaik,R.andJ.R.Swartz,5她c—腿24,862-868,(1998);美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353;WO90/05785，所述专利文献都是以引用的方式并入本文。可用于表达包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts禾卩J.Szostak,/Voc.Ato/Jcad.Sd.(X^4」94:12297-12302(1997);A,Frankel等人，CAemzWry&历o/ogy10:1043-1050(2003)。以本方法，在核糖体上将连接到嘌呤霉素的mRNA模板翻译成肽。如果已对一种或一种以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。阅读最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素将俘获肽的C端。如果在活体外检定中发现所得mRNA-肽接合物具有引人关注的特性，那么可轻易地从mRNA序列中揭示其身份。以此方式，可筛选包含一种或一种以上非天然编码的氨基酸的hGH多肽的文库以鉴别具有所需特性的多肽。目前，据报导，以纯组份进行活体外核糖体翻译将允许合成经非天然编码的氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人，Prac.A^/v4cm/.ScZ.100:6353(2003)。也可使用已复水的翻译系统。也已成功地使用纯翻译因子的混合物将mRNA翻译成蛋白质以及溶解产物或补充有纯翻译因子的溶解产物的组合，所述纯翻译因子诸如起始因子-1(IF-l)、IF-2、IF-3(a或P)、延长因子T(EF-Tu)或终止因子。还可使无细胞系统与转录/翻译系统偶联，其中如Cw〃ewf/Vofoco/sMo/ecw/ar所o/ogy(F.M.Ausubel等人编，WileyInterscience,1993)(其是以引用的方式清楚地并入本文)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA且翻译所述mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或5'端帽子(7-甲基鸟苷)和3'端聚A尾成熟mRNA的形式，此可为某些翻译系统的优势。举例而言，在网织红细胞溶解系统中以高效率翻译经封端mRNA。W//.与AG好多,錄凝游乂分f曩会激对本文所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰可使用本文所述的组合物、方法、技术和策略实现。这些修饰包括将其它功能性并入多肽的非天然氨基酸组份上，所述功能性包括但不限于，标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖类、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼锁部分、光化辐射可激发部分、光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、化学可裂解基团、光可裂解基团、延长的侧链、与碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记部分、生物物理学探针、发磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传导物、放射性核苷酸、无线电传导物、中子俘获剂或上述物质的任何组合或任何其它所需化合物或物质。作为本文所述的组合物、方法、技术和策略的例示性、非限制性实例，以下实施方式将集中于将大分子聚合物加入非天然氨基酸多肽中，且应了解本文所述的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时且所属领域技术人员可针对本文的揭示内容作出适当修改)加入其它功能性，包括但不限于上文所列的那些功能性。多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的hGH多肽连接以调节所述hGH多肽的生物特性，和/或向hGH分子提供新颖的生物特性。可通过天然编码的氨基酸；非天然编码的氨基酸；或天然或非天然氨基酸的任何功能性取代基；或加入天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团使这些大分子聚合物与hGH多肽连接。聚合物的分子量可在包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高分子量之间的广泛范围内。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10，000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量是介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量是介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量是介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量是介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量是介于约10,000Da与40,000Da之间。本发明提供实质同源的聚合物:蛋白质接合物制剂。如本文所使用的"实质同源"意思是观察到聚合物:蛋白质接合物分子比总蛋白质的一半大。聚合物:蛋白质接合物具有生物活性，且本文所提供的本"实质同源"的PEG化hGH多肽制剂为足够同源以展现同源制剂的益处(例如使临床应用中各批制剂之间的药代动力学易于预测)的制剂。也可选择制备聚合物:蛋白质接合物分子的混合物，且本文所提供的益处在于可选择单聚合物:蛋白质接合物的比例以包括于混合物中。因此，视需要可制备各种蛋白质与所连接的各种数量的聚合物部分(意即，二-、三-、四-等)的混合物，并使所述接合物与使用本发明的方法制备的单聚合物:蛋白质接合物组合，从而具有具预定的单聚合物:蛋白质接合物比例的混合物。所选择的聚合物可具水溶性，从而使其所连接的蛋白质不会沉淀于诸如生理学环境的水性环境中。聚合物可为分枝或不分枝聚合物。对于终产物制剂的治疗用途而言，聚合物需为医药学上可接受的聚合物。聚乙二醇分子比蛋白质分子的比例将随其在反应混合物中的浓度而变化。一般说来，最佳比率(就反应的效率而言为存在最少过量的未反应蛋白质或聚合物)可通过所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数量确定。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，则可与蛋白质连接的聚合物分子的数量越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑到聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或分枝越多)则聚合物:蛋白质的比率越高。聚合物的实例包括(但不限于)聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇和其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG);聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如聚羟丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羟基烷酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多醣和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；甲壳素和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基甲壳素、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；普鲁兰多糖(pullulan)和羧甲基普鲁兰多糖；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；顺丁烯二酸酐共聚物，诸如苯乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚顺丁烯二酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物质的衍生物。聚乙二醇分子比蛋白质分子的比例将随其在反应混合物中的浓度而变化。一般说来，最佳比率((就反应的效率而言为存在最少过量的未反应蛋白质或聚合物)可通过所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数量确定。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，则可与蛋白质连接的聚合物分子的数量越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑到聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或分枝越多)则聚合物:蛋白质的比率越高。如本文所使用且当预期PEG:hGH多肽接合物时，术语"治疗有效量"是指向患者提供所需益处的量。所述量将随个体不同而变化，并且将视包括患者的全部生理条件和待治疗的病况潜在成因的多种因素而定。治疗使用的hGH多肽的量提供可接受的改变速率并且在有益的水平上保持所需改变。所属领域技术人员可易于使用公共可用材料和程序确定本发明组合物的治疗有效量。水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉形或分枝形。通常，水溶性聚合物为聚(垸二醇)，诸如聚(乙二醇)(PEG)，但其它水溶性聚合物也可使用。举例而言，将使用PEG描述本发明的某些实施例。PEG为众所周知的水溶性聚合物，其为市售或可根据所属领域技术人员已知的乙二醇的开环聚合方法进行制备(Sandler和Karo，PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3巻，第138-161页)。术语"PEG"在广义上用于涵盖忽略PEG大小或PEG末端修饰的任何聚乙二醇分子，并且可以由下式所示的与hGH多肽连接的形式表示XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y，其中n为2到10,000;且X为H或末端修饰，包括(但不限于)Q-4烷基、保护基或末端官能团。在一些情况下，用于本发明中的PEG在一端以羟基或甲氧基终止，意即，X为H或CH3("甲氧基PEG")。或者，PEG可以反应性基团终止，由此形成双官能聚合物。典型的反应性基团可包括通常用于与见于20种常见氨基酸中的官能团反应的反应性基团(包括但不限于，顺丁烯酰亚胺基团、活性碳酸酯(包括但不限于，对硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)，以及对20种常见氨基酸具惰性但与非天然编码的氨基酸内存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括但不限于，叠氮基、炔基)。应注意，上式中以Y表示的PEG的另一末端将经由天然存在或非天然编码的氨基酸直接或间接与hGH多肽连接。举例而言，Y可为与多肽胺基(包括但不限于，赖氨酸的e胺或N端)的酰胺、氨基甲酸酯或尿素键。或者，Y可为与硫醇基(包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基)的顺丁烯酰亚胺键。或者，Y可为与通常不可经由20种常见氨基酸接取的残基的键。举例而言，PEG上的叠氮基可与hGH多肽上的炔基反应形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码的氨基酸中存在的叠氮基反应形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括但不限于，肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码的氨基酸中存在的醛基或酮基反应形成腙、肟或缩氨基脲，其视应用在一些情况下可另外通过用适当还原剂处理而经还原。或者，可通过非天然编码的氨基酸将所述强亲核试剂并入hGH多肽中，并且将其用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。可视实际需要使用PEG的任何分子量，包括(但不限于)约100道尔顿(Dalton,Da)到100,000Da或视需要更多(包括但不限于，有日寸0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)约100Da与约100,000Da或更多之间。PEG的分子量可介于约lOODa与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、lO，OOODa、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3，000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da.在一些实施例中，PEG的分子量是介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子暈是介于约l，OOODa与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约IO，OOODa与40,000Da之间。也可使用支链PEG，包括(但不限于)各链的MW在1-100kDa(包括但不限于1-50kDa或5-20kDa)范围内的PEG分子。支链PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)约1,000Da与约100,000Da或更多之间。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85，000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7，000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da禾B1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量是介于约l，OOODa与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量是介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量是介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量是介于约5,000Da与20,000Da之间。多种PEG分子已描述于包括((S不限于)theShearwaterPolymers,Inc.catalog,NektarTherapeuticscatalog(以引用的方式并入本文)中。一般地，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码的氨基酸反应。举例而言，可使用具有与氨基酸侧链反应的炔部分和叠氮部分的PEG衍生物使PEG与非天然编码的氨基酸反应。如果非天然编码的氨基酸包含叠氮化物，那么PEG通常将含有实现[3+2]环加成产物形成的炔部分或含有实现酰胺键形成的膦基的活性PEG物质(意即，酉旨、碳酸酯)。或者，如果非天然编码的氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有实现[3+2]Huisgen环加成产物形成的叠氮部分。如果非天然编码的氨基酸包含羰基，那么PEG通常将包含有效的亲核试剂(包括但不限于，酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能性)以便实现相应腙、肟和缩氨基脲键的分别形成。在其它替代选择中，可反方向使用上述反应性基团，意即，非天然编码的氨基酸中的叠氮部分可与含有炔的PEG衍生物反应。在一些实施例中，具有PEG衍生物的hGH多肽含有与非天然编码的氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能性。在一些实施例中，本发明提供含叠氮化物和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量为约SOODa到约100,000Da的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应了解，包括但不限于聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物也适用于本发明的实践中，且预期术语PEG或聚(乙二醇)的使用涵盖并包括所有所述分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括双功能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉形PEG、分枝PEG、侧接PEG(意即，具有一个或一个以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物)或具有可降解键的PEG。PEG通常澄清、.无色、无臭、溶于水、对热稳定、对许多化学试剂具惰性，不会水解或退化且一般无毒。普遍认为聚(乙二醇)具生物可相容性，也就是说，PEG能够在不引起危害的情况下与活组织或有机体共存。更具体说来，PEG实质具非免疫原性，也就是说，PEG在体内不倾向于产生免疫反应。当与体内具有一些所需功能的分子(诸如生物活性剂)连接时，PEG倾向于遮蔽所述试剂，并且可能减小或消除任何免疫反应从而使有机体可耐受所述试剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质的免疫反应或引起凝血或其它不合需要的作用。具有式-(^20120-(0120120)。-(:1^(:112-(其中n为约3到约4000，通常为约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，分子量为约800Da到约100,000Da的PEG尤其可用作聚合物主链。PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)约100Da与约100,000Da或更多之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15，000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量是介于约10,000Da与40,000Da之间。聚合物主链可为线性或分枝状。分枝状聚合物主链一般已为此项技术中所知。通常，分枝聚合物具有一个中心分枝核心部分和多个与所述中心分枝核心连接的线性聚合物链。通常使用分枝形式的PEG，其可通过使氧化乙烯与各种多元醇(诸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成而制得。中心分枝部分也可源自若干个氨基酸(诸如赖氨酸)。分枝状聚(乙二醇)可以通用形式R(-PEG-OH)m表示，其中R是从核心部分衍生，诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇；且m表示侧臂数。也可将多臂PEG分子(诸如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4，289,872号；美国专利申请案2003/0143596;WO96/21469;和WO93/21259，所述专利各自以其全文引用的方式并入本文)用作聚合物主链。