专利名称：一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种从脐带血中分离多能成体祖细胞(multipotent adultprogenitor cells，MAPC)的方法，具体地说涉及体外由脐带血中分离多能成体祖细胞的方法。
背景技术：
干细胞工程作为组织工程的基础研究，对未来的组织器官修复与替代具有极其重要的作用和深远的影响，其关键在于得到能分化为所需组织的干细胞。
根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于目前对胚胎干细胞分化发育调控机制知之甚少，胚胎干细胞来源有限并且移植后存在无限增殖而诱发肿瘤的危险，以及对胚胎干细胞的研究和应用涉及一些伦理问题等原因，胚胎干细胞距离临床应用仍较遥远。随着干细胞生物学研究的不断深入，近年发现某些成体组织存在具有多向分化潜能的成体干细胞，这类细胞不但能再生其特定组织，而且可在一定环境下转变生成其它组织系统的细胞，即跨系统甚至跨胚层分化发育。由于其来源丰富(可来源于自身)，涉及和存在的伦理问题少等原因，使成体干细胞移植的临床应用更有现实可能。
目前成体干细胞的研究多数集中于骨髓来源的间充质干细胞(MSC)，MSC已经证实可以分化为多种人体组织细胞，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等(Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science，1999，284143-147.)。其在造血调控、免疫调节、基因治疗和组织工程等方面的作用已得到越来越多的重视(Noort WA.，KruisselbrinkAB..in’t Anker PS.Mesenchymal stem cells promote engraftment ofhuman umbilical cord blood-derived CD34+cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol.2002；30870-878，Aggarwal S.，Pittenger MF.Humanmesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses.Blood.2005；1051815-1822)。但由于获取大量骨髓细胞用于细胞移植治疗存在一定困难，并且骨髓MSC随年龄的增加出现数目及分化潜能下降(D’Ippolito G，Schiller PC，Ricordi C，et al.Age-related osteogenicpotential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bonemarrow.J Bone Miher Res.1999；141115-1122.)，因而今后将其应用于临床存在一定的困难。
人类脐带血中含有丰富的造血干祖细胞，自1988年第一例脐带血干细胞移植获得成功后，脐带血干细胞已经作为一种重要的造血干细胞来源应用于临床。近年的研究表明，除了造血干细胞外，脐血中还存在特殊的与骨髓间充质细胞相似的非造血成体细胞群(Goodwin HS，Bicknese AR，Chien SN，et al.Multilineage differentiation activity by cellsisolated from umbilical cord bloodexpression of bone，fat，andneural markers.Biol Blood Marrow Transplant，2001，7(11)581-8；Lee OK，Kuo TK，Chen WM，et al.Isolation of multipotent mesenchymalstem cells from umbilical cord blood.Blood.2004，103(5)1669-75；Kgler G，Sensken S，Airey JA et.al.A Human Somatic Stem Cell fromPlacental Cord Blood with Intrinsic Pluripotent DifferentiationPotential.J Exp Med.2004，200(2)123-35)，其外观类似成纤维细胞，不表达造血细胞标记(CD34，CD45，CD14，CD2，CD3，CD15，CD16，CD19，CD24，CD33，CD38，血型糖蛋白A)，表达CD13、CD29、CD44等粘附分子，人间充质细胞标志SH1、SH2强阳性，HLA-ABC阳性而HLA-DR阴性。但与骨髓间充质干细胞不同的是，其比例较低，每106脐血单个核细胞中约有0.05-2.8个，低于骨髓间充质干细胞(每106单个核细胞中约有2-5个，Koc，ON，Lazarus HM.Mesenchymal stem cellsheading into the clinic.BoneMarrow Transplant.2001；27235-239.)，但这类细胞可能更原始、更具增殖潜能。同时，这类细胞能表达多种细胞因子，如SCF，LIF，TGF-1b，M-CSF，GM-CSF等，在对CD34+细胞的扩增支持能力上优于骨髓MSC(Kogler G，RadkeTF，Lefort A，et al.Cytokine production and hematopoiesis supportingactivity of cord blood-derived unrestricted somatic stem cells.ExpHematol.2005；33(5)573-83)。更为重要的是，在特定的诱导条件下，这类细胞表现了向骨、软骨、脂肪、神经、肝、心肌细胞等多种组织细胞的分化潜能。在动物实验中能够促进人类造血干细胞的植活，修复组织损伤和改善疾病症状。
