专利名称：应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法。
背景技术：
目前获得批准生产的流感疫苗仍是鸡胚来源的灭活疫苗，但其仍存在许多不足，如，鸡胚连续传代后常常引起毒株变异；鸡胚有可能存在外源病毒因子的污染；用鸡胚生产流感疫苗不能满足应急情况下的需要，尤其是禽流感的爆发，也会影响鸡胚的正常供应。因此，世界卫生组织敦促世界各国寻找对流感病毒敏感的细胞株大规模生产流感疫苗的方法。中国专利号为02112013.7的发明专利说明书公开了一种大规模连续生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤a)在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen Plus⑧生物反应器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks为载体，培养细胞生产病毒；b)在细胞生长至一定密度时，接种所述病毒，使所述病毒感染细胞；c)使病毒在合适的条件下大量增殖；d)经纯化后收获病毒。这是一种利用细胞培养技术生产病毒疫苗的方法，具有培养的细胞密度高、可连续培养和病毒产量高等优点，实现了工业化生产疫苗的目的。由于细胞培养技术中，病毒吸附到细胞上繁殖，上述狂犬，出血热、乙脑、小儿脊髓灰质炎病毒容易吸附在细胞上，所以上述方法正如文中所提出的适合于狂犬疫苗、出血热疫苗、乙脑疫苗、小儿脊髓灰质炎疫苗和轮状病毒疫苗的制备，而流感病毒未经Vero细胞适应采用上述专利中所提出的方法生产流感疫苗是困难的，这也就是至今流感疫苗还是借助鸡胚制备而不能应用生物反应器大规模生产流感疫苗的原因。
发明内容
本发明的目的在于提出一种适应工业化生产的应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法。
本发明采取如下方法将流感当年流行毒株在Vero细胞上进行适应传代，经传代适应的病毒毒种保存于-70℃以下待用；在生物反应器中加入微载体，接种Vero细胞，待Vero细胞生长至一定密度时接种上述流感毒种，使病毒在合适的条件下大量增殖，将收获的病毒液经灭活、浓缩、纯化及裂解，根据纯化的单价原液的血凝素含量，配制成三价流感疫苗半成品。
上述流感流行毒株在Vero细胞上的适应传代采取如下措施将细胞Vero置于培养器皿中用EDTA或胰蛋白酶消化传代，细胞长成单层后，倒掉生长液，用Hank’s液或PBS将细胞表面清洗1～2遍，接种流感毒种，加入含一定浓度的胰蛋白酶的维持液后培养，收获前将细胞冻融1～2次，按上述同样方法继续传代。
所采用的生物反应器为固定床篮式搅拌反应器，载体是片状载体，其成分是聚酯纤维。
所采用的生物反应器为悬浮培养反应器，微载体是葡聚糖聚合物。
本发明采用将流感毒种在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)上进行传代适应，在适当浓度的裂解剂的作用下，流感病毒对Vero细胞感染能力增强，并很快适应Vero细胞，然后将在Vero细胞适应的流感毒种接种到在生物反应器已增殖到107个/ml以上细胞密度的Vero细胞中，调节反应器各种控制参数，如搅拌速度、PH值、D0值、灌流速度等，使病毒在高细胞密度的生物反应器中高校繁殖，并连续灌流，收获病毒液，然后进行病毒的灭活、浓缩、纯化、裂解等步骤制成流感疫苗。
本发明的应用生物反应器大规模生产流感疫苗，解决了以往采用鸡胚生产流感疫苗所存在的外源病毒污染难以控制、付反应大、成本高、生产规模不易扩大的缺点，它具有安全有效、抗原量高、质量稳定、易于扩大规模等优点。
具体实施例方式
实施例1流感疫苗的制备方法如下在流感疫苗的的制备中，首先要解决的是流感病毒适应Vero细胞，这是本制备方法的关键，采取如下步骤从种子细胞库中复苏一支Vero细胞，将细胞加入有生长液的细胞培养器皿中，生长液是MEM或M199+8％牛血清PH7.0～7.2，37℃培养48小时长成单层后，倒掉生长液，用Hank’s液将细胞表面清洗1～2遍，将生长液中残余的牛血清洗净(由于牛血清中含有流感病毒的非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制)，接着接种流感毒种，置33～35℃吸附1-2小时，然后加入维持液，维持液采取无血清培养基(含1～5μg/ml胰蛋白酶)，加胰蛋白酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力，经33-35℃培养三天收获，收获前将细胞冻融1-2次，细胞破裂病毒释放，可提高收获液的病毒滴度。按同样的方法将流感毒种继续传代，经6～8代收获，病毒血凝滴度稳定到1∶320，将毒种保存于-70℃以下待用。通过上述方法获得的病毒已适应Vero细胞。