分枝状PEG也可为以PEG(-YCHZ2)n表示的分叉状PEG形式，其中Y为连接基团，且Z为通过指定长度的原子链与CH连接的活性端基。另一种分枝形式，即侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链末端具有反应性基团，诸如羧基。除这些形式的PEG外，也可制备在主链中具有弱或不可降解的键的聚合物。举例而言，可制备在聚合物主链中具有经历水解的酯键的PEG。如下所示，这一水解将使聚合物裂解成具有较低分子量的片段-PEG-C02-PEG-+H20^PEG-C02H+HO-PEG-。所属领域技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括此项技术中已知的所有形式，包括(但不限于)本文所揭示的形式。许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具水溶性、具有2到约300个末端的聚合物主链尤其可用于本发明中。适当聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(烷二醇)，诸如聚(丙二醇)("PPG")、其共聚物(包括但不限于，乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物和其类似物。尽管聚合物主链各链的分子量可变化，但其通常在约800Da到约100,000Da、通常在约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物主链各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、卯,OOODa、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量是介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量是介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量是介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量是介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量是介于约IO，OOODa与40,000Da之间。所属领域技术人员将认识到，前述有关实质水溶性主链的列表并不详尽而仅出于说明的目的，并且预期具有上述品质的所有聚合材料都适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为"多官能的"，意思是聚合物主链具有至少两个经官能团功能化或活化的末端，且可能多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，每一末端都与相同或不同的官能团键接。在一实施例中，聚合物衍生物具有结构X—A—POLY—B—-N=N=N,其中-N=N=N为叠氮部分；B为连接部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原性聚合物；A为连接部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且x为第二官能团。A与B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个(包括但不限于，介于1-10个之间)碳原子的多重官能化烷基。烷基链中可包括杂原子，诸如氮、氧或硫。烷基链也可在杂原子处具有支链。A与B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个(包括但不限于，介于5-6个之间)碳原子的多重官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。适当连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号、第5，643，575号和美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些连接基团，所述专利各自以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将认识到，前述有关连接部分的列表并不详尽而仅出于说明的目的，并且预期具有上述品质的所有连接部分都适用于本发明中。用作X的适当官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(诸如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯和碳酸l-苯并三唑酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如所属领域技术人员所了解，所选择的X部分应与叠氮基相容，从而不会与叠氮基发生反应。含有叠氮基的聚合物衍生物可具同型双功能性，意思是第二个官能团(意即，X)也为叠氮部分；或具异型双功能性，意思是第二官能团为不同的官能团。术语"经保护"是指存在防止化学反应官能团在某些反应条件下反应的保护基团或部分。保护基将视所保护的化学反应基团的类型而变化。举例而言，如果化学反应基团为胺或酰肼，那么保护基可选自由叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)组成的群组。如果化学反应基团为硫醇，那么保护基可为正吡啶基二硫化物。如果化学反应基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基或烷基(诸如甲基、乙基或叔丁基)。此项技术中已知的其它保护基也可用于本发明中。通常可通过此项技术中已知的方法(包括但不限于，沉淀产物随后视需要进行色谱分析)实现对于粗产物的纯化。可将水溶性聚合物与本发明的hGH多肽连接。水溶性聚合物可通过并入hGH多肽中的非天然编码的氨基酸，或非天然编码或天然编码的氨基酸的任何官能团或取代基，或加入到非天然编码或天然编码的氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者，通过天然存在的氨基酸(包括但不限于，半胱氨酸、赖氨酸或N端残基的胺基)使水溶性聚合物与并入非天然编码的氨基酸的hGH多肽连接。在一些情况下，本发明的hGH多肽包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(包括但不限于，PEG和/或寡醣)连接。在一些情况中，本发明的hGH多肽另外包含l个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个或IO个以上与水溶性聚合物连接的天然编码的氨基酸。在一些情况中，本发明的hGH多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在的氨基酸。在一些实施例中，相对于未接合形式的hGH多肽，用于本发明中的水溶性聚合物将增强所述hGH多肽的血清半衰期。可调节与本发明的hGH多肽连接的水溶性聚合物的数量(意即，PEG化或糖基化程度)使药理学、药代动力学或药效特性(诸如活体内半衰期)改变(包括但不限于，增加或降低)。在一些实施例中，hGH半衰期比未经修饰的多肽的半衰期增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。含有强亲核基团(意即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物在本发明的一个实施例中，用含有与PEG主链直接连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的hGH多肽。在一些实施例中，以羟胺为末端的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(意即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000，且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。在本发明的另一实施例中，用含有利用酰胺键连接到PEG主链的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的hGH多肽。在一些实施例中，以羟胺为末端的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(意即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2VX-NH-NH2，其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO，且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。在本发明的另一实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝状PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的hGH多肽，其中所述分枝状PEG的各链具有在10-40kDa范围内的MW。所述分枝状PEG各链的MW可在5-20kDa的范围内。在本发明的另一实施例中，以具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽。举例而言，在一些实施例中，以肼或酰肼为末端的PEG衍生物将具有以下结构2CH(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000，且X视情况为可存在或不存在的羰基(C-O)。在一些实施例中，含氨基脲基团的PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。在一些实施例中，含羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构2CH-X-(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。水溶性聚合物与hGH多肽连接的程度和位点可调节hGH多肽与hGH多肽受体在位点1的结合。在一些实施例中，如通过平衡结合检定所测量(诸如Spencer等人，《/.Ao/.CAe肌，263:7862-7867(1988)中关于hGH所述的检定)，安排键从而使hGH多肽在位点1处以约400nM或更低的Kd、150nM或更低的Kd且在一些情况下以100nM或更低的Kd与hGH多肽受体结合。活化聚合物以及肽接合的方法和化学己描述于文献中且为此项技术中所知。用于活化聚合物的常用方法包括(但不限于)以溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、二环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳二酰亚胺、磺酰基卤化物、三氯均三嗪等活化官能团(参看，R.F.Taylor,(1991),PROTEINIMMOBILISATION.FundamentalandApplications,MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking,CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson(1993)，ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,N.Y.;Dunn,R丄.等人，编辑POLYMERICDRUGSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,ACSSymposiumSeries第469巻，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991)。有关PEG功能化和接合的多项综述和专论都适用。例如参看，Harris,Macramo/.C/z亂C25:325-373(1985);Scouten，'."五wzy附o/ogy135:30-65(1987);Wong等人，￡>7，eMz.cra6.rec/mo/.14:866-874(1992);Delgado等人，CW"ca/z.wT^era^et^'cC《rz.er5ywems9:249-304(1992);Zalipsky,5z'ocow)"ga^eC7zem.6:150-165(1995)。活化聚合物的方法也可见于WO94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO93/15189中，且有关活性聚合物与酶之间接合的方法见于以下专利文献所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO94/15625)、血色素(WO94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，Aoc/^m.祝o"c/.11:141-52(1985))。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。含有非天然编码的氨基酸(诸如，对叠氮基-L-苯丙氨酸)的hGH多肽的PEG化(意即，加入任何水溶性聚合物)是通过任何常规方法进行。举例而言，hGH多肽是经以炔封端的mPEG衍生物PEG化。简单说来，室温下，于搅拌下将过量的固态mPEG(5000)-O-CH2-CECH加入含对叠氮基-L-Phe的hGH多肽的水溶液中。通常，水溶液经pKa值接近进行反应的pH值(一般为约pH4-10)的缓冲液缓冲。举例而言，用于在pH7.5下PEG化的适当缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HC1、EPPS禾BTES。持续监测pH值且视需要加以调节。通常使反应持续约1-48小时。随后，使反应产物经历疏水相互作用色谱分析以使PEG化的hGH多肽变异体与游离mPEG(5000)-0-CH2-OCH和PEG化hGH多肽的任何高分子量复合物分离，所述复合物可在活化未阻断PEG分子的两端从而交联hGH多肽变异体分子时形成。疏水相互作用色谱分析期间的条件为使游离mPEG(5000)-O-CH2-CeCH流过柱，而任何交联PEG化hGH多肽变异体复合物在含有一个与一个或一个以上PEG基团接合的hGH多肽变异体分子的所需形式后洗提的条件。适当的条件将视交联复合物比所需接合物的相对尺寸而变化，且易于为所属领域技术人员确定。通过超滤浓縮含有所需接合物的洗提液并通过透滤使其脱盐。视需要，由疏水色谱分析获得的PEG化hGH多肽可经所属领域技术人员已知的一种或一种以上程序进一步纯化，所述程序包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(包括但不限于使用DEAESEPHAROSE);二氧化硅色谱；反相HPLC(RP-HPLC);凝胶过滤(包括但不限于使用SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱焦聚；置换色谱；电泳程序(包括但不限于，制备型等电聚焦)；差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)；或萃取。表观分子量可用GPC通过与球状蛋白质标准品比较估算(Preneta，AZinPROTEINPURIFICATIONMETHODS,APRACTICALAPPROACH(Harris&Angal编辑)IRLPress1989，293-306)。hGH-PEG接合物的纯度可通过蛋白水解降解(包括但不限于，胰蛋白酶裂解)随后质谱分析来评定。PepinskyRB等人，J.尸/m，co/.cfe77^.297(3):1059-66(2001)。与本发明hGH多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可另外(但不限于)经衍生化或取代。其它PEG衍生物和通用PEG化技术含叠氮基、含炔基和含膦PEG衍生物描述于标题为"ModifedHumanGrowthHormonePolyp印tidesandTheirUses"的美国专利申请案第11/046,432号中。可与hGH多肽连接的其它示范性PEG分子以及PEG化方法包括以下专利中所述者例如，美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号；第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号第2002/0086939号第2002/0040076号第2001/0044526号2001/0021763号；美国专利第6,646,110号；第5,824,778号；第5,476,653号；第5,219,564号号号号号第5,629,384号第5,473,034号第6,515,100号第5,900,461号第5,612,460号第6,451,346号第5,736,625号；第4,902,502号；第5,281,698号第5,516,673号；第5,382,657号；第6,552,167号第6,461,603号；第6,436,386号；第6,214,966号第5,739,208号；第5,672,662号；第5,446,090号第5,324,844号；第5，252，714号；第6,420,339号第6,306,821号；第5,559,213号；第5,747,646号第5,122,614第6,610,281第5,卿,237第5,808,096第6,201,072第5,834,594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912号;WO97/32607;EP229,108;EP402,378;WO92/16555;WO94/04193;WO94/14758;WO94/17039;WO94/18247;WO94/28024;WO95/00162;WO95/11924;WO95/13090;WO95/33490;WO96/00080;WO97/18832;WO98/41562;WO98/48837;WO99/32134;WO99/32139;WO99/32140;WO96/40791;WO98/32466;WO95/06058;EP439508;WO97/03106;W096/21469;W095/13312;EP921131;WO98/05363;EP809996;W096/41813;WO96/07670;EP605963;EP510356;EP400472;EP183503和EP154316，所述专利都是以引用的方式并入本文中。本文所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，包括(但不限于)单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。标题为"ModifiedHumanGrowthHormonePolypeptidesandTheirUses"的美国专禾U申请案第11/046,432号(其是以引用的方式并入本文)中提供其它有关PEG和其形式的讨论。/x,关资力、劝凝丝^银片^袭二街^7秀/e动力学^^游,/蘆本发明的一个重要方面在于通过构筑与水溶性聚合物部分接合或不接合的hGH多肽获得的延长的生物半衰期。迅速降低hGH多肽的血清浓度使得评价对以接合和未接合hGH多肽和其变异体进行治疗的生物反应极其重要。本发明的接合和未接合hGH多肽和其变异体可在皮下或静脉内投药后也具有延长的血清半衰期，使得可能例如通过ELISA方法或初级筛选检定进行测量。可使用来自BioSourceInternational(Camarillo,CA)或DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,TX)的ELISA或RIA试剂盒。如本文所述进行活体内生物半衰期的测量。可根据Clark,R.