随着近年来脐带血干细胞库的建立，由于脐带血资源丰富，采集简单且不会导致对母亲和新生儿的损伤，脐带血干细胞具有增殖和自我更新能力强、免疫原性弱等优势，如果对脐带血来源的多能成体祖细胞进行开发和应用，将能为组织工程提供新的种子细胞，对干细胞组织工程及其应用具有深远意义。
目前从脐带血中分离多能成体祖细胞多数仍然沿用贴壁传代培养的方法，但也有一些是通过特定的表面标志如STRO-1、CD45等进行免疫磁珠阳性或阴性分选。由于这类细胞含量少，缺乏高度特异性的表面标志，分离成功率较低，如Bieback K，Kern S，Kluter H，Eichler H.Criticalparameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilicalcord blood.Stem Cells.2004；22(4)625-34.报告，以含10％胎牛血清而不添加生长因子的条件处理59份脐带血标本仅有19份分离成功(28％)。国内的报告与之相似(29.17％，朱美玲，胡燕芬，温冠媚等，人胎盘血间质干细胞分离培养，中国病理生理杂志2004，20(9)1743-1744)，而利用免疫磁珠进行的分选存在步骤复杂，成本较高的问题。因此迫切需要找到一种简单易行的方式提高分离效果，为脐带血多能成体祖细胞应用于临床治疗提供更充足的理论依据和技术方法。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足组织工程细胞治疗的需要。
脐带血中的多能成体祖细胞含量较少，以常用的单纯含血清贴壁培养分离法体外分离的成功率较低，并且在高血清的条件下细胞容易发生分化。同时，血清成分复杂，虽然含有许多对细胞有利成分，但也含有对细胞有害的成分，不同批号之间存在的质量差异也可能使得实验和生产的标准化困难。不利于今后的应用。但是，在前期实验中我们发现，单纯降低血清浓度或进行无血清培养而不添加细胞生长添加剂或细胞因子时不利于分离培养。因此，我们考虑在降低血清浓度的同时，调整现有培养试剂的组分，加入适当的重组人细胞因子和其它生长添加剂，可能有助于减少异种血清的不利影响并提高分离效果。
多种生长因子已经证实对骨髓MSC的生长存在影响，由于脐带血来源的多能成体祖细胞具有和骨髓MSC相似的细胞表型和分化潜能，因此我们考虑选用适当的有利于骨髓MSC生长的生长因子来促进脐带血来源的多能成体祖细胞的生长。
表皮生长因子(EGF)和人血小板衍生的生长因子(PDGF)已经证实能够促进细胞的生长(Chen Y，Rabinovitch PS.Platelet-derived growthfactor，epidermal growth factor，and insulin-like growth factor Iregulate specific cell-cycle parameters of human diploid fibroblastsin serum-free culture.J Cell Physiol.1989，140(1)59-67，LucarelliE，Beccheroni A，DonatiD，et al.Platelet-derived growth factorsenhance proliferation of human stromal stem cells.Biomaterials.2003，24(18)3095-100.)。二者对细胞动力学参数有相似影响，均作用在G1早期限制点，刺激c-fos、c-myc等G1早期基因的表达，调节从静止状态进入细胞周期的细胞比例。Gronthos S，等研究证实，在无血清条件下只有存在EGF和/或PDGF时，成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的生长才能维持，并且二者联用时的集落大小要大于单用(P＜0.05)。与含20％胎牛血清的集落培养相比，无血清条件下加用EGF+PDGF的CFU-F集落大小明显增加(P＜0.05)(Gronthos S，Simmons PJ The growth factorrequirements of STRO-1-Positive human bone marrow stromal precursorsunder serum-deprived conditions in vitro.Blood，1995 85(4)929-940)。对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的研究也证实了它对间充质干细胞增殖和分化潜能的维持具有重要作用(Bianchi G，Banfi A，Mastrogiacomo M et al.Ex vivo enrichment of mesenchymal cellprogenitors by fibroblast growth factor 2.Exp.CellRes.2003，287(1)98-105)。
除细胞因子外，Gronthos S等同时发现，在无血清条件下，地塞米松和抗坏血酸是CFU-F生长的关键因子之一，但是如果只含有这两种物质而不添加外源性的生长因子，不能促进CFU-F的生长。所以，在减少血清浓度，添加细胞因子的同时加入这些物质，有助于脐带血多能成体祖细胞的生长。