工业化连续生产流感疫苗所用主要设备是购自美国NBS公司14升生物反应器。该生物反应器采用的搅拌系统是固定床篮式搅拌系统(FibrousTM-Bed Basket system)，罐体为夹套式耐高温压玻璃罐体。工作体积10升。
在14升生物反应器的罐体中加入400克片状载体，片状载体由美国NBS公司生产，其成份为聚酯切片，在上述罐体中同时加入10升磷酸盐缓冲液PBS(pH7.3)，121℃消毒1小时，消毒后，排空PBS，加入Vero细胞生长液(DMEM+8％小牛血清)，37℃预热30分钟。接种27瓶(3L细胞瓶)细胞于罐体内，调整反应罐参数，搅拌速度为60-90rpm，溶氧50-80％，pH7.0-7.2，按葡萄糖含量在0.8-1.8g/L连续灌流5-6天后全部排空罐内生长液，并用Hank’s液将罐体及载体洗3遍后，加入10L维持液(含1～5μg/ml胰蛋白酶)，同时接种上述流感毒种，调节反应罐参数(温度34℃，搅拌速度60-90rpm，溶氧50-80％，pH7.4-7.8)，24小时后按葡萄糖含量在0.8-1.8g/L连续灌流进行流感病毒的培养及收获。
将收获的病毒液加1/4000的甲醛，20-22℃灭活96小时，然后用10万分子量超滤膜浓缩30-50倍，用蔗糖密度梯度离心方法纯化，用5％Triton×100进行裂解。
根据纯化的单价原液的血凝素含量，按最终30μg/剂.亚型配制成流感疫苗半成品。
实施例2生物反应器采用悬浮培养反应器，载体是葡聚糖聚合物，操作步骤基本与实施例1相同。
权利要求
1.一种应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法，其特征在于将流感当年流行毒株在Vero细胞上进行适应传代，经传代适应的病毒毒种保存于-70℃以下待用；在生物反应器中加入微载体，接种Vero细胞，待Vero细胞生长至一定密度时接种上述流感毒种，使病毒在合适的条件下大量增殖，将收获的病毒液经灭活、浓缩、纯化及裂解，根据纯化的单价原液的血凝素含量，配制成三价流感疫苗半成品。
2.根据权利要求1所述的应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法，其特征在于上述流感流行毒株在Vero细胞上的适应传代采取如下措施将细胞Vero置于培养器皿中用EDTA或胰蛋白酶消化传代，细胞长成单层后，倒掉生长液，用Hank’s液或PBS将细胞表面清洗1～2遍，接种流感毒种，加入维持液(含一定浓度的胰蛋白酶)后培养，收获前将细胞冻融1～2次，按上述同样方法继续传代。
3.根据权利要求1所述的应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法，其特征在于生物反应器为固定床篮式搅拌反应器，载体是片状载体，其成分是聚酯纤维。
4.根据权利要求1所述的应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法，其特征在于生物反应器为悬浮培养反应器，微载体是葡聚糖聚合物。
全文摘要
一种应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法，本发明采用将流感毒种在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)上进行传代适应，在适当浓度的裂解剂的作用下，流感病毒对Vero细胞感染能力增强，并很快适应Vero细胞，然后将流感毒种接种到在生物反应器已增殖到10
文档编号C12M3/02GK101062411SQ20061001177
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者张玉慧 申请人:江苏延申生物科技股份有限公司