等人'肠/.C/泄271(36):21969-21977(1996)中所述的方案测定包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的效力和功能性活体内半衰期。可以正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每一治疗组N=5只动物)估算包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的药代动力学参数。动物将经静脉内接收每只大鼠25的单一剂量或经皮下接收每只大鼠50吗的单一剂量，并且根据预定时间段取得约5-7个血液样本，所述预定时间段一般对于包含未与水溶性聚合物接合的非天然编码的氨基酸的hGH多肽而言包含约6小时，而对于包含非天然编码的氨基酸且与水溶性聚合物接合的hGH多肽而言为约4天。在数种物种中已对hGH多肽的药代动力学数据进行良好研究，并且可直接将其与所获得的有关包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽的数据相比较。参看以引用方式并入本文中的MordentiJ.等人，P/zwm.8(ll):1351-59(1991)中有关hGH的研究。也可以灵长类动物(例如，猕猴)估算药代动力学参数。单次注射可经皮下或静脉内投与，并且随时监测血清hGH含量。可通过此项技术中已知的各种检定测定根据本发明的hGH多肽的特异性活性。根据本发明获得并纯化的hGH多肽突变蛋白质或其片段的生物活性可通过本文所述或所参考的方法或所属领域技术人员已知的方法进行测试。X没^"浙度^"资合激本发明的多肽或蛋白质(包括但不限于，包含一个或一个以上非天然氨基酸的hGH、合成酶、蛋白质等)视情况与包括(但不限于)适当医药载剂组合用于治疗用途。所述组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、经缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。使所述配方与投药模式相适应。一般说来，投与蛋白质的方法已为所属领域技术人员所知，且可适用于投与本发明的多肽。根据所属领域技术人员已知的方法，视情况在一个或一个以上适当的活体外和/或活体内动物疾病模型中测试包含一种或一种以上本发明多肽的治疗组合物，以确定功效、组织代谢并估计剂量。具体说来，最初可通过本文中非天然氨基酸与天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它适当测量(包括但不限于，将经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的hGH多肽与天然氨基酸hGH多肽比较)(意即，在相关检定中)测定剂量。投药是通过通常用于引入分子最终使其与血液或组织细胞接触的任何途径进行。本发明的非天然氨基酸多肽是以任何适当的方式视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起投与。向患者投与本发明上下文中所述的这些多肽的适当方法都可使用，且尽管可使用一种以上途径投与特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径快捷和有效的作用或反应。医药学上可接受的载剂部分是通过所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法确定。因此，存在多种适当的本发明医药组合物的配方。可通过适于蛋白质或肽的任何常规途径投与本发明的hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)，所述途径包括(但不限于)不经肠方式，例如注射，包括(但不限于)皮下注射或静脉内注射或任何其它注射或输注形式。多肽组合物可以多种途径投与，包括(但不限于)经口、静脉内、腹膜内、肌内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。也可经由脂质体投与包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所述投药途径和适当配方一般己为所属领域技术人员己知。包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)可单独使用或与其它适当的组份(诸如医药载剂)组合使用。也可将单独或与其它适当组份组合的包含非天然氨基酸的hGH多肽制成气雾剂配方(意即，其可经"雾化")以通过吸入投与。可将气雾剂配方放到加压可接受的推进剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和其类似物)中。适于不经肠投与(诸如，通过关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径投与)的配方包括水性与非水性、等渗无菌注射溶液(其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配方与预定接受者的血液等渗的溶质)和水性与非水性无菌悬浮液(其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。hGH配方可存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。不经肠投药和静脉内投药是优选的投药方法。具体说来，已使用的用于天然氨基酸同源物治疗的投药途径(包括但不限于，通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它以医药学方式传递的蛋白质的那些途径)连同当前使用的配方提供优选的投药途径和本发明多肽的配方。多肽组合物的粘度和调配概况可允许用小规格针通过使用比常规配方小的活塞压力进行投药。可使用较小规格针(包括但不限于，27号、28号、29号、30号或31号针)向受检者投与本发明的多肽组合物。美国专利第6,875,432号(其是以引用的方式并入本文中)讨论蛋白质配方的粘度和与用于皮下投与的蛋白质配方的粘度有关的问题。小规格针因减小注射疼痛从而改良患者对给药方案的顺应性而有益。注射所需的较小活塞压力使hGH多肽(包括但不限于，PEG化hGH)更易于以较短注射持续时间投与。针的类型包括(但不限于)锥形针、薄壁型针、正常壁厚针和罗氏针(luerneedle)。粘度可通过所属领域技术人员已知的标准技术测量。"粘度"可为"运动粘度"或"绝对粘度"。"运动粘度"是对于在重力影响下流体流动抗性的量度。当将两种具有相同体积的流体放在相同的毛细管粘度计中并且使其在重力下流动时，粘性流体将比粘性较低的流体花费更长的时间流过毛细管。如果一种流体花费200秒完成其流动，而另一种流体花费400秒，那么就运动粘度的比例而言，第二种流体的粘性为第一种流体的两倍。"绝对粘度"有时称为动态粘度或简单粘度，其为运动粘度与流体密度的乘积绝对粘度=运动粘度乂密度。运动粘度的大小为L2/T，其中L为长度且T为时间。通常，运动粘度是以厘斯(centistoke,cSt)表示。运动粘度的SI单位为mm2/s，其为1cSt。绝对粘度是以厘泊(centipoise,cP)表示。绝对粘度的SI单位为毫帕斯卡-秒(milliPascal-second，mPa-s)，其中1cP=lmPa-s。在本发明的上下文中，向患者投药的剂量视应用而在患者体内随时间变化足以具有有益的治疗反应或其它适当活性。所述剂量是通过特定载体或配方的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病况以及待治疗的患者的体重或表面积测定。也可通过在特定患者体内投与特定载体、配方或其类似物伴随的任何不利副作用的存在、性质和程度测定剂量大小。在测定治疗或预防疾病(包括但不限于，癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS或其类似疾病)将投与的载体或配方的有效量时，医师将评价循环血浆含量、配方毒性、疾病进程和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的制造。例如向70公斤重的患者投与的剂量通常在相当于目甜所使用的治疗蛋白质的剂量的范围内，其经调整以改变相关组合物的活性或血清半衰期。本发明的载体或医药配方可通过任何已知的常规疗法，包括抗体投药、疫苗投药、细胞毒素剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应修饰剂的投药，诸如此类来补充治疗条件。为投药，本发明的配方是以由相关配方的LD-50或ED-50和成在各种浓度下，(包括(但不限于))当适用于患者的质量和总体健康时，非天然氨基酸多肽的任何副作用的观察所确定的施用率投与。投药可通过单一剂量或分次剂量完成。如果经历配方输注的患者感染发烧、受寒或肌肉疼痛，那么他/她可接受适当剂量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、乙酰胺苯酚或其他控制疼痛/发烧的药物。经历诸如发烧、肌肉疼痛和受寒的对输注的反应的患者，在未来输注之前，用阿斯匹林、乙酰胺苯酚或(包括(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)前驱用药30分钟。派替啶(Meperidine)是用于不能对退热剂和抗组胺快速作出反应的更严重的受寒和肌肉疼痛。视反应的严重性而减慢或中断细胞输注。本发明的人类hGH多肽可直接投与哺乳动物受检者。投药是通过通常用于将hGH多肽引入受检者的任何途径进行。尽管在任何给定情况下，最适合的途径将视所治疗的病况的性质和严重性而定，但是根据本发明实施例的hGH多肽组合物包括适于以下投药的所述组合物经口、直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、颊内(包括(但不限于)舌下)、阴道、不经肠(包括(但不限于)皮下、肌内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜內、脑内、动脉内或静脉内)、局部(意即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)和透皮投药。投药可为局部或全身投药。化合物配方可存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。本发明的hGH多肽可制备于呈单位剂量可注射形式(包括(但不限于).溶液、悬浮液或乳液)的与医药学上可接受的载剂或赋形剂的混合物中。本发明的hGH多肽也可通过连续输注((包括但不限于，使用诸如渗透泵的小型真空泵)、单次团注或缓慢释放储槽式配方来投与。适于投药的配方包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配方等渗的溶质的水性与非水性溶液、等渗无菌溶液，和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性与非水性无菌悬浮液。溶液和悬浮液可从前文描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。冷冻干燥是用于呈现蛋白质的常用技术，其用来从所关注的蛋白质制剂中去除水。冷冻干燥或冻干法是一种首先将待干燥的材料冷冻且随后通过在真空环境中升华去除冰或冷冻溶剂的方法。赋形剂可包括在预先冻干的配方中，以增强其在冷冻干燥过程中的稳定性和/或改良存储时冻干产品的稳定性。Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。医药品的喷雾干燥也已为所属领域的技术人员所知。举例而言，参看Broadhead，J.等人，"TheSprayDryingofPharmaceuticals,"inDrugDev.Ind.Pharm，18(11&12),1169-1206(1992)。除小分子医药品之外，也已将各种生物材料喷雾干燥并且所述生物材料包括酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是一项有用的技术，这是因为其可在单步骤方法中将液体医药制剂转化成精细、无尘的或成团的粉末。基本技术包含以下四个步骤a)将进料溶液雾化成喷雾；b)喷雾-空气接触；C)干燥喷雾；和d)使干燥产物与干燥空气分离。以引用的方式并入本文的美国专利第6,235,710号和第6,001,800号描述通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。本发明的医药组合物和配方可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂部分是通过所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法确定。因此，存在本发明的医药组合物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的多种适合的配方(例如参见iemz'"^o"'s/^a画ce祐ca/第17版,1985))。适合的载剂包括(但不限于)，含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、拧檬酸盐、组氨酸或组氨酸衍生物、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其他有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于约10个残基的所述多肽；蛋白质，包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷胺酰胺、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、天冬酰胺、精氨酸、谷氨酸或赖氨酸；单醣、二醣和其它碳水化合物类，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括(但不限于)EDTA;二价金属离子，包括(但不限于)锌、钴或铜；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子，包括(但不限于)钠；禾n/或非离子型表面活性剂，包括(但不限于)TweenTM(包括但不限于Tween80(聚山梨酸酯80)和Tween20(聚山梨酸酯20;PS20))、PluronicsTM和其他普流尼克酸(pluronicacid)，包括(但不限于)普流尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188))或PEG。适合的表面活性剂(例如)包括(但不限于)基于聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙垸)，意即，(PEO-PPO-PEO)的聚醚；或基于聚(环氧丙垸)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)，意即，(PPO-PEO-PPO)的聚醚；或其组合。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO是以商标名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM禾卩R-TetronicsTM(BASFWyandotteCorp.,Wyandotte,Mich)市售，并且另外描述于以引用的方式全部并入本文的美国专利第4，820，352号中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适合的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于使PEG化的hGH抗包括(但不限于)由搅动产生的应力的一种或一种以上应力稳定。一些上述表面活性剂可称为"膨胀剂"。一些也可以称为"张力改性剂"。额外载剂包括(但不限于)硫酸铵((NH4)S04)。硫酸铵((NH4)S04)可以在约0.1mM到约200mM范围内的量用于本发明的配方中，所述量包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、95mM、卯mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。组氨酸可以在约0.1mM到约200mM范围内的量用于本发明的配方中，所述量包括(但不限于)200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。在一些实施例中，组氨酸在配方中为约5mM与约30mM之间的量。本发明配方中的缓冲剂可在约0.1mM到约200mM范围内，包括(但不限于)200mM、l卯mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、95mM、卯mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、9mM、18mM、17mM、16mM、15mM、14mM、13mM、12mM、11mM、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM、0.9mM、0.8mM、0.7mM、0,6mM、0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM和0.1mM。在一些实施例中，缓冲剂的浓度为约0.1mM到约200mM。在一些实施例中，缓冲剂的浓度为约1mM到约75mM。在一些实施例中，缓冲剂的浓度为约1mM到约20mM。在一些实施例中，缓冲剂的浓度为约5mM到约30mM。本发明配方的缓冲剂可提供在约pH4.0到约pH8.5的pH值范围，包括(但不限于)pH8.5、pH8.0、pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5和pH4.0。pH值为上文所列举的那些pH值内的任何十等分的pH值；例如pH8.5、pH8.4、pH8,3、pH8.2、pH8.1、pH8.0、pH7.9、pH7.8、pH7.7、pH7.6、pH7.5、pH7.4、pH7.3、pH7.2、pH7.1、pH7.0、pH6.9、pH6.8、pH6.7、pH6.6、pH6.5、pH6.4、pH6.3、pH6.2、pH6.1、pH6.0、pH5.9、pH5.8、pH5.7、pH5.6、pH5.5、pH5.4、pH5.3、pH5.2、pH5,1、pH5.0、pH4.9、pH4.8、pH4.7、pH4.6、pH4.5、pH4.4、pH4.3、pH4.2、pH4.1和pH4.0。在一些实施例中，pH值是介于约pH6.0与约pH7,3之间。在一些实施例中，pH值是介于约pH5.5与约pH8.0之间。在一些实施例中，pH值是介于约pH4.0与约pH8.5之间。在一些实施例中，pH值是介于约pH4.0与约pH7.5之间。在一些实施例中，pH值是介于约pH6.0与约pH7.5之间。本发明配方中的氨基酸可在约O.lg/L到100g/L的范围内，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0,5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L禾卩0.1g/L。在一些实施例中，氨基酸是介于约0.1g/L与60g/L之间。在一些实施例中，氨基酸是介于约0.1g/L与100g/L之间。在一些实施例中，氨基酸是介于约1g/L与50g/L之间。在一些实施例中，氨基酸是介于约5g/L与25g/L之间。本发明配方中的糖醇可在约0.1g/L到100g/L的范围内，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.1g/L。在一些实施例中，糖醇是介于约O.lg/L与约60g/L之间。在一些实施例中，糖醇是介于约0.1g/L与约100g/L之间。在一些实施例中，糖醇是介于约1g/L与约50g/L之间。在一些实施例中，糖醇是介于约2g/L与约25g/L之间。本发明配方中的碳水化合物可在约0.1g/L到100g/L的范围内，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、Sg/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.1g/L。