对利用贴壁传代分离培养骨髓MSC的研究表明，所用培养基种类、起始接种密度、初次换液时间等都是影响分离效果的重要因素(SotiropoulouPA，Perez SA，Salagianni M，et al.Characterization of the optimalculture conditions for clinical scale production of humanmesenchymal stem cells.Stem Cells.2006，24(2)462-71.)。初次换液时间过长，与造血细胞长时间的接触会抑制已经贴附多潜能成体干细胞进入增殖状态，影响所获细胞的数目及集落形成能力。这可能是由于营养消耗、细胞死亡等原因造成的环境恶化所致，也可能与造血细胞分泌的细胞因子促进细胞分化有关。而初次换液时间过短，细胞未能充分粘附，也影响最终获得的细胞数目。接种密度同样影响细胞之间复杂的相互作用。当原代培养的细胞初次接触体外环境时，细胞之间的相互影响是很重要的，细胞可能产生一些促生长活性物质互相促进存活和生长。此外，细胞密度过大，贴壁细胞无足够的空间伸展；细胞密度过低时，细胞形成克隆和达到传代所需密度的时间又很长，造成原代细胞“老化”，使其在传代后的扩增能力和分化潜能都明显下降。
在前期的预实验中，我们也对在低血清条件下分离脐带血多能成体祖细胞的相关影响因素进行了探讨，结果表明，在所采用的低血清条件下，优选的初次换液时间72小时，采用DMEM/F12培养基，初始接种密度为1×106/cm2组有利于脐带血多潜能成体祖细胞的生长。尽管对骨髓来源的MSC的研究表明，在10-20％血清浓度下，低密度(1×103/cm2)或极低密度(1或3个细胞/cm2)接种有利于MSC细胞的分离扩增(Sotiropoulou PA，PerezSA，Salagianni M，et al.Characterization of the optimal cultureconditions for clinical scale production of human mesenchymal stemcells.Stem Cells.2006，24(2)462-71.Colter D.C.，Class.R，DiGirolamo C.M.et al.Rapid expansion of recycling stem cells incultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.Proc NatlAcad Sci USA，2000；97(7)3213-3218.)。但在预实验中我们发现，在降低血清浓度的条件下，过低的初始接种密度不利于脐带血多能非造血成体干细胞的分离，这与Tamama等的研究相似，他们发现，骨髓MSC在高密度培养时较低密度培养对低血清环境的耐受性更强(Tamama K，Fan VH，Griffith LG，et al.Epidermal growth factor as a candidate for ex vivoexpansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells，Stem Cells，2006，24(3)686-95.)。同时我们发现，采集至分离时间≤4小时且MNC细胞数≥1.2×108的脐带血样本分离成功率较高。因此，在本发明的方法中我们采用了这些上述优选技术因素。
本发明的方法包括优化选择脐带血样本，利用淋巴细胞分离液分离脐带血单个核细胞，在含有8～15％胎牛血清的培养基中培养3天，弃去未贴壁的细胞，继而更换为含2～5％胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)、人血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)、MCDB-201、抗坏血酸、地塞米松和ITS添加剂的培养基中继续贴壁培养，传代纯化分离脐带血多能成体祖细胞。
本发明的技术方案1、人脐带血以0.01M PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)等倍稀释后，利用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞；所说的脐带血定义为采集自和人胎儿胎盘相连的脐静脉的血液。优选采用分娩后4小时以内，单个核细胞数≥1.2×108的人脐带血。用在本发明细胞分离中的淋巴细胞分离液密度为1.077g/cm3。
2、将分离的脐带血单个核细胞悬浮于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，以0.5-2×106/cm2的密度，优选1×106/cm2，接种于培养瓶(优选利用纤维连接蛋白(fibronectin)预先包被培养瓶)中；置于37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中培养。
3、培养48-72小时(优选72小时)后，弃去未贴壁细胞，更换细胞培养基为含人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)、人血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)(以上添加的重组人细胞生长因子浓度通常为1-10ng/ml，优选采用10ng/ml)、40％MCDB-201、2％胎牛血清、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)、10-4M抗坏血酸、10-8M地塞米松的DMEM/F12培养基中继续培养，每周2-3次换液。
4、待上述3的初代培养接近70-80％融合时，将该培养瓶用0.25％的胰蛋白酶进行处理，然后回收细胞，对得到的细胞进行计数。
5、将获得的细胞以5-8×103/cm2的密度(优选8×103/cm2)接种到上述3所述的培养基中进行培养，在细胞接近70-80％融合时进行传代培养；6、反复进行5的操作，进行传代培养；本发明的有益效果是本发明提供了一种简单易行的从脐带血分离多能成体祖细胞的方法，即在低血清条件下采用加入细胞生长添加剂贴壁传代培养分离的方法。利用本方法能够有效从脐带血中间分离多能成体祖细胞，分离的细胞能够在体外反复传代，具有与报道的脐带血非造血成体干细胞相同的免疫表型，细胞周期检测表明97％以上处于G0/G1期，并在适当的诱导条件下具有多向分化的潜能。在利用本发明提出的优选脐带血标准和分离技术时，可从70％标本中分离出与多能成体祖细胞，与其它方法相比具有明显的分离成功率优势。同时，低血清培养条件的应用，有助于降低血清的影响，利于今后进一步的实验和生产的标准化应用。
具体实施例方式
本发明的一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，依次包括以下步骤第一步将体外脐带血用磷酸盐缓冲液等倍稀释，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；第二步将分离的脐带血单个核细胞在含有8～15％胎牛血清的培养基中培养48-72小时，弃去未贴壁的细胞；第三步更换为含2～5％胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子bFGF、人表皮生长因子EGF、人血小板衍生的生长因子PDGF-BB、MCDB-201、抗坏血酸、地塞米松和1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠ITS添加剂的培养基中继续贴壁培养；第四步传代纯化分离脐带血多能成体祖细胞。
所述体外脐带血为采集自和人胎儿胎盘相连的脐静脉的血液，优选采用分娩后4小时以内，单个核细胞数≥1.2×108的人脐带血。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明
实施例1.脐带血多能成体祖细胞的分离、纯化和扩增培养脐带血经淋巴细胞分离液密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以DMEM/F12培养基洗涤2次，将细胞悬浮于DMEM/F12培养基中。
将分离得到的单个核细胞以1×106/cm2的接种密度接种到含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，每个T-25培养瓶7ml培养基。置于37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中，培养72小时。弃去未贴壁细胞，更换细胞培养基为含40％MCDB-201、2％胎牛血清、10ng/ml bFGF、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-BB、10-4M抗坏血酸、10-8M地塞米松、1×ITS的DMEM/F12培养基中继续培养。每周2-3次换液。培养后70％的脐带血标本可见贴壁细胞，最初散在，12-14天逐渐形成细胞克隆，呈均一的长梭形漩涡状生长。待细胞接近70％融合时，将该培养瓶用0.25％胰蛋白酶进行处理，然后回收细胞，对得到的细胞进行计数。每瓶单层融合的细胞消化后平均获得7.5×105个多能成体祖细胞。将获得的细胞以8×103/cm2的密度接种到上述培养基中进行培养，在细胞接近70-80％融合时进行传代培养。
实施例2.脐带血多能成体祖细胞的表面抗原特性和细胞周期检测取扩增3代的脐带血多能成体祖细胞，去培养基。PBS洗两遍，用胰蛋白酶(0.25％)进行处理，然后回收细胞，对得到的细胞进行计数。用PBS制成5×105/ml的单细胞悬液，每个管加500μl，分别加入10μl抗人CD3、CD34、CD11a、CD29、CD105、CD45、CD44、CD73、CD49d、CD49e、CD31、CD62L、CD14、HLA-DR、CD144、vWF以及抗鼠IgG1同型对照荧光抗体。4℃避光孵育30分钟，加1mlPBS洗涤，弃上清，加300μl含1％多聚甲醛的PBS，流式检测。发现CD29、CD44、CD105、CD49d、CD73表达阳性，CD34、CD45，CD11a、CD14、CD31、HLA-DR、CD144、vWF、CD62L阴性。
在细胞生长的对数期，消化细胞，70％冷乙醇4℃固定30分钟，PBS液洗涤细胞2遍，将细胞悬浮于0.5mlPBS中，加入10mg/ml RNaseA 10μl，37℃水浴孵育30min后，立即放入冰浴中，加入5μg/ml PI染色(4℃，30分钟)，流式细胞仪检测，结果表明，超过97％的细胞处于G0/G1期。
实施例3.脐带血多能成体祖细胞的诱导分化特性消化体外扩增的第3代多能成体祖细胞，以5×103/cm2的密度接种于预先放置盖玻片的6孔板中。在细胞达到60％-70％融合时，每孔更换含有10-7mol/L的地塞米松，10mmol/L β-磷酸甘油，0.05mol/L维生素C和10％FCS的DMEM/F-12的成骨分化诱导液2ml进行诱导培养3周，每周换液2次，分别于诱导的14、21天取出玻片，固定，观察形态学变化并进行组织学染色。