在一些实施例中，碳水化合物是介于约0.1g/L与约100g/L之间。在一些实施例中，碳水化合物是介于约1g/L与约50g/L之间。在一些实施例中，碳水化合物是介于约2g/L与约25g/L之间。在一些实施例中，碳水化合物是介于约0.1g/L与约50g/L之间。本发明配方中的二醣可在约0.1g/L到100g/L的范围内，包括(但不限于)100g/L、95g/L、90g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L和0.1g/L。在一些实施例中，二醣是介于约O.lg/L与约50g/L之间。本发明配方中的单醣可在约0.1g/L到100g/L的范围内，包括(但不限于)100g/L、95g/L、卯g/L、85g/L、80g/L、75g/L、70g/L、65g/L、60g/L、55g/L、50g/L、45g/L、40g/L、35g/L、30g/L、25g/L、20g/L、19g/L、18g/L、17g/L、16g/L、15g/L、14g/L、13g/L、12g/L、11g/L、10g/L、9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.9g/L、0.8g/L、0.7g/L、0.6g/L、0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L禾C10.1g/L。本发明配方中的非离子表面活性剂可在约o.oiy。到约10%的范围内，包括(但不限于)10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、20/0、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.0085%、0.008%、0.0075%、0.007%、0.0065%、0.006%、0.0055%、0.005%、0.0045%、0.004%、0.0035%、0.003%、0.00250/0、0.002%、0.0015%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0,0005%、0,0004%、0.0003%、0.0002%和0.0001%。在一些实施例中，非离子表面活性剂为约0.0001%到约10%。在一些实施例中，非离子表面活性剂为约0.01%到约10%。在一些实施例中，非离子表面活性剂为约0.1%到约5%。在一些实施例中，非离子表面活性剂为约0.1%到约1%。在一些实施例中，非离子表面活性剂为约0.0001°/。到约1%。本发明配方中hGH的医药量可在约0.1mg到约50mg的范围内，包括(但不限于)50mg、49mg、48mg、47mg、46mg、45mg、44mg、43mg、42mg、41mg、40mg、39mg、38mg、37mg、36mg、35mg、34mg、33mg、32mg、31mg、30mg、29.5mg、29mg、28.5mg、28mg、27.5mg、27mg、26.5mg、26mg、25.5mg、25mg、24.5mg、24mg、23.5mg、23mg、22.5mg、22mg、21.5mg、21mg、20.5mg、20mg、19.5mg、19mg、18.5mg、18mg、17.5mg、17mg、16,5mg、16mg、15.5mg、15mg、14.5mg、14mg、13.5mg、13mg、12.5mg、12mg、11.5mg、11mg、10.5mg、10mg、9,5mg、9mg、8.5mg、8mg、7.5mg、7.0mg、6.5mg、6.0mg、5.5mg、5.0mg、4.5mg、4.0mg、3,5mg、3.0mg、2.5mg、2.0mg、1.5mg、1.0mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg禾n0.1mg。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约2mg与约30mg之间。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约2mg与约25mg之间。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约0.1mg与约30mg之间。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约0.1mg与约8mg之间。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约0.5mg与约8mg之间。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约0.5mg与约6mg之间。在一些实施例中，配方中hGH的医药量是介于约1mg与约5mg之间。也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分投与本发明的hGH多肽，包括与诸如PEG的水溶性聚合物连接的多肽。持续释放组合物包括(包括(但不限于))呈包括(但不限于)膜或微胶囊的成形物品形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质包括生物相容材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(Langer等人，《/.Ao膨AMWer.15:267-277(1981);Langer,Oze附.7fecA.，12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，5z^ofymm,22,547-556(1983))、聚(原酸)酉旨、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物也包括脂质体诱捕化合物。含脂质体的化合物是通过本身已知的方法制备DE3,218,121;Eppstein等人，A^/.」cad,WS.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，ZVoc.iVa".爿co^.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;关国专利第4,619,794号；EP143,949;美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。经脂质体诱捕的hGH多肽可通过描述于(例如)DE3,218,121;E卯stein等人，ZVoc.AW/.Jc^/.Sc/.82:3688-3692(1985);Hwang等人，尸toc.7Va,/.爿cad.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美国专利第4,619,794号；EP143,949;美国专利第5,021,234号；日本专利申请案S3-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324中的方法制备。众所周知脂质体的组合物和尺寸或能够容易地由所属领域的技术人员根据经验确定。脂质体的一些实例如(例如)ParkJW等人，ZVoc.A^//.乂caJ.,92:1327-1331(1995);LasicD禾口PapahadjopoulosD(编辑)MEDICALAPPLICATIONSOFLIPOSOMES(1998);DmmmondDC等人，Liposomaldrugdeliverysystemsforcancertherapy,inTeicherB(编辑)CANCERDRUGDISCOVERYANDDEVELOPMENT(2002);ParkJW等人，C/z".Omceri仏8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，5z.oc&附.说op/y;j.爿"a1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，O"c"63:3154-3161(2003)中所述。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明的上下文中，投与患者的剂量应足以在受检者体内引起随时间的有益反应。一般地，每剂不经肠投与的本发明hGH多肽的总医药学有效量是在每公斤患者体重每天约0.01吗到约100叫或约0.05mg到约1mg的范围内，尽管所述有效量应服从治疗判断。给药的频率也应服从治疗判断，并且可比批准用于人类的市售hGH多肽产品的频率频繁或稀少。一般地，本发明的PEG化hGH多肽可通过上述任何投药途径投与。X/.本发敏/i(好多扁辦舰本发明的hGH多肽可用于治疗多种病症。举例而言，本发明的hGH激动剂多肽可用于治疗生长缺陷、免疫病症和刺激心脏功能。患有生长缺陷的个体包括(例如)患有特纳氏综合症的个体；缺乏GH的个体(包括儿童)；在生长板闭合前约2-3年内正常生长曲线经历延缓或延迟的儿童(有时称为"矮小儿童")；和类胰岛素生长因子I(IGF-1)对GH的反应已经化学阻断(意即，通过糖皮质激素治疗)或通过先天条件(诸如IGF-I对GH的反应先天减小的成年患者)阻断的个体。本发明的hGH多肽可用于治疗患有以下病况的个体儿科生长激素缺乏、特发性身材矮小、儿童期起始的成人生长激素缺乏、成人期起始的成人生长激素缺乏或继发性生长激素缺乏。在成人期诊断为生长激素缺乏的成人可能已具有垂体肿瘤或照射。包括(但不限于)代谢综合症、脑损伤、肥胖症、骨质疏松症或抑郁的病况可在成人体内导致类似于生长激素缺乏的症状。激动剂hGH变异体可通过增加其免疫功能而起到刺激哺乳动物免疫系统的作用，无论增加是由抗体介导还是细胞介导引起，且无论所述免疫系统对于经hGH多肽治疗的主体而言为内源性还是从供体移植到接受hGH多肽的主体接受者(如骨髓移植物)都是如此。"免疫病症"包括个体免疫系统相比正常系统对抗原具有降低的抗体或细胞反应的任何病况，所述个体包括(但不限于)因药物(例如化疗)治疗而具有降低的免疫性的小脾脏的个体。患有免疫病症的实例个体包括(例如)，老年患者；经历化学疗法或辐射疗法的个体；从重大疾病恢复或将要进行手术的个体；患AIDS的个体；患有诸如低丙种球蛋白血症、普遍变化的无丙种球蛋白血症和选择性免疫球蛋白不足(例如，IgA不足)的先天和后天B细胞不足的患者；感染诸如狂犬病的病毒，而潜伏时间比患者的免疫反应短的患者；和患有诸如迪格奥尔格综合症(diGeorgesyndrome)的遗传病症的个体。hGH拮抗剂多肽可用于治疗巨人症和肢端肥大症、糖尿病和由糖尿病引起的并发症(糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病变)、眼睛血管疾病(例如，涉及增生性新血管形成)、肾病和GH反应性恶性肿瘤。眼睛血管疾病包括(例如)视网膜病(例如由早产儿贫血病或镰刀形红细胞贫血病引起)和黄斑变性。GH反应性恶性肿瘤包括(例如)，威尔姆氏肿瘤(Wilm'stumor)、肉瘤(例如，骨源性肉瘤)、乳癌、结肠癌、前列腺癌和甲状腺癌和表达GH受体mRNA的组织的癌症(意即，胎盘、胸腺、脑、唾液腺、前列腺、骨髓、骨骼肌、气管、脊髓、视网膜、淋巴结的癌症和来自伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma),结肠直肠癌瘤、肺癌瘤、成淋巴细胞的白血病和黑素瘤的癌症)。本发明的GH(例如hGH)激动剂多肽可用于(例如)治疗慢性肾衰竭、与慢性肾功能不全(CRI)有关的生长不良、与特纳氏综合症(TurnerSyndrome)有关的身材矮小、儿科帕德维利综合症(Prader-WilliSyndrome,PWS)、具有消瘦或恶病体质的HIV患者、小于孕龄出生的儿童(SGA)、肥胖和骨质疏松症。hGH的平均量可变化且尤其应基于有资质的医师的推荐和处方。hGH的确切量优先对以下所述因素进行考虑所治疗的病况的确切类型、所治疗的患者的病况以及组合物中的其它成分。待给予的量可容易地由所属领域的技术人员基于使用hGH的疗法加以确定。本发明的医药组合物可以常规方式来制造。在本发明的另一实施例中，提供含有本发明配方的制造物品，并且提供有关其使用的说明。制造物品包含容器。制造物品可含有本发明的配方，包括(但不限于)其冻干、液体、喷雾干燥或其它形式的配方，且视需要含有有关其制备或复水的说明。适当容器包括(但不限于)例如瓶、小瓶、注射器、自动注射装置和测试管。所述容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。所述容器保存配方，且所述容器上或与其关联的标记可(视需要)指示有关冻干配方复水和/或使用的指导。举例而言，标记可指示将所述配方复水至特定蛋白质浓度。标记可另外指示，所述配方可用于或希望用于皮下投与。保存配方的容器可为一次性或多次使用的小瓶。在一实施例中，保存配方的容器为一次性小瓶。制造物品可另外包含第二容器，其包含适当稀释剂。在一实施例中，适当稀释剂为注射用(USP)无菌水或抑菌水。将稀释剂与冻干配方混合时，视需要，所述配方中最终蛋白质的浓度一般可在约2mg/ml与约50mg/ml之间。将稀释剂与冻干配方混合时，视需要，所述配方中最终蛋白质的浓度一般可在约2mg/ml与约25mg/ml之间。配方中最终蛋白质浓度一般可在约2mg/ml与约25mg/mL之间。在一实施例中，最终蛋白质浓度为约8mg/ml。制造物品可另外包括从商业和使用者立场看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和有关使用说明的包装插页。实例提供以下实例进行说明，但并非限制本发明。实例1用于调配Met-Y35pAFhGH的材料和方法本实例描述一项配方研究，其鉴别并评定在与PEG接合之前于储存期间保持Met-Y35pAFhGH的蛋白质结构和活性的适当条件和赋形剂。hGH的液体配方为冷冻配方，其含有(1)2.5g/L碳酸氢钠、20g/L甘氨酸、2g/L甘露糖醇、2g/L乳糖，pH7.3;或2)柠檬酸钠、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇，pH6.0。加入估计剂量的0.5-4mg/mlPEG-hGH作为活性成分。当前在-2(TC下储存这些配方。需要研发包含非天然编码的氨基酸的单剂量PEG化hGH冻干配方，或包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH液体配方。方法实施多种方法以表征Met-Y35pAFhGH的物理和化学稳定性。这些方法可用于有关PEG化hGH的配方研究中。以还原性凝胶进行的SDS-PAGE(SDS-PAGE-R)专门基于分子量使hGH分离，从而使任何潜在的降解产物显现，这是因为这项技术导致所有二硫键完全裂解，且引起多肽完全伸展。以非还原性凝胶进行的SDS-PAGE(SDS-PAGE-NR)是基于分子量使分子分离，从而能够鉴别潜在的hGH二聚体，这是由于蛋白质在无还原剂的情况下伸展，因此存留完整的二硫键。差示扫描量热法(DSC)用于测量因热变性而伸展的肽的AH(焓)。这一技术通过蛋白质全部熔解温度(Tm)的增加或降低反映评定不同溶液条件和赋形剂对蛋白质稳定性的影响。所使用的另一技术为基于相对疏水性分离分子的反相HPLC(RP-HPLC)。具体说来，本方法是基于疏水性与和结构修饰(诸如脱酰胺化和氧化)有关的保持行为的微小差异分离hGH。基质和溶液以U.S.P(美国药典)级或高分析级赋形剂设计具有四十八种基质的组合配方。所使用的基质、样本制剂和程序如下(表l):<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>所有赋形剂的储备液都经无菌过滤、载明日期并在4'C下储存。将糖制成100mM储备液，(NH4)S04为1M储备液且氨基酸为以下储备液浓度1M甘氨酸、666mM精氨酸或1M谷氨酸。实验当天将特定缓冲液制备为250mM到1M储备液(经无菌过滤并载明日期)，并且加入赋形剂直至最终浓度，无菌过滤并在4。C下储存。样本制备以4.425mg/ml将WHO缓冲液中具有在第35位经取代的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的甲硫氨酰基hGH(MetY35pAFcBl)样本分装于6个不同的小瓶中，并且在-80。C下冷冻直至研究当日。实验当天，在4。C下，通过在0.1-0.5mLSlide-a-lyzer中进行透析将MetY35pAF缓冲液更换成特定缓冲液。将约800|il425mg/mlMet-Y35pAFhGH透析到250mL缓冲液中历时至少4小时，并且改变透析缓冲液(250mL)供整夜透析用。使用500mL提供对WHO缓冲液赋形剂10,000，000倍的稀释。将样本从透析中移出并测量浓度。将各样本稀释到适当的浓度。对于DSC而言，所需最终浓度为0.75mg/ml(450|^1体积)。对于RP-HPLC而言，最终浓度为2mg/ml(30^体积)。在RP-HPLC上分析各个别基质组的十个样本。在4'C下将允许4个时间点(3天、l周、2周和1个月)的充足样本储存于管中。在-8(TC下，将用于5个冷冻/解冻循环的充足样本储存于小瓶中。在作为此项研究的一部分完成的一定数量的冷冻/解冻循环(l个、2个、3个、4个和5个循环)之前，可能存在一个或两个额外的冷冻/解冻循环。将4'C下0时间点时的样本迅速放于HPLC小瓶中。对于SDS-PAGE-R而言，将30pg(2mg/mL下0.015mL)材料用于分析。如RP-HPLC所示，将样本等分于三个小瓶中。对于SDS-PAGE-NR而言，将30吗(2mg/mL下0.015mL)材料用于分析。如RP-HPLC所示，将样本等分于三个小瓶中。在所有情况下，将任何剩余样本在-80'C下迅速冷冻。实例2有关Met-Y35pAFhGH配方研究的结果缓冲液pH值4'C下6周后分析所有配方缓冲液的pH值。如图1所示，己发现，所选择的所有缓冲液的pH值在经历6周的时间后仍稳定，但碳酸氢钠缓冲液(第E组)除外。第E组的pH值随时间变化而增加。SDS-PAGE-R和SDS國PAGE陽NR以SDS-PAGE还原性凝胶和非还原性凝胶进行的样本分析表明，在4t:下4周(1个月)后或在5个冷冻/解冻循环期间未发生变化。本方法并未发现二聚体形成或降解产物。第A组的还原性凝胶(4'C下，t=0、t=4周)展示于图2C和2D中，且第B组的非还原性凝胶(4'C下，t=0、t-4周)展示于图2A和2B中。差示扫描量热法(DSC)缓冲液和赋形剂对MetY35pAFhGH热稳定性的影响展示于图3-8中。图3A-F绘示重叠的配方组A-F的热概况。图5提供概括全部基质的DSC熔解温度和Tm改变的表格。B7和F2的基质热概况展示于图4A-B中。如图5和图6所示，缓冲液A具有最低T,如图5和图6中B7和C7基质所示，在第B组和第C组中精氨酸的Tm升高。在较高pH值(意即，pH〉7.0)下，MetY35pAFhGH展现出较高的热稳定性；然而，如图3和图4所示，已发现，其它亚群具有高得多的熔解温度和更宽的曲线。这些亚群可展现更高的稳定性或聚集倾向。氨基酸、尤其Arg和Glu以及(NH4)2S04在较高pH值下Tm降低。糖对全部Tm无影响。如图7所示，分析所有组的AHV/AH比率。已知重组hGH展现出AHV/AH>4。观察这一比率的变化；这些值表明MetY35pAF的伸展是不可逆的。随着pH值的增加，其它亚群也得以鉴别(也将pH7.5下第F组第2亚群的比率绘制于图7上)。各样本焓的改变(AUC)与图8所示类似，但在较高pH值下例外。在较高pH值下AH的差异可归因于引起较低AUC的错误宽转换。绘制每一组的AH(拟合AUC)图以确保每一组内获得类似值。反相HPLC(RP-HPLC)使用RP-HPLC分析在4'C下储存4周时MetY35pAFhGH的纯度和化学降解情况。图9A-D中展示第B组、第C组、第D组和第F组的数据集，其中各自将MetY35pAFhGH与WHOhGH标准品相比较。图10A描述使用AgilentChemstation软件分析第E5组中存在的不同峰(主峰、初级脱酰胺化/氧化峰和次级脱酰胺化峰)。如图IOB和图11所示，第E组的初级脱酰胺化/氧化峰随时间变化而增高；同时，在较高pH值下还展现出比较低pH值下高的脱酰胺化/氧化量。图12绘示次级脱酰胺化/氧化峰，表明所有配方组随时间变化具有较小可变性。如图13所示，对于所有配方组而言，主要GH峰随时间变化而减小，但第B组和第C组相比其它组展现出较少改变。第A组展现出极少的脱酰胺化作用，但主要GH峰确实随时间变化而减小，且除己知的脱酰胺化/氧化峰外的其它峰随时间变化逐渐显现。然而，第A组的数据表明，MetY35pAF在此pH值下于第0天到第3天时非常稳定，由于PEG化反应在pH4.0下经1天到2天发生，故此显得至关重要。也使用RP-HPLC分析已经历冷冻/解冻循环的样本。如图14(初级脱酰胺化/氧化峰)和图15(次级脱酰胺化峰)所示，第B组和第C组内的个别组看起来类似。如图16所示，两个冷冻/解冻循环后，主要GH峰减小，表明冷冻/解冻起作用。然而，在起始这项配方研究前这一样本中已发生一个或两个冷冻/解冻循环。研究结果概述已明确确定，hGH在较低pH值下展现出高度灵活的结构，且hGH在较高pH值下形成极其刚硬的结构(Kasimova等人J.Mol.Biol.2002318:679-695)。在所测试的缓冲液中，发现缓冲液B(20mM柠檬酸钠)在pH6.0下执行对于MetY35pAFhGH的化学和热动力学稳定性最佳。在pH6.0下加入精氨酸会增加MetY35pAFhGH的热稳定性。此时，糖对于MetY35pAFhGH不具有任何正面或负面影响；然而，糖可能对于PEG化事件前和PEG化事件后pH值转变极为重要。随时间变化，肟键在pH6.0下也可能比在较高pH值(诸如pH7.5)下更稳定。实例3PEG-hGH的稳定性概况是在加速稳定性条件下以关键配方参数检验，主要的降解产物已得以鉴别且稳定性指示检定也已得以确定。单剂量配方研究的主要目标在于，优化配方以使其最低限度在冷藏温度下具有足够的储存稳定性，且从而当在环境温度下储存时可具有足够的储存稳定性。除冻干配方的研究外，其它研究还调査对光曝露和搅动的敏感性、对使PEG化hGH与未PEG化形式的hGH相区分的RP-HPLC方法进行研究、结构分析和其它研究。成功的冻干配方通常展示出以下特征在调配和填充完成(fill-finish)过程中在溶液中对于处理具有稳定性；在冷冻-干燥期间具有良好稳定性；良好的储存稳定性；在干燥状态下(相关时)具有自然的结构；无明显的样本破裂或回熔；最佳的含水量；高的玻璃转变温度；粗糙的块状结构；有效的干燥循环；最小的注射疼痛；和当复水时于1分钟内溶解于充水式可注射物中。在一些实施例中，冻干配方的最佳含水量<3%水。在优选实施例中，冻干配方的最佳含水量<1%水。测定配方变量。在4(TC、环境温度和冷藏温度下，检验每周时间点时冻干配方候选物的稳定性历时长达4周、6周和2个月。同样，在环境温度和冷藏温度下历经长达3、4和6个月的增量检验冻干配方候选物的稳定性。也对在2-8t:下储存1周的复水形式的各配方的稳定性进行测试。分析方法包括上述SDS-PAGE方法、SEC-HPLC、离子交换HPLC、RP-HPLC和其它结构分析。测定可用于优化冻干循环以使配方最稳定的基本参数。举例而言，测定冷冻配方的坍塌温度(或玻璃转变温度)、退火温度和其它重要的物理特性。执行测试冻千方法以确定可以最佳循环获得理想的团块。实例4反相高效液相色谱(RP-HPLC)反相高效液相色谱(RP-HPLC)是一种基于相对疏水性分离分子的技术。使样本越过与烃链共价键接的二氧化硅固定相。所需分子经固定相延迟并用同溶剂(isocraticsolvent)洗提。色谱洗提时间为特定分子的特征。本方法基于疏水性与和结构修饰(诸如脱酰胺化)有关的保持行为的微小差异分离hGH。使用C4RP-HPLC评定重组人生长激素(hGH)的相对纯度和潜在化学降解(脱酰胺化和氧化)。本方法用于支持对于hGH的鉴别和纯度评定。使用本技术观察hGH的一些部分降解产物。有关本技术的参考文献包括欧洲药典2002，第193页；英国药典2001，第1938-1939页；禾卩R,M.Riggin等人AnalyticalBiochemistry167,199-209(1987)的"AReversed-PhaseHighPerformanceLiquidChromatographicMethodforCharacterizationofBiosyntheticHumanGrowthHormone"。用于本程序中的设备包括以下设备或其相当的设备UV/Vis分光光度计(Agilent8453或其相当物)；50pl石英皿；PD-IO、Nap-10或Nap5脱盐柱(视样本体积而定；AmershamBiosciencesNap5柱17-0853-02或其相当物)；0.5mLVivaspin浓縮器(视需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相当物)；HPLC小瓶和盖(Alltech100^1螺纹盖聚丙烯小瓶#12962、TFE线性盖弁73048、开孔螺纹盖#73044或其相当物)；1L和2L清洁玻璃瓶；柱，诸如VydacC4214TP54、尺寸为4.6x250mm、粒度为5|^且孔径为300A的C4-二氧化硅反相HPLC柱；和能够执行线性梯度的高效液相色谱仪(诸如，装备有真空除气器、四级泵、恒温自动取样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)和Chemstation色谱分析软件的Agilent1100HPLC)。除非另作说明，否则用于本程序中的试剂包括分析级或更好级别的固体化学品和HPLC级或更好级别的溶剂。所述化学品的实例包括TRIS-氨基丁三醇，U.S.P.级，SpectrumTR149,或其相当物；N-丙醇，HPLC级，99.9%,SigmaAldrich34871，或其相当物；和碳酸氢铵，超纯>99.5%,Fluka弁09830,或其相当物。额外溶液包括脱酰胺化对照的缓冲液(30mM碳酸氢铵，pH9.0)和流动相溶液。就脱酰胺化对照的缓冲液而言，将2.37g碳酸氢铵溶解于0.95LMilli-QH20中，用NaOH将pH值调到9.0，并且用Milli-QH20使体积达到1L。使用0.22PES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤所得缓冲液。就流动相溶液(50mMTris-HCl，pH7.5和29%正丙醇)而言，将6.05g氨基丁三醇(USP级，spectrum#TR149或其相当物)溶解于0.95LMilli-QH20中。用HCl使溶液达到pH7.5，并用Milli-QH20使体积达到1L。混合两种溶剂(TRIS和丙醇)，并且使用0.22PES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤混合物。'在RP-HPLC中用作标准品的样本包括以1.0ml水复水至1.9-2.1mg/ml的世界健康组织(WHO)hGH(目录号98/574)。其它hGH参考标准品可以1.9-2.1mg/ml的浓度使用。就分离溶液而言，使用PD-IO、Nap-10或Nap-5脱盐柱(视样本体积而定)将hGH标准品缓冲液更换成30mM碳酸氢铵(pH9.0)缓冲液。使用0.5mLVivaspin浓縮器将标准品浓缩到1.9-2.1mg/ml，在37'C下培育24小时，且接着在-8(TC下储存待用。将测试材料稀释到2.0mg/ml的蛋白质浓度以供分析。使用标准技术测量样本浓度。程序将仪器设置为以下条件1)柱VydacC4214TP54柱；2)泵设置一梯度等梯度；流速0.5ml/min;持续时间卯min;最大压力200巴；3)自动取样器温度4°C;4)注射器设置一注射标准注射；注射体积20^1;拉伸速度100nl/min;针的洗涤:用100^1水洗涤；注射速度100^1/min;停止时间与泵相同；5)DAD信号一表2;峰宽〉0.1min;狭缝4nm;停止时间75min;表2<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>6)柱恒温器一温度45°C;储存温度；7)初步积分事件一斜率0.1;峰宽0.5;最小峰面积(AreaReject):1.0;最小峰高1.0;积分开始10min。以IO柱体积(41.5ml=以0.5ml/min为83min)流动相平衡柱。使用自动取样器注入20|il标准品并运行HPLC程序。如果WHO标准品的保留时间不在33-35分钟之间，或其它标准品不在37-40分钟之间，那么调节流动相组合物，再次平衡柱并且再运行标准品。所建议的调节包括如果保留时间小于33分钟，那么每升流动相加入不到5mL50mMTris-HCl(pH7.5);且如果保留时间大于35分钟，那么加入不到2ml正丙醇。由于正丙醇可能出现蒸发，故每天测试样本时都需运行标准品，并且对缓冲液作相应调节。注入20^分离溶液并运行HPLC程序。在约0.85的保留时间时，脱酰胺基-hGH相对于主峰表现为较小峰。除非和hGH对应的峰与和脱酰胺基hGH对应的峰的分离度为至少l.O，且hGH峰的对称因子为0.8到1.8，否则测试无效。注入20pl测试物品并运行HPLC程序。运行样本三次。报导平均保留时间。可能需要对多个条件和/或参数进行修改以分析PEG化和其它形式的hGH。所属领域技术人员已知对于RP-HPLC进行的修改。数据分析将测试物品的平均保留时间与标准品的平均保留时间相比较。计算测试物品的平均纯度(主峰的积分面积/所有峰的积分面积)xlOO%。忽略由溶剂产生的任何峰。表3和图17中提供由关于MetY35pAFhGH与WHOhGH标准品的RP-HPLC产生的结果。诸如测试物品与参考标准品之间保留时间的差异和纯度的明细可随不同分子或分子形式(意即，将Y35pAFhGH与metY35pAFhGH相比较)而变化。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>实例5尺寸排阻色谱尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)是一项使用固定相作为透过流动相分子的多孔基质的技术。小到足以进入孔状结构的样本分子被延迟，而较大分子受排阻且因此被迅速载过柱。因此，.尺寸排阻色谱通过尺寸使分子分离，并且色谱洗提时间为特定分子的特征。SEC-HPLC用于评定重组人生长激素(hGH)的效力。SEC-HPLC是一种用于测定单体(PEG化和未PEG化)hGH的百分含量的方法。使用本技术也可观察二聚体和其它高分子量蛋白质。因此，本技术使样本中的单体与二聚体和其它较高分子量物质分离，且也使PEG化形式与未PEG化形式的单体分离。有关本技术的参考文献包括欧洲药典2002，第193页；英国药典2001，第1941页；和R.M.Riggin等人JournalofChromatography435(1988)，第307-318页的"High-PerformanceSize-ExclusionChromatographicDeterminationofthePotencyofBiosyntheticHumanGrowthHormoneProducts"。用于本程序中的设备包括以下设备或与其相当的设备UV/Vis分光光度计(Agilent8453或其相当物)；50^1石英皿；0.5mLVivaspin浓縮器(视需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相当物)；HPLC小瓶和盖(Alltech100^螺纹盖聚丙烯小瓶#12962、TFE线性盖弁73048、开孔螺纹盖#73044或其相当物)；1L和2L清洁玻璃瓶；柱，诸如TosohaasTSKSuperSW300018675和SuperSWGuardColumn18762、尺寸为4.6x300mm、粒度为4pm且孔径为300A的基于二氧化硅的尺寸排阻HPLC柱，以及尺寸为4.6x35mm且粒度为4pm的保护柱；和能够执行线性梯度的高效液相色谱仪(诸如，装备有真空除气器、四级泵、恒温自动取样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)、差示折光检测器(RID)和Chemstation色谱分析软件的Agilent1100HPLC)。除非另作说明，否则用于本程序中的试剂包括分析级或更好级别的固体化学品和HPLC级或更好级别的溶剂。所述化学品的实例包括磷酸二氢钠，SpectmmU.S.P.级S0130，或其相当物；磷酸氢二钠，SpectrumU.S.P.级S0140,或其相当物；2-丙醇，FisherHPLC级A451-4或其相当物。额外溶液包括流动相溶液(97%63mM磷酸钠，pH7.0;3%2-丙醇)和溶液A。为制得流动相溶液，将26.8g磷酸氢二钠溶解于1LMilli-QH20中，并且将13.79g磷酸二氢钠溶解于1LMilli-QH20中。混合两种溶液得到pH值为7.0的磷酸钠缓冲液,用Milli-Q1120将lOOmM磷酸钠(pH7.0)缓冲液稀释到63mM。将970mL63mM磷酸钠(pH7.0)与30mL2-丙醇(或获得97%63mM磷酸钠(pH7.0)、3%2-丙醇的其它适当体积)混合。使用0.22nmPES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤所得缓冲液。溶液A为25mM磷酸钠，pH7.0。用750mLMilli-QH20稀释250mL100mM磷酸钠(pH7.0)缓冲液。使用0.22pmPES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤所得缓冲液。在SEC-HPLC中用作标准品的样本包括经1.0ml水复水并稀释到0.9-1.1mg/ml的世界健康组织(WHO)hGH(目录号98/574)。其它hGH参考标准品可以0.9-1.1mg/ml的浓度使用。就分离溶液而言，在50'C下培育hGH标准品12-24小时，将其溶解于溶液A中，接着用溶液A将其稀释到1mg/ml并在-8(TC下储存待用。用溶液A将测试材料稀释到1.0mg/ml。使用标准技术测量样本浓度。程序将仪器设置为以下条件1)柱TSKSuperSW300018675和保护柱18762自动取样器；2)温度室温；3)泵设置一梯度等梯度；流速0.3ml/min;持续时间25min;最大压力120巴；4)注射器设置一注射标准注射；注射体积20拉伸速度100(al/min;注射速度100nl/min;针的洗涤100nlH2O;停止时间与泵相同；4)DAD信号一表4;峰宽〉0.05min;狭缝2nm;停止时间与泵相同；表4<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>5)RID信号一温度35°C;反应时间>0.2min4s，标准；6)柱恒温器温度23°C;储存温度。'用IO柱体积(50ml-以0.3毫升/分钟为166分钟)流动相平衡柱，并且在注入样本之前净化RID20分钟。注入20pl分离溶液。在所获得的色谱图中，1)主要未PEG化峰在约13-13.5分钟的保留时间时洗提；2)与hGH二聚体对应的峰在约12.2-12.6分钟的保留时间时洗提；和3)较高分子量蛋白质(未PEG化)在7.4-8.0分钟的保留时间时洗提。主要PEG化峰在约8.3-8.8分钟的保留时间时洗提。注入20pl标准品并运行HPLC程序。注入20nl测试物品并运行HPLC程序。运行样本三次。记录平均保留时间。可能需要对多个条件和/或参数进行修改以进一歩表征PEG化或其它形式的hGH。所属领域技术人员已知对于SEC-HPLC进行的修改。数据分析将hGH测试物品的保留时间与标准品的保留时间相比较。就未PEG化hGH的纯度测定而言，比较hGH测试物品和标准品的主峰积分面积，并以下式计算hGH测试物品中单体的百分含量(hGH样本的峰面积/标准品的峰面积)xi00%。也对hGH测试物品中二聚体和/或较大聚集体的百分含量进行计算。就PEG化hGH的纯度测定而言，比较PEG化hGH测试物品和标准品的主峰积分面积，并通过下式计算PEG化hGH样本中PEG化单体的百分含量(PEG化hGH样本的峰面积/标准品的峰面积)xiOO%。也对hGH测试物品中PEG化二聚体、较大聚集体和未PEG化单体的百分含量进行计算。或者，通过下式测定未PEG化hGH或PEG化hGH的纯度(hGH样本的主峰的积分面积/hGH样本所有峰的积分面积)x100%。忽略由溶剂产生的任何峰。也使用绝对质量或直接峰面积而非参考标准品的百分比来计算纯度测定值。详细说明hGH测试物品与标准品之间保留时间的差异为约〈士30秒。就二聚体和较高分子量蛋白质而言，在以测试物品获得色谱图中，保留时间小于主峰保留时间的任何峰面积的总和分别不大于峰总面积的4.0%或6.0%。忽略由溶剂产生的任何峰。图18绘示30KPEG-metY35pAF和metY35pAF的SEC-HPLC数据。实例6阳离子交换高效液相色谱(cIEX-HPLC)阳离子交换高效液相色谱(cIEX-HPLC)是一项依赖于固定于树脂上的蛋白质与电荷之间的电荷-电荷相互作用的技术。阳离子交换色谱利用与带负电树脂结合的蛋白质中带正电的离子。hGH的常用结构修饰为天冬酰胺(Asn)残基脱酰胺化，且此cIEX-HPLC方法允许PEG化和未PEG化hGH的已脱酰胺化和脱酰胺中间体分离。使用以下方法评定重组人生长激素(hGH)的相对纯度和潜在化学降解(意即，脱酰胺化)。本方法用于支持对于PEG化和未PEG化hGH的鉴别和纯度评定。使用本技术可观察hGH的一些部分降解产物。用于本程序中的设备包括以下设备或其相当的设备UV/Vis分光光度计(Agilent8453或其相当物)；50pl石英皿；0.5mLVivaspin浓缩器(视需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相当物)；HPLC小瓶和盖(Alltech100螺纹盖聚丙烯小瓶#12%2、TFE线性盖弁73048、开孔螺纹盖#73044或其相当物)；1L和2L清洁玻璃瓶;柱，诸如PolyCATA(4.6x200mm、5p、1000A)(204CT0510)禾口PolyCATA保护柱(4.6x10mm、5p、1000A)(JGCCT0510);和能够执行线性梯度的高效液相色谱仪(诸如，装备有真空除气器、四级泵、恒温自动取样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)、差示折光检测器(RID)和Chemstation色谱分析软件的Agilent1100HPLC)。除非另作说明，否则用于本程序中的试剂包括分析级或更好级别的固体化学品和HPLC级或更好级别的溶剂。所述化学品的实例包括乙酸铵，SpectrumHPLC级A2149,或其相当物；乙腈，FisherHPLC级A998，或其相当物；碳酸氢铵。额外溶液包括流动相A(40%乙腈，H20);流动相B(40%乙腈、500mM乙酸铵，pH4.5)和脱酰胺化对照的缓冲液(30mM碳酸氢铵，pH9.0)。就流动相A缓冲液而言，将400mLHPLC级乙腈与600mL经无菌过滤的Milli-QH20混合，并且使用0.22PES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤所得混合物。就流动相B缓冲液而言，将38.54g乙酸铵溶解于970mLMilli-QH20中。用冰乙酸使溶液达到pH4.5，且接着用Milli-QH20使体积达到1000mL。使用0.22PES过滤器(Corning#431098)无菌过滤缓冲液。将100mLMilli-QH20、400mLHPLC级乙腈禾口500mL500mM乙酸铵(pH4.5)混合。就脱酰胺化对照的缓冲液而言，将2.37g碳酸氢铵溶解于0.95LMilli-QH20中，并且用NaOH使pH值达到9.0。接着用Milli-QH20使体积达到1L。使用0.22PES过滤器(Corning弁431098或其相当物)无菌过滤所得缓冲液。在cIEX-HPLC中用作标准品的样本包括经1.0ml水复水并稀释到0.9-1.1mg/ml的世界健康组织(WHO)hGH(目录号98/574)。其它hGH参考标准品可以0.9-1.1mg/ml的浓度使用。就分离溶液而言，使用PD-IO、N叩-IO或Nap-5脱盐柱(视样本体积而定)将hGH标准品缓冲液更换成30mM碳酸氢铵(pH9.0)缓冲液。使用0.5mLVivaspin浓縮器将标准品浓缩到0.9-1.1mg/ml，在37"C下培育24小时，且接着在-8(TC下储存待用。将测试物品稀释到1.0mg/ml。包括经脱酰胺化的分离标准品。或者，将测试物品和标准品稀释成多种浓度。样本浓度是使用标准技术测量。程序将仪器设置成以下条件1)柱PolyCATA204CT0510和JGCCT0510;2)自动取样器温度4°C;3)泵设置一梯度5050-250mM乙酸钹，pH4.5;表5<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>6)柱恒温器温度2(TC;储存温度。用10柱体积90%流动相A和10%流动相B平衡柱。注入15分离溶液。就所获得的色谱图而言，主要未PEG化峰在约64-67分钟的保留时间时洗提；未PEG化脱酰胺化峰在约62-65分钟的保留时间时洗提；主要PEG化峰在约43-46分钟的保留时间时洗提；且PEG化脱酰胺化峰在约41-44分钟的保留时间时洗提。注入15pl标准品并运行HPLC程序。注入15pl测试物品并运行HPLC程序。运行样本三次。报导平均保留时间。可能需要对多个条件和/或参数进行修改以分析PEG化和其它形式的hGH。所属领域技术人员已知对于cIEX-HPLC进行的修改。其它参考标准品包括(但不限于)用于加工(in-process)释放主体pY35pAF的加工中的pY35pAF;用于量化PEG化pY35pAF中的残余游离pY35pAF的纯pY35pAF;和纯PEG-pY35pAF。数据分析将hGH测试物品与标准品的保留时间相比较，并且计算未PEG化hGH与PEG化hGH的纯度测定值。可通过诸如下式的计算式测定纯度(hGH样本的主峰积分面积/hGH样本所有峰的积分面积)xl00%。忽略由溶剂产生的任何峰。表6和图19绘示对30KPEGmY35pAFhGH和mY35pAFhGH的cIEX-HPLC分析。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>实例7本实例描述对乙酰基-D,L-苯丙氨酸(pAF)和间PEG-羟胺衍生物的合成。使用先前于Zhang,Z.，Smith,B.A.C.,Wang,L.，Brock,A.,Cho,C.&Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)6735-6746中所述的程序合成外消旋pAF。为合成间PEG-羟胺衍生物，完成以下程序。向在室温(RT)下搅拌1小时的(N-t-Boc-氨基氧基)乙酸(0.382g,2,0mmol)和1,3-二异丙基碳化二酰亚胺(0.16mL,1.0mmol)于二氯甲烷(DCM,70mL)中的溶液中加入甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2,7.5g,0.25mmol，Mt.30K，来自BioVectra)和二异丙基乙胺(0.1mL,0.5mmol)。在室温下搅拌反应48小时，且随后将其浓縮到约100mL。将混合物逐滴加入冷乙醚(800mL)中。经t-Boc保护的产物沉淀析出并通过过滤收集，用乙醚3X00mL加以洗涤。通过将其再溶解于DCM(lOOmL)中并在乙醚(800mL)中沉淀两次进一步加以纯化。真空干燥产物得到7.2g(96°/。)，以NMR和Nihydrin测试加以确定。(TC下于50%TFA/DCM(40mL)中进行以上获得的经保护产物(7.0g)的脱Boc反应历时l小时，且接着在室温下进行1.5小时。在真空中去除大部分TFA后，通过将二噁烷(1mL)中的4NHC1加入残余物中来将羟胺衍生物的TFA盐转换成HC1盐。将沉淀物溶解于DCM(50mL)中并在乙醚(800mL)中再沉淀。过滤收集终产物(6.8g，97%),用乙醚3x100mL洗涤，真空干燥，在氮气下储存。使用相同程序合成其它PEG(5K，20K)羟胺衍生物。实例8本实例描述用于包含非天然氨基酸的hGH多肽的表达和纯化方法。宿主细胞已经正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和hGH构筑体转化。37"下，首先使来自经转化DH10B(fis3)细胞的冷冻甘油储备液的小刺生长于具有100吗/ml氨比西林(ampicillin)的2ml指定培养基(补充有亮氨酸、异亮氨酸、痕量金属和维生素的葡萄糖基本培养基)中。当OD6oo达到2-5时，将60)d转移到60ml具有100pg/ml氨比西林的新制指定培养基中，且使其再在37'C下生长直至OD,达到2-5。在5升的发酵槽(SartoriusBBI)中，将50mL培养物转移到具有100吗/ml氨比西林的2升指定培养基中。用碳酸钾将发酵槽的pH值控制在pH6.9，温度为37'C，气体流速为5lpm且以聚烯烃消泡剂KF0F119(Lubrizol)消泡。自动调节搅拌器的速度以使溶氧含量保持在>30%，且如果搅拌器速度达到其最高值时使用纯氧补充空气喷射。37"C下8小时后，以成比例增加的速率向培养物中馈入50X指定培养基的浓縮物，以保持0.15h"的比生长速率。当OD,达到约100时，加入对乙酰基-苯丙氨酸的外消旋混合物直至3.3mM的最终浓度，并且将温度降到28°C。0.75小时后，加入异丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷直至0.25mM的最终浓度。使细胞在28'C下再生长S小时，压成球状并在-8(TC下冷冻直至进一步处理。通过Invitrogen使用手册所提供的标准His标记蛋白质纯化程序使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen,.Carlsbad,CA)随后阴离子交换柱纯化经His标记的突变体hGH蛋白。将经纯化的hGH浓缩到8mg/ml并将其缓冲液更换成反应缓冲液(20mM乙酸钠、150mMNaCl、1mMEDTA，pH4.0)。以20:1的PEG:hGH摩尔比率将MPEG-氧基胺粉末加入hGH溶液中。轻柔振荡下，于28'C下进行反应2天。通过阴离子交换柱从未经反应的PEG禾nhGH中纯化出PEG-hGH。实例9以SDS-PAGE进行的纯度分析使用以下方法评价PEG-重组hGH接合物的纯度SDS-PAGE，随后总蛋白质染色。当放于电场中时，任何带电分子(诸如蛋白质)都将迁移。蛋白质在电场中迁移的速度将视电场强度、蛋白质的净电荷和摩擦阻力而定。摩擦阻力是蛋白质大小和形状的函数。当在过量SDS存在下变性时，大部分蛋白质以恒定重量比与SDS结合，从而使其具有基本相同的电荷密度并且根据蛋白质大小在聚丙烯酰胺凝胶中迁移。由凝胶电泳分离的蛋白质可通过考马斯亮蓝染色(CoomassieBrilliantBluestaining)进行检测。用于本程序中的设备包括以下设备或其相当的设备XCellSurelockMini-Cell(Invitrogen)、微量恒温仪设置为+70-80。C、电源(至多200V)、微型离心机(诸如BeckmanCoulterMicrofuge18或22R)和往复式振荡器。试剂包括NuPAGEMOPSSDS执行缓冲液(20X,InvitrogenPNNP0001);NuPAGEMESSDS执行缓冲液(20X,InvitrogenPNNP0002);NuPAGELDS样本缓冲液(4X，InvitrogenPNNP0007);NuPAGE样本还原剂(10X,InvitrogenPNNP0009);12%Bis-TrisNuPAGE预制凝胶，1.0mmx10孔(InvitrogenPNNP0341BOX);4-12%Bis-TrisNuPAGE预制凝胶，1.0mmxio孔(InvitrogenPNNP0321BOX);预染分子量标记(SeeBluePlus2，InvitrogenPNLC5925);MilliQ级H20或其相当物；SimplyBlueSafeStain(InvitrogenPNLC6065)或其相当物；参考标准品(WHOrhGH标准品)；rhGH的校正溶液(Y35pAF-pB2/pB3,2mg/ml);pEG-rhGH接合物的校正溶液(PEG30-pY35pAF-01，2mg/mL)。使用此项技术中已知的标准技术测量标准品和测试物品的蛋白质浓度。PEG化rhGH产物的分析在非还原和还原条件下制备10吗参考标准品(RS，例如校正溶液PEG30-pY35pAF-01)。将10吗PEG30-pY35pAF-01(2mg/ml)加入4XLDS和MilliQH20中以获得IXLDS中的28pl样本。就还原条件而言，将10pg参考标准品加入4XLDS、IOX还原剂和MilliQH20中以获得IXLDS和IX还原剂中的28nl样本。类似地，也在非还原和还原条件下制备10PEG化rhGH测试物品。PEG-rhGH测试物品和PEG-rhGH参考标准品未经加热，但经历点动离心(snapcentrifuged)，随后将其装载于根据制造商的说明书以IXMESSDS执行缓冲液(runningbuffer)制备的4-12%Bis-TrisNuPAGE预制凝胶上。以预染分子量标记、10吗参考标准品、空白道(推荐使用以使潜在的转移作用减到最小)随后测试物品的顺序装载凝胶且最大设置为200V历时35分钟。将凝胶培育于di-H20中，在振荡下使用SimplyBlue或其相当物染色，且用水脱染色。PEG-rhGH测试物品的电泳图谱应与以PEG-rhGH参考标准品获得的电泳图谱相符。与参考标准品不匹配的任何谱带可能为降解产物或聚集体。较高分子量谱带可表示聚集体，且较低分子量谱带可表示不再与PEG接合的多肽。实例10以CEX-HPLC/IEX-HPLC进行的rhGH的纯度和化学降解分析使用以下方法通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)评定PEG化重组人生长激素(rhGH)的相对纯度和潜在化学降解(意即，脱酰胺化)。CEX-HPLC是一项依赖于固定于树脂上的蛋白质与电荷之间的电荷-电荷相互作用的技术。阳离子交换色谱利用与带负电树脂结合的蛋白质中带正电的离子。rhGH的常用结构修饰为天冬酰胺(Asn)残基脱酰胺化，且此CEX-HPLC方法允许PEG化和未PEG化rhGH的己脱酰胺化和脱酰胺中间体分离。本方法用于支持对于PEG化rhGH的鉴别和纯度评定。使用本技术可观察rhGH的一些部分降解产物。用于本程序中的设备包括以下设备或其相当的设备UV/Vis分光光度计(Agilent8453或其相当物);50pl石英皿;0.5mLVivaspin浓缩器(视需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相当物);PD-IO、NAP-10或NAP-5柱(GEHealthcare,目录号#17-0851-01、17-0853-01、17-0854-01);HPLC小瓶和盖(Alltech100jil螺纹盖聚丙烯小瓶#12962、TFE线性盖弁73048、开孔螺纹盖#73044或其相当物)；1L和2L清洁玻璃瓶；柱一PolyCATA(4.6x200mm、5|x、1000A)(PolyLC,204CT0510)和PolyCATA保护柱(4.6xl0mm、5n、1000A)(PolyLC,JGCCT0510);和能够执行线性梯度的高效液相色谱仪(诸如，装备有真空除气器、四级泵、恒温自动取样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)和Chemstation色谱分析软件的Agilent1100HPLC)。除非另作说明，否则用于本程序中的试剂包括水(Milli-Q级或其相当物)，且固体化学品为分析级或更好级别，同时溶剂为HPLC级或更好级别。除非另作说明，否则试剂的储存和程序步骤是在室温下发生。所述化学品的实例包括乙酸铵，SpectrumA2149,HPLC级，或其相当物；乙腈，FisherA998，HPLC级，或其相当物；碳酸氢铵，Fluka#09830，超纯>99.5%，或其相当物；冰乙酸，Fisher#64-19-7，HPLC级，或其相当物；二水合柠檬酸钠，SpectrumSOI65，USP级，或其相当物；甘氨酸，SpectrumAM125或其相当物；甘露糖醇，SpectrumMA165或其相当物；6NHC1，Mallinckrodt2662-46或其相当物。流动相A缓冲液为50mM乙酸铵(pH4.25)、40%乙腈(AcCN)，且流动相B缓冲液为500mM乙酸铵(pH4.25)、40%AcCN。所制备的其它试剂为10%乙酸；脱酰胺缓冲液30mM碳酸氢铵，pH9.0;和样本稀释缓冲液20mM柠檬酸钠、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇(pH6.0)，各自使用0.22pmPES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤。将世界健康组织(WHO)rhGH(目录号98/574)用作未PEG化的hGH标准品。使其在1.0ml水中复水并使用稀释缓冲液将其稀释到1.1mg/ml。加入10%(v/v)10%乙酸以使pH值介于pH3.8-4.3之间和1.0mg/ml(可接受的范围为0.9-1.1mg/ml)的最终浓度。以类似方式制备另一未PEG化的hGH标准品，校正溶液Y35pAF-pB2/pB3。也以类似方式制备PEG化hGH标准品，校正溶液PEG30-pY35pAF-01。就PEG化分离溶液而言，使用PD-10、Nap-10或Nap-5脱盐柱将PEG30-pY35pAF-01校正溶液缓冲液更换成30mM碳酸氢铵(pH9.0)缓冲液。使用0.5mLVivaspin浓縮器将标准品浓缩到约2mg/ml(可接受的范围为1.9-2.1mg/ml)，并且在37'C下培育样本24小时。使用稀释缓冲液将样本或所需的部分样本稀释到1.1mg/ml，并且加入10%(v/v)10%乙酸以使pH值介于pH3.8-4.3之间和1.0mg/ml(可接受的范围为0.9-1.1mg/ml)的最终浓度。使用稀释缓冲液将测试物品稀释到1.1mg/ml，并且加入10%(v/v)10°/。乙酸以使pH值介于pH3.8-4.3之间和1.0mg/ml(可接受的范围为0.9-1.0mg/ml)的最终浓度。使用此项技术中已知的标准技术测量标准品和测试物品的蛋白质浓度。程序将仪器设置为以下条件1)柱PolyCATA204CT0510和JGCCT0510;2)自动取样器温度室温；3)泵设置步骤梯度81.5-108.5mM乙酸铵pH4.25(7-13%B)，随后108.5-500mM乙酸铵pH4.25(13-100%B);4)表7;表7<table>complextableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>5)注射器设置一注射标准注射；注射体积25pi;拉伸速度50pl/min;注射速度50^1/min;针的洗涤15^1H20;停止时间与泵相同；6)DAD信号表8;表8<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>峰宽>0.1min;狭缝4nm;停止时间与泵相同；7)柱恒温器温度30°C;记录温度。用10-15柱体积100%流动相A平衡柱。注入25-50|ilPEG化的校正溶液PEG30-pY35pAF-01。主要PEG化峰在56.97min(±0.5min)的保留时间时洗提。接下来，注入25-50piWHO或校正溶液Y35pAF-pB2/pB3并运行HPLC程序。主要未PEG化的峰是在98.54min(±0.5min)的保留时间时洗提，与主要PEG化峰的相对保留时间为1.73±0.01。接着注入25-50^PEG化分离溶液。在所获得的色谱图中，主要PEG化峰是在56.97min(±0.5min)的保留时间时洗提，且PEG化脱酰胺峰相对于主峰(45.23±0.3min;(当前条件引起2.3±0.02的分离度))在0.79±0.02的保留时间时洗提。随后注入25-50^1PEG化测试物品并运行HPLC程序。运行样本三次，并记录平均保留时间。以吸光度(280nm)产生色谱图。数据分析将PEG化rhGH测试物品的保留时间与校正溶液PEG30-pY35pAF-01的保留时间相比较。使用下式计算测试物品的平均纯度(主峰的积分面积/所有峰的积分面积)x100%。忽略由溶剂产生的任何峰。实例11以SEC-HPLC对rhGH进行纯度测定使用本程序通过尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)评定重组人生长激素(rhGH)和PEG化rhGH的纯度。这项测试使样本中的单体与二聚体和具有较高分子量其它相关物质分离，且也使PEG化样本与未PEG化样本分离。SEC-HPLC是一项使用固定相作为透过流动相分子的多孔基质的技术。小到足以进入孔状结构的样本分子经延迟，而较大分子受排阻且因此被迅速载过柱。因此，尺寸排阻色谱意味着通过尺寸分离分子，并且色谱洗提时间为特定分子的特征。本程序用于测定单体(PEG化和未PEG化)AGH的百分含量。使用本技术也可观察二聚体和其它高分子量蛋白质。SEC-HPLC积分的实例如图20所示，其中y轴为吸光度(214nm)且x轴为时间(分钟)。有关本技术的参考文献包括欧洲药典2002，第193页；英国药典2001，第1941页；和R.M.Riggin等人JournalofChromatography435(1988)，第307-318页的"High-PerformanceSize-ExclusionChromatographicDeterminationofthePotencyofBiosyntheticHumanGrowthHormoneProducts"。用于本程序中的设备包括以下设备或其相当的设备UV/Vis分光光度计(Agilent8453或其相当物)；50pl石英皿；0.5mLVivaspin浓缩器(视需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相当物)；HPLC小瓶和盖(Alltech100^螺纹盖聚丙烯小瓶#12962、TFE线性盖存73048、开孔螺纹盖#73044或其相当物)；1L和2L清洁玻璃瓶；柱一TosohaasTSKSuperSW300018675和SuperSW保护柱18762、尺寸为4.6x300mm、粒度为4pm且孔径为250A的基于二氧化硅的尺寸排阻HPLC柱，以及尺寸为4.6x35mm且粒度为4p的保护柱；和能够执行线性梯度的高效液相色谱仪(诸如，装备有真空除气器、四级泵、恒温自动取样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)、差示折光检测器(RID)和Chemstation色谱分析软件的Agilent1100HPLC)。除非另作说明，否则用于本程序中的试剂包括水(Mmi-Q级或其相当物)，且固体化学品为分析级或更好级别，同时溶剂为HPLC级或更好级别。除非另作说明，否则试剂的储存和程序步骤是在室温下发生。所述化学品的实例包括磷酸二氢钠，SpectrumU.S.P.级S0130,或其相当物；七水合磷酸氢二钠，SpectrumU.S.P.级S0140或其相当物；2-丙醇，FisherHPLC级A451-4，或其相当物。流动相缓冲液为97%63mM磷酸钠(pH7.0)、3%2-丙醇。溶液A为25mM磷酸钠，pH7.0。使用0.22PES过滤器(Corning#431098或其相当物)无菌过滤两种溶液。将世界健康组织(WHO)rhGH(目录号98/574)用作未PEG化的hGH标准品。用l.Oml水使其复水并且用WHO缓冲液将其稀释到1mg/ml浓度(可接受的范围为0.9-1.1mg/ml)。以类似方式制备另一未PEG化的hGH标准品，校正溶液Y35pAF-pB2/pB3，并且用20mM柠檬酸钠、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀释。也以类似方式制备PEG化hGH标准品，校正溶液PEG30-pY35pAF-01，并且用20mM柠檬酸钠、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀释。就分离溶液而言，使PEG30-pY35pAF-02更高分子量标准品达到1mg/ml的浓度(可接受的范围为0.9-1.1mg/ml)。本溶液含有约33%PEG-PEG-GH、66.5%PEG-GH。用溶液A将测试材料稀释到约1.0mg/ml(可接受的范围为0.9-1.1mg/ml)。使用此项技术中已知的标准技术测量所有样本的浓度。可以任何适当缓冲液执行对样本的稀释。程序将仪器设置为以下条件1)柱TSKS叩erSW300018675和保护柱18762;2)泵设置一梯度等梯度；流速0.3ml/min;持续时间25min;最大压力120巴；3)注射器设置一注射标准注射；注射体积10pi;拉伸速度100nl/min;注射速度100pl/min;针的洗涤100|llH2O;停止时间与泵相同；4)DAD信号表9;表9<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>峰宽>0.05min;狭缝:2nm;停止时间与泵相同；5)RID信号一温度35°C;反应时间〉0.2min4s，标准；6)柱恒温器温度23°C;记录温度。用10柱体积(50m卜以0.3毫升/分钟为166分钟)流动相平衡柱，并且在注射样本之前净化RID至少20分钟。运行样本前自动平衡DAD和RI检测器。注入20nl校正溶液Y35pAF-pB2/pB3(或WHO标准品)并运行HPLC程序。在所获得的色谱图中，主要未PEG化的峰在约12.96(±0.05)min的保留时间时洗提。具有较高分子量的未PEG化rhGH二聚体相对于主峰在0.94±0.02的保留时间时洗提。具有较高分子量的聚集体在7.3-8.0min的保留时间时洗提。注入20pl校正溶液PEG30-pY35pAF-01。主要PEG化峰是在约8.33(±0.08)min(与未PEG化的AGH的相对保留时间为0.64)的保留时间时洗提。具有较高分子量的PEG化rhGH聚集体在大于8.0min的时间时洗提。注入20|xl分离溶液并运行HPLC程序。主要PEG化的峰是在8.28min的保留时间时洗提，且具有较高分子量的物质在7.54min时洗提，相对于主要PEG化峰的相对保留时间为0.9(±0.05)。注入20Ml测试物品并运行HPLC程序。运行样本三次，并记录平均保留时间。将rhGH测试物品的保留时间与rhGH标准品的保留时间相比较。将来自测试物品的SEC-HPLC数据与从参考标准品获得的数据相比较。为测定PEG化rhGH的纯度，将PEG化rhGH样本的主峰积分面积与峰总面积相比较，并且通过下式计算PEG-rhGH样本中PEG化单体的百分含量(PEG-rhGH样本的主峰面积/全部峰面积)xi00%。也对PEG化hGH测试物品中PEG化二聚体、较大聚集体和/或未PEG化单体的百分含量进行计算。忽略由溶剂产生的任何峰。在主要PEG化hGH峰之前于色谱图中洗提的峰表示具有较高分子量的物质。所述具有较高分子量的物质可包括(但不限于)二聚体(诸如PEG-PEG-hGH和其它可能的二聚体)或可溶聚集体。在主要PEG化hGH峰后洗提的峰表示具有较低分子量的物质。所述具有较低分子量的物质可包括(但不限于)未PEG化的单体和剪短形式的PEG化hGH。实例12以RP-HPLC进行的PEG-hGH的纯度和化学降解分析使用以下方法通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)评定PEG化重组人生长激素(PEG-hGH)的相对纯度和潜在化学降解(意即，氧化)。RP-HPLC是一种基于相对疏水性分离分子的技术。使样本越过与烃链共价键接的二氧化硅固定相。所需分子经固定相延迟并用同溶剂洗提。色谱洗提时间为特定分子的特征。本方法基于疏水性与和结构修饰(诸如氧化)有关的保持行为的微小差异使PEG-hGH与未PEG化hGH以及同功异型物分离。本方法用于支持对于PEG-hGH的鉴别和纯度评定。使用本技术可观察rhGH的一些部分降解产物。RP-HPLC积分的实例如图21所示，其中y轴为吸光度(214nm)且x轴为时间(分钟)。用于本程序中的设备包括以下设备或其相当的设备UV/Vis分光光度计(Agilent8453或其相当物);50nl石英皿;0.5mLVivaspin浓縮器(视需要，Vivascience10,000MWCO、PES、VS0102或其相当物)；HPLC小瓶和盖(Alltech100pl螺纹盖聚丙烯小瓶#12962、TFE线性盖弁73048、开孔螺纹盖#73044或其相当物)；1L和2L清洁玻璃瓶;柱一J.T.BakerWidePoreButyl，250x4.6mm(目录号7H6-00);和能够执行线性梯度的高效液相色谱仪(诸如，装备有真空除气器、四级泵、恒温自动取样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)Chemstation色谱分析软件的Agilent1100HPLC)。除非另作说明，否则用于本程序中的试剂包括水(Milli-Q级或其相当物)，且固体化学品为分析级或更好级别，同时溶剂为HPLC级或更好级别。除非另作说明，否则试剂的储存和程序步骤是在室温下发生。所述化学品的实例包括乙腈，FisherA998,HPLC级，或其相当物；三氟乙酸，HalocarbonUN2699，Biograde，或其相当物，'磷酸钠，SpectrumMA1654，USP级，或其相当物；甘氨酸，SpectrumAMI25，或其相当物；甘露糖醇，SpectrumMA165，或其相当物；海藻糖，Fluka90208，或其相当物；10N氢氧化钠，或其相当物。流动相A为0.1%TFA水溶液，且流动相B为乙腈中的0.1%TFA。一种未PEG化标准品为世界健康组织(WHO)rhGH(目录号98/574)。用1.0ml水使其复水并且用WHO缓冲液将其稀释到1.0mg/ml(可接受的范围为0.9-1.1mg/ml)。以类似方式制备另一未PEG化的标准品，校正溶液Y35pAF-pB2/pB3，并且用20mM柠檬酸钠、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀释。也以类似方式制备校正溶液PEG30-pY35pAF-01，PEG化hGH标准品，并且用20mM柠檬酸钠、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)加以稀释。就PEG化的分离溶液而言，在4'C下以0.1%11202培育PEG30-pY35pAF-0124小时以氧化PEG30-pY35pAF-01。为获得氧化程度在5%与20%之间的PEG30-pY35pAF-01，所述用H202进行培育的时间可在4-24小时之间变化。可视需要加入催化酶(20mg/ml储备液)以终止氧化反应。使用稀释缓冲液将测试物品稀释到1.0mg/ml(可接受的范围为0.9-1.0mg/ml)。样本稀释缓冲液可为任何适当的缓冲液。使用此项技术中已知的标准技术测量标准品和测试物品的蛋白质浓度。程序将仪器设置为以下条件1)柱J.T.BakerWidePoreButyl，250x4.6mm(目录号7116-00);2)自动取样器一温度4°C;3)泵设置表10;表10<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>4)注射器设置一注射标准注射；注射体积10^1;拉伸速度100pl/min;注射速度lOO^l/min;针的洗涤20^llH20;停止时间与泵相同；5)DAD信号表ll;表11<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>峰宽〉0.1min;狭缝4nm;停止时间与泵相同；6)柱恒温器温度RT;记录温度。用10CVHPLC级蒸馏水冲洗新柱以去除运载溶剂。用MillQH20中的60%异丙醇中的10-15柱体积(CV)0.1。/。TFA和10-15CVH20清洗柱。视需要，可接着以5CV50:50的DMSO:H20清洗柱；另外，用流动相A平衡柱。用10-15柱体积100%流动相A平衡柱。注入10|ilPEG化校正溶液PEG30-pY35pAF-01。主要PEG化峰在17.05min(±0.5min)的保留时间时洗提。注入10nlWHO或校正溶液Y35pAF-pB2/pB3并运行HPLC程序。主要未PEG化的峰是在19.04min(±0.5min)的保留时间时洗提，与主要PEG化峰的相对保留时间为1.1±0.05。接着注入IO^PEG化分离溶液。在所获得的色谱图中，主要PEG化峰是在17.12min(±0.5min)的保留时间时洗提，且PEG化经氧化峰相对于主峰(15.94±0.3min和2.97±0.05的分辨度))在0.93±0.02的保留时间时洗提。注入10(xlPEG化测试物品并运行HPLC程序。运行样本三次，并记录平均保留时间。将PEG化rhGH测试物品的保留时间(使用A214)与校正溶液PEG30-pY35pAF-01的保留时间相比较。使用下式计算测试物品(使用A214)的平均纯度(主峰的积分面积/所有峰的积分面积)xi00%。忽略由溶剂产生的任何峰。实例13有关配方研究中所使用的方法的概述展示于表12中。长期储存、碱性或酸性条件可导致以下与产物相关的杂质脱酰胺化hGH—Asn149、Asnl52;经氧化hGH—Met14、Metl25;异构化hGH—Aspl30;脱水hGH—Aspl30;脱Phe/脱Phe-Pro-Phel、Pro2(非酶裂解)；二聚体(共价和非共价物质)；剪短hGH(Thrl42与Tyrl43之间裂解)。.使用额外方法(诸如水分分析、pH值和包括但不限于增殖检定的生物检定)评估包含非天然编码的氨基酸的PEG化hGH配方。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>结果含水量、pH值和浓度结果展示于表14-32中。表14:复水后水分、浓度、pH值，T=0<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表16:复水后浓度、pH值，了=1周，4°C<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表28:复水后浓度、pH。LT=l周，40°C配<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表30:复水后浓度、pH值，T:4周，40°C<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>本研究的SDS凝胶展示于图22-58中。在图22第3道和第4道中可见模糊的21.5kDa谱市。SEC-HPLC:图20为SEC-HPLC积分的实例。表33-50展示由本研究获得的结果。剪短峰是在主要PEG化hGH峰与未PEG化峰之间洗提。表33:SEC-HPLC(峰面积概要)；T=0<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表34:SEC-HPLC(峰面积概要)；1=1周，4°C<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表35:SEC-HPLC(峰面积概要)；T-2周，4°C<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表44:SEC-HPLC(峰面积概要)；T-2个月，25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表55:RP-HPLC(峰面积概要)；T-6周4。C<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>表58:RP-HPLC(峰面积概要)；T-l周；25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>表62:RP-HPLC(峰面积概要)；T-2个月；25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>表63:RP-HPLC(峰面积概要)；1=3个月；25°C<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage135</image>表66:RP-HPLC(峰面积概要)；T-4周；40°C<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table>醇、2%海藻糖、0.01%聚山梨醇酯20(pH6.0)(配方E^P6MT缓冲液)中8、10、12和14mg/mLPEG-hGH的注射可行性。在8lbs力下将样本推过30号针并定时持续时间。当在8lbs力下将1mL各浓度推过30号针时，将8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL禾口14mg/mL浓度分别以7.4s(秒)、9.9s、9.9s禾P10.7s注入。由于普通人可在注射器上施加至多8lbs力，故一般将在8lbs力下于IO秒内注入1cc接受为注射标准。实例16一周复水研究就本研究而言，在4'C下储存经复水样本1周。本研究中所使用的配方基质与表13相同。储存1周后，测量浓度和pH值。如表72-74和图59-60所示，也通过SEC-HPLC、RP-HPLC和SDS-PAGE分析样本。<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table>在4'C下储存复水样本1周会导致P6MT、P6MTMet、P7GT和P6GT-P的峰前1略有增加(约1%)。具有较低pH值的样本比pH6和7的样本展现出更多脱PEG化作用。实例17搅动/UV研究使样本经历可模拟长期储存条件的压力，并观察降解或聚集产物的诱导。曝露至UV光后，分子中或尤其在肟或PEG处可出现降解。执行两项搅动研究。在4小时的搅动研究中，在环境温度下用力涡旋表13的复水样本4小时，随后测量浓度和pH值，并且通过SEC-HPLC、RP-HPLC禾QSDS-PAGE执行分析。在4'C下储存后一周后通过SEC-HPLC分析一小组这些样本，以调查聚集体是否可能解离成单体。对照样本为在环境室温下储存4小时的复水样本。在2小时的搅动研究中，在环境温度下轻柔涡旋无聚山梨醇酯的样本、其含聚山梨醇酯的相应物和P6MA，以确定搅动后聚山梨醇酯对PEG化hGH稳定性的影响。参看表85。就UV曝露研究而言，对照为在环境室温下储存4小时的复水样本。在环境温度下将冻干样本曝露至UV光历时4小时，并使其在水中复水，随后通过SDS-PAGE、RP-HPLC和SEC-HPLC加以分析。参看表75-85。'这些样本的SDS-PAGE分析展示于图61-66中。SEC-HPLC数据表明0.01%含有聚山梨醇酯20的配方在搅动期间诱导聚集(30-80%)。Bam,NB等人描述在搅动重组hGH(rhGH)过程中使用Tween20(聚山梨醇酯20)抑制不溶聚集体(JPharmSci.1998Dec;87(12):1554-9)。此外，Maa，YF等人指出，聚山梨醇酯20将在制造经喷雾干燥的rhGH粉末时使不溶蛋白质聚集体减少(JPharmSci1998Feb;87(2):152-9)。已发现搅动诱导的聚集体将为不可逆非共价聚集体。主要的光诱导降解路径为脱PEG化和形成共价峰前2。表75:浓度，pH，搅动/UV对照<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>表88:SEC-HPLC(峰面积概要)；搅动T二0<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table>在搅动下痕量的聚山梨醇酯诱发聚集。当搅动时，组氨酸配方的执行情况可与含甘氨酸配方相比。实例19有关加速聚集的研究执行加速压力研究以模拟长期储存的条件并且鉴别可能降解或聚集的产物。有关加速聚集的研究是使用约8mg/ml和14mg/ml的2种配方(配方IDH7MT-P和H7MGT-P)执行。配方组份描述于表91中。"-P"标记表示无聚山梨醇酯20。压力研究为冷冻-解冻条件、搅动、UV曝露和温度。上述方法是用于评定PEG化hGH。样本是通过分别在实例9和11中描述的SDS-PAGE和SEC-HPLC方法评定。供分析的额外时间点包括1个月、2个月等。用于样本分析的额外技术包括动态光散射(DLS)和分析型超速离心。表91:基质配方(加速聚集的研究)<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table>表95:SEC-HPLC(峰面积概要)配方ID:H7MGT-P;浓度14mg/mL<table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table>样本的冷冻/解冻使较高MW的聚集体增加0.2-0.3%，且在第一个冷冻-解冻周期后8mg/mL样本中具有较高MW的聚集体可能解离。涡旋/UV曝露就本研究而言，使用表91中所示的配方基质。对于搅动(涡旋)和UV曝露研究中的对照样本而言，使配方在室温下保持6小时。在搅动研究中，在室温下以高速涡旋液体样本6小时。在UV曝露的研究中，在室温下将冻干样本曝露到UV光历时4小时，并且使其复水随后进行分析。移出样本供SEC-HPLC和SDS-PAGE分析。表96-98展示对照样本、涡旋样本和UV曝露样本的SEC-HPLC数据。这些样本的SDS-PAGE分析如图71和图72所示。表96:SEC-HPLC(峰面积概要)；涡旋/UV对照<table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>表101:SEC-HPLC(峰面积概要)；1=1周；40°C<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>在4。C下1周后，H7MT-P产生比H7MGT-P少的较高分子量聚集体。在4(TC下，H7MT-P导致比H7MGT-P略多的二聚体形成但比H7MGT-P少的脱PEG化hGH。两周后，在4(TC下观察到二聚作用的量增加。在4(TC下观察到显著脱PEG化。在4(TC下H7MT-P形成比H7MGT-P少的脱PEG化hGH。额外的时间点包括在4周时进行的测量。此外，将PEG化hGH的样本暴露至热伸展条件。在85。C下培育热伸展样本10分钟，所述温度高于82'C的熔解温度(Tm)。热伸展诱导聚集。表103展示对于暴露至热伸展条件的样本的SEC-HPLC分析。SDS-PAGE分析展示于图73-74中。表103:SEC-HPLC(峰面积概要)；热伸展<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>实例20FT7IR(傅立叶转换红外光谱(FourierTransformInfraredSpectroscopy))扫描以FT/IR执行对PEG化hGH的分析。FT/IR扫描是在Jasco型FT/IR600Plus上执行。以4cm"的解析度扫描各样本320次，并用JascoSpectraManagervl.53.00进行分析。在运行每天的样本之前，取得空气背景值和水空白值。通过在1700cm"下不存在吸光度来确定源自水的信号的消除。将适当背景值和空白对照从各样本光谱中减去后，在酰胺I区(1600-1700cm—"中执行对剩余蛋白质和赋形剂峰的二阶导数分析。将6mg/mL的PEG-hGH整体用作液体对照。PEG-hGH的酰胺I信号甚至在冻干后仍较之其它蛋白质相对较弱。然而，大部分样本在1651cm—'处都展示出a螺旋的信号，因此，可实现配方候选物之间的定性比较。甘氨酸在酰胺I区处展示出强信号，因此，所述信号可能在将甘氨酸信号从原始数据中减去的过程中已失真。与液体对照进行比较的P6MT、S4MT、S5MT、H6MT、P6GT、P6MS、P6MTmet、P7MT和P6MT-P配方的二阶FTIR光谱[信号强度(y轴)对波数(以cm"为单位)(x轴)]表明1)不管缓冲剂或pH值如何，大部分甘露糖醇配方都保持良好的a螺旋信号；2)—种配方，即含有甘氨酸的P6GT展现出频带信号的显著转移；3)在1620、1630、1725和1750处观察到其它峰。S5GT、P6MA、P7GT、P6MGT、P6MGT-P禾QP6GT-P配方的二阶FTIR光谱具有弱a螺旋^号。而且，所有甘氨酸配方都展示出与液体样本的自然信号的显著偏差。含有精氨酸的配方在冻干过程中展现出主要的结构改变。在4。C下储存冻干材料两个月后，执行FT/IR。PEG-hGH的酰胺I信号甚至在冻干后仍较之其它蛋白质相对较弱。然而，大部分样本在1651cm—i处都展示出a螺旋的信号，因此，可实现配方候选物之间的定性比较。甘氨酸在酰胺I区处展示出强信号。两个月时，所有甘氨酸配方都展示出与液体样本的自然信号的显著偏差。不管缓冲剂或pH值如何，大部分甘露糖醇配方都保持良好的a螺旋信号。实例21搅动(表面活性剂测试)用H7MT-P将20mM柠檬酸钠、2%甘氨酸、0.5%甘露糖醇(pH6)中的PEG-hGH稀释到2mg/mL。将0.01%聚山梨醇酯20(PS)加入一个样本中，0.01%普流尼克F68(PluronicF68)(F68)加入另一样本中，且第三个样本中未加入任何表面活性剂。用500^L填充玻璃瓶执行搅动。在室温下搅动样本1小时。对样本的SEC-HPLC分析展示于表104中；经搅动的样本标注有"Vtx"。表104:SEC-HPLC(峰面积概要)；搅动及表面活性剂配方ID峰前1+2%主峰％Un-PEG%总面积H7MT-P,t=02.8498.1605.81E+04H7MT,0.01%PS,t=01.4998.5105.59E+04H7MT,0.01%F68,t=01.5898.4205.75E+04H7MT-P,1hrVtx12.5487.4605.79E+04H7MT,0.01%PS,1hrVtx57.2142.7906.13E+04H7MT，0.01%F68,1hrVtx4.4395.5705.58E+04如表104所示，相对于所测试的其它样本，普流尼克F68对于防止搅动诱发的聚集最有效。其它实验可包括透析所述样本而非将其稀释以去除残余赋形剂，和/或测试其它表面活性剂，包括(但不限于)聚山梨醇酯80。表面活性剂可单独使用或与一种或一种以上其它表面活性剂组合使用。其它研究包括测试以下表面活性剂对H7MT配方中PEG-hGH对抗搅动诱发的聚集的稳定性的影响1)无表面活性剂(阴性对照)；2)各种量(包括但不限于0.01%)的聚山梨醇酯20;3)各种量(包括但不限于，0.005%、0.01%、0.05%和0.1%)的普流尼克F68(或泊洛沙姆188(Poloxamer188));4)各种量(包括但不限于0.01%)的聚山梨醇酯80;禾G5)普流尼克F68与聚山梨醇酯20或普流尼克F68与其它表面活性剂的组合。将制备含有最佳表面活性剂或表面活性剂组合的其它冻干配方(H7MT)，并且将其在4(TC下的稳定性与H7MT配方相比较。PEG-hGH的浓度将为2mg/ml，且分析时间点将在O、1、2、3和4周或更长时间时。将使用本文所述的技术进行分析。实例22长期研究额外的长期稳定性研究包括评估在各种温度下储存后的配方，包括(但不限于)在4。C和29。C下储存0、3、6、9、12、18和24个月。可在于2-8。C储存各种时间长度(诸如0、l天、3天和1周)的过程中调査冻干后复水的样本的稳定性。实例23有关冻干配方的研究额外数据是由实例14中所讨论的有关冻干配方的研究产生。历时四个月的时间点产生的数据包括SDS凝胶(在4"C和25'C下储存4个月的样本；图77-80);复水后的浓度和pH值(表105-106);对于在4'C和25。C下储存4个月的样本的SEC-HPLC分析(表107-108);和对于在4。C和25°。下储存4个月的样本的RP-HPLC分析(表109-110)。四个月后，持续研究含有组氨酸的配方以通过对于所测试的配方的SDS-PAGE展示共价聚集体的最少量。最后两个月后，H6MT和P7MT在25'C下已展示出最小改变。<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>实例24对于组氨酸与PEG-HGH的相互作用的研究这项研究的目的是调查当加入至少8mg/mL浓度的PEG-HGH时己于10mM组氨酸缓冲剂、4%甘露糖醇、2%海藻糖(pH7.0)中观察到的pH值降低。本研究还调査组氨酸配方的浓度依赖性pH值改变是否归因于组氨酸与PEG-hGH的结合。可将用于测定游离/结合组氨酸的RP-HPLC和/或IEX-HPLC方法用于所述研究中。对于5mg/mL和25mg/mLPEG-hGH的透析将一种或一种以上浓度的PEG-hGH对以下缓冲剂透析10mMNa2HPO4，pH7.1;10mM组氨酸(pH7.0);10mM组氨酸(游离碱)，pH7.7;30mM组氨酸(游离碱)，pH7.7。透析后测量蛋白质的pH值。通过执行SEC-HPLC并测量在蛋白质峰后洗提的组氨酸峰来测定组氨酸的量。比较214nm:280nm以确定组氨酸是否与PEG-hGH结合。对于lOmM组氨酸(游离碱)(pH7.7)而言，4.5mg/ml蛋白质样本的pH值为7.18;且14.0mg/ml蛋白质样本的pH值为6.89。在两种蛋白质浓度下214nm:280nm的比率相同(19.2)。对于30mM组氨酸(游离碱)(pH7.7)而言，13.3mg/ml蛋白质样本的pH值为7.19。214nm:280nm的比率为19.2。对于10mMHis(pH7.0)而言，4.6mg/ml蛋白质样本的pH值为6.94;且13.2mg/ml蛋白质样本的pH值为6.76。在两种蛋白质浓度下214nm:280nm的比率相同(19.1)。对于10mMNa2HP04(pH7.1)而言，4.6mg/ml蛋白质样本的pH值为7.10;且13.2mg/ml蛋白质样本的pH值为7.09。对于较低蛋白质浓度而言，214nm:280nm的比率为19.2，且对于较高蛋白质浓度而言为19.1。浓縮期间pH值的改变测量浓縮期间蛋白质的pH值改变。测试10mM组氨酸(游离碱)和30mMHis(游离碱)；蛋白质浓度以1mg/ml起始。就10mMHis(游离碱)(pH7.7)而言，发现以下结果1.0mg/ml蛋白质的pH值为7..41;11.7mg/ml蛋白质的pH值为6.82;且15.0mg/ml蛋白质的pH值为6.71。就30mMHis(游离碱)(pH7.7)而言，发现以下结果1.0mg/ml蛋白质的pH值为7.58;11.4mg/ml蛋白质的pH值为7.22;且17.1mg/ml蛋白质的pH值为7.05。加入组氨酸将PEG-hGH浓縮为14mg/ml并对水进行透析。通过将小体积浓组氨酸加入蛋白质中来增加组氨酸的浓度。测量每次组氨酸增加时的pH值。以下pH测量值是以组氨酸浓度(mM)测定OmM组氨酸下pH值为5.57;0.25mM组氨酸下pH值为5.68;0.5mM组氨酸下pH值为5.74;1mM组氨酸下pH值为5.86;2.5mM组氨酸下pH值为6.13;5mM组氨酸下pH值为6.36;10mM组氨酸下pH值为6.63;且30mM组氨酸下pH值为7.05。在这些研究中，发现组氨酸不与PEG-hGH结合。组氨酸的缓冲能力无法克服蛋白质的缓冲能力。测试磷酸二氢盐以测定其是否能够提供用以维持pH值的足够缓冲能力。缓冲能力介于约pH5.5与约pH8.0之间的任何缓冲剂(包括但不限于，磷酸二氢盐)都可适用。具有组氨酸的配方具有较少量的共价聚集体和因搅动而产生的聚集体。在以下检定中测试磷酸二氢盐。将PEG-hGH浓縮到14mg/ml并对水进行透析。通过将小体积浓磷酸盐加入蛋白质中来增加磷酸盐的浓度。在每次磷酸盐增加时测量pH值，且以pH对磷酸盐浓度(mM)绘制图表。实例25其它数据是由实例19中所讨论的经加速的聚集研究产生。历时四周时间点产生的数据包括SDS凝胶(在4。C和4CTC下储存4周的样本；图81-82);pH值(表lll);和对于在4'C和40。C下储存4周的样本的SEC-HPLC分析(表112-113)。表lll:所测量的pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>为期四周的时间段后，H7MT-P在4'C与40°C下都形成比H7MGT-P少的去PEG化hGH，并且在4(TC下具有少量共价聚集体。总的说来，在40'C下，主要降解产物为去PEG化hGH，且二聚化的量比4'C下有所增加且比4"C下存在更多的共价聚集体。实例26搅动研究(表面活性剂)接下来执行实例21中所述的研究。以H7MT透析PEG-hGH，并且以H7MT将所透析的蛋白质稀释到2mg/ml。将各种量的表面活性剂普流尼克F68加入样本中无普流尼克F68、0.01%普流尼克F68、0.05%普流尼克F68、0.1%普流尼克F68、0.25%普流尼克F68或0.5%普流尼克F68。两个对照样本含有具有0.01%普流尼克酸的H7MT缓冲剂而无蛋白质。使一个样本涡旋，而另一个样本未涡旋(t=0)。用500^1填充玻璃瓶执行搅动，且在室温下搅动样本2小时。对各种样本执行SEC-HPLC分析，且将结果展示于表114中。表114:SEC-HPLC<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>在调查聚集体可逆性的研究中，将0.1%普流尼克F68加入到经涡旋的对照(无表面活性剂)样本中以检验是否可通过普流尼克F68解离搅动诱发的聚集。通过SEC-HPLC分析样本。这项研究的结果表明，普流尼克F68可减小搅动诱发的聚集，但并未将其解离。具有0.1%普流尼克F68的H7MT产生的聚集体的量比具有较少量普流尼克F68的配方产生的聚集体的量少。实例27沉降速度分析'执行这一分析以测量以下三种样本的聚集39.9mg/ml、24.3mg/ml和1.0mg/mlPEG-hGH多肽。将这些储备液迅速稀释到0.6mg/ml，随后以杜贝卡氏经磷酸盐缓冲的生理盐水(Dulbecco'sphosphatebufferedsaline)(Gibco料号144190-144)进行测量。以提供浓度的垂直轴和基于沉降系数展示分离的水平轴产生这些样本的高精度沉降系数分布。使各分布标准化以说明样本间的浓度差异。39.9mg/mlPEG-hGH在1.27S时具有其主峰，且这一峰占总吸光度的98.7%。24.3mg/mlPEG-hGH在1.29S时具有其主峰，且这一峰占总吸光度的97.5%。还发现比主峰(单体)沉降快的少量峰。实例28AUC/SEC研究'通过SEC-HPLC、SDS-PAGE和AUC已发现具有不同浓度PEG化hGH多肽(39.9mg/ml、24.3mg/ml和1.1mg/ml)的样本和表115中所示的配方展示出类似的聚集量。表116展示由装载于柱上的20叫材料得到的SEC-HPLC结果。SDS-PAGE分析(每道装载10吗)如图83所示。1表115<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table>表116<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table>实例29中间体稳定性研究表117详细描述中间体稳定性研究。配方IDH7.3MT为30mM组氨酸、4%甘露糖醇、2%海藻糖，pH7.3。配方IDH7.3MT+F为30mM组氨酸、4%甘露糖醇、2%海藻糖(pH7.3)与0.1%普流尼克F68。配方IDHP7MT为10mM组氨酸、10mM磷酸盐、4%甘露糖醇、2%海藻糖，pH7.0。配方IDHP7MT+F为10mM组氨酸、10mM磷酸盐、4%甘露糖醇、2%海藻糖(-pH7.0)与0.1%普流尼克F68。使用三种不同浓度的具有在第35位经取代的对乙酰基苯丙氨酸的PEG化WFN:8mg/ml、12mg/ml和16mg/ml。所述研究涉及在t^0、l周、8周和24周时和4。C、25。C和4CTC温度下进行的分析。这项研究中所涉及的方法如先前所述SDS-PAGE(还原性和非还原性)、SEC-HPLC、RP-HPLC、IEX、FTIR、含水量等。生物活性是使用涉及BrdU标记的增殖检定测量。简单说来，这一检定是以表达BAF3细胞系2E2-2B12-F4的血清饥饿大鼠GHR(L43R)执行。以指定的每孔细胞数的密度将细胞涂于96孔培养盘中。用多点剂量范围的PEG化hGH多肽活化细胞，且在相同时间时以50uMBrdU(Sigma,St.Louis,MO)进行标记。培养48小时后，在室温下以100plBDcytofix/cytoperm溶液(BDBiosciences)固定/渗透细胞历时30min。为暴露BrdU表位，在37'C下用每孔30叫DNase(Sigma)处理己固定/渗透的细胞1小时。以APC接合的抗BrdU抗体(BDBiosciences)进行免疫荧光染色使得能够于FACS阵列上进行样本分析。对于这一方法的改变将为所属领域技术人员所知。表117<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>注射可行性研究以8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml和25mg/mlPEG化hGH多肽(配方IDH7.3MT)测试注射可行性。还以约16mg/ml和25mg/ml分析未接合的PEG(配方IDH7.3MT)以及无多肽或PEG时的缓冲剂对照。使用Instron机，并且以27号和29号针使用4lbs的力。所属领域技术人员已知对本文所述的各种技术条件和/或参数进行修改。可将诸如上文所述的方法或所属领域技术人员已知的其它方法的方法用于配方研究中。可以所属领域技术人员已知的检定执行对于样本的效力研究。适当配方包括(但不限于)H7MT-P与普流尼克酸(PluronicAcid);H7MGT-P与普流尼克酸；H7MT-P;H7MGT-P;H6MT-P与普流尼克酸；H6MGT-P与普流尼克酸；H6MT-P;H6MGT-P;HP7MT;HP7MT与普流尼克酸；H7.3MT;H7.3MT与普流尼克酸。适当配方可具有在约6到约7.3的pH值范围。适当配方可具有在约5.5到约8的pH值范围。适当配方可包括约5到约30mM组氨酸。适当配方可视情况包括多达约60g/L甘露糖醇。适当配方可视情况包括多达约50g/L海藻糖。适当配方可视情况包括多达约60g/L甘氨酸。应了解，本文所述的实例和实施例仅出于说明的目的，并且将建议所属领域技术人员据此进行各种修改或改变，且所述修改或改变将包括于本申请案的精神和范围和随附权利要求的范畴内。本文所引用的所有公开案、专利和专利申请案都是以其全文引用的方式并入本文中。.表119:所引用的序列<table>complextableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>权利要求1.一种hGH多肽的医药配方，其包含一种或一种以上非天然编码的氨基酸，其中所述配方包含a)缓冲剂；b)至少一种载剂、赋形剂或稳定剂；c)和医药学有效量的人生长激素(hGH)。2.根据权利要求1所述的hGH多肽，其中所述多肽与连接子、聚合物或生物活性分子相连。3.根据权利要求2所述的hGH多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物相连。4.根据权利要求3所述的hGH多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。5.根据权利要求1所述的配方，其中所述缓冲剂包含选自由磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、组氨酸衍生物、咪唑、乙酸盐和碳酸氢盐组成的群组的组份。6.根据权利要求1所述的配方，其中所述缓冲剂的pH值是介于约pH4.0与约pH8.5之间。7.根据权利要求6所述的配方，其中所述缓冲剂的pH值是介于约pH4.0与约pH7.5之间。8.根据权利要求7所述的配方，其中所述缓冲剂的pH值是介于约pH6.0与约pH7.5之间。9.根据权利要求8所述的配方，其中所述缓冲剂的pH值是介于约pH6.0与约pH7.3之间。10.根据权利要求6所述的配方，其中所述缓冲剂的pH值是介于约pH5.5与约pHS.0之间。11.根据权利要求1所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约0.1mg与约30mg之间。12.根据权利要求11所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约2mg与约30mg之间。13.根据权利要求11所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约0.1mg与约8mg之间。14.根据权利要求13所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约0.5mg与约8mg之间。15.根据权利要求14所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约0.5mg与约6mg之间。16.根据权利要求15所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约1mg与约5mg之间。17.根据权利要求12所述的配方，其中所述hGH的医药学有效量是介于约2mg与约25mg之间。18.根据权利要求1所述的配方，其中所述缓冲剂的浓度为约0.1mM到约200mM。19.根据权利要求18所述的配方，其中所述缓冲剂的浓度为约1mM到约75mM。20.根据权利要求19所述的配方，其中所述缓冲剂的浓度为约1mM到约20mM。21.根据权利要求19所述的配方，其中所述缓冲剂的浓度为约5mM到约30mM。22.根据权利要求1所述的配方，其中所述至少一种载剂、赋形剂或稳定剂是选自由抗氧化剂、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、糖醇、成盐反离子和非离子表面活性剂组成的群组。23.根据权利要求22所述的配方，其中所述载剂、赋形剂或稳定剂为抗氧化剂。24.根据权利要求23所述的配方，其中所述抗氧化剂为抗坏血酸。25.根据权利要求22所述的配方，其中所述载剂、赋形剂或稳定剂为氨基酸。26.根据权利要求25所述的配方，其中所述氨基酸是选自由甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、组氨酸衍生物、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸组成的群组。27.根据权利要求25所述的配方，其中所述氨基酸为约0.1g/L到约100g/L。28.根据权利要求27所述的配方，其中所述氨基酸为约1g/L到约50g/L。29.根据权利要求28所述的配方，其中所述氨基酸为约5g/L到约25g/L。30.根据权利要求27所述的配方，其中所述氨基酸为约0.1g/L到约60g/L。31.根据权利要求22所述的配方，其中所述载剂、赋形剂或稳定剂为碳水化合物。32.根据权利要求31所述的配方，其中所述碳水化合物是选自由单醣、二醣和其它碳水化合物组成的群组。33.根据权利要求32所述的配方，其中所述碳水化合物是选自由海藻糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖和葡聚糖组成的群组。34.根据权利要求31所述的配方，其中所述碳水化合物为约0.1g/L到约100g/L。35.根据权利要求34所述的配方，其中所述碳水化合物为约lg/L到50g/L。36.根据权利要求35所述的配方，其中所述碳水化合物为约2g/L到约25g/L。37.根据权利要求34所述的配方，其中所述碳水化合物为约0.1g/L到约50g/L。38.根据权利要求22所述的配方，其中所述载剂、赋形剂或稳定剂为糖醇。39.根据权利要求38所述的配方，其中所述糖醇为甘露糖醇。40.根据权利要求38所述的配方，其中所述糖醇为约0.1g/L到约100g/L。41.根据权利要求40所述的配方，其中所述糖醇为约1g/L到约50g/L。42.根据权利要求41所述的配方，其中所述糖醇为约2g/L到约25g/L。43.根据权利要求40所述的配方，其中所述糖醇为约'0.1g/L到约60g/L。44.根据权利要求22所述的配方，其中所述载剂、赋形剂或稳定剂为非离子表面活性剂。45.根据权利要求44所述的配方，其中所述非离子表面活性剂是选自由聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188(poloxamer188)(普流尼克F68(PluronicF68))组成的群组。46.根据权利要求44所述的配方，其中所述非离子表面活性剂为约0.0001%到约跳。47.根据权利要求46所述的配方，其中所述非离子表面活性剂为约0.01%到约10%。48.根据权利要求47所述的配方，其中所述非离子表面活性剂为约0.1%到约5%。49.根据权利要求48所述的配方，其中所述非离子表面活性剂为约0.1%到约1%。50.根据权利要求46所述的配方，其中所述非离子表面活性剂为约0.0001%到约1%。51.根据权利要求44所述的配方，其中所述配方包含两种非离子表面活性剂。52.根据权利要求22所述的配方，其中所述载剂、赋形剂或稳定剂为螯合剂。53.根据权利要求52所述的配方，其中所述螯合剂为EDTA。54.—种以有效量的根据权利要求1所述的配方治疗患有由hGH调节的病况的患者的方法。55.根据权利要求1所述的配方，其中所述缓冲剂包含缓冲能力介于约pH5.5与约pH8.8之间的组份。全文摘要本发明提供经修饰的人生长激素多肽的配方。文档编号C12Q1/68GK101374536SQ200580044435公开日2009年2月25日申请日期2005年12月21日优先权日2004年12月22日发明者安娜-玛丽亚·A·海斯·普特南,戴维·C·利青格,英·布彻勒申请人:Ambrx公司