消化体外扩增的第3代多能成体祖细胞，以5×103/cm2的密度接种于预先放置盖玻片的6孔板中。在细胞达到60％-70％融合时，每孔更换含有10-6mol/L地塞米松、10μg/ml 胰岛素、0.5mmol/L IBMX及200μmol/L消炎痛和10％FCS的DMEM/F-12的成脂分化诱导液2ml进行诱导培养，3～4天换液一次，当观察到细胞浆中有脂肪空泡形成时，吸去培养液，PBS洗涤一次，70％酒精固定10min，以Oil Red染液染色。
脐带血多能成体祖细胞在成骨诱导环境下，14天后，镜下观察到茜素红染色显示红色的钙化基质沉积；Von Kossa染色显示有黑色的钙化基质沉淀。在成脂诱导环境下，Oil Red染液染色阳性。表明细胞具有向成骨及成脂肪细胞分化的潜能。
权利要求
1.一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，依次包括以下步骤第一步将体外脐带血用磷酸盐缓冲液等倍稀释，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；第二步将分离的脐带血单个核细胞在含有8～15％胎牛血清的培养基中培养48-72小时，弃去未贴壁的细胞；第三步更换为含2～5％胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子bFGF、人表皮生长因子EGF、人血小板衍生的生长因子PDGF-BB、MCDB-201、抗坏血酸、地塞米松和1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠ITS添加剂的培养基中继续贴壁培养；第四步传代纯化分离脐带血多能成体祖细胞。
2.根据权利要求1所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述体外脐带血为采集自和人胎儿胎盘相连的脐静脉的血液，优选采用分娩后4小时以内，单个核细胞数≥1.2×108的人脐带血。
3.根据权利要求1所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述的第二步为将分离的脐带血单个核细胞悬浮于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，以(0.5-2)×106/cm2的密度，接种于培养瓶中；置于37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中培养72小时。
4.根据权利要求3所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述的培养瓶为利用纤维连接蛋白预先包被的培养瓶。
5.根据权利要求3所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述的密度优选1×106/cm2。
6.根据权利要求1所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述的第三步的细胞培养基为含40％MCDB-201、2～5％胎牛血清、1-10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子bFGF、1-10ng/ml人表皮生长因子EGF、1-10ng/ml人血小板衍生的生长因子PDGF-BB、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠ITS、10-4M抗坏血酸、10-8M地塞米松的DMEM/F12培养基。
7.根据权利要求1所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述的第三步每周换液2-3次。
8.根据权利要求6所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述的第四步包括a.当第三步的初代培养接近70-80％融合时，将该培养瓶用胰蛋白酶进行处理，然后回收细胞，对得到的细胞进行计数；b.将a获得的细胞以(5-8)×103/cm2的密度接种到上述第三步所述的培养基中进行培养，在细胞接近70-80％融合时进行传代培养；反复进行b的操作，进行传代培养。
9.根据权利要求1所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01M，PH＝7.4；淋巴细胞分离液比重为1.077g/cm3。
10.根据权利要求1所述的从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，其特征在于所述第二步中胎牛血清优选浓度为10％，第三步中胎牛血清优选浓度为2％。
全文摘要
本发明公开了一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法，包括利用淋巴细胞分离液分离脐带血单个核细胞，在含有8～15％胎牛血清的培养基中培养3天，弃去未贴壁的细胞，继而更换为含2～5％胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)、人血小板衍生的生长因子(PDGF－BB)、MCDB－201、抗坏血酸、地塞米松和ITS添加剂的培养基中继续贴壁培养，传代纯化分离。采用本发明的方法从脐带血中分离多能成体祖细胞，与其它方法相比，分离成功率高，所获细胞表型、细胞周期和诱导分化能力相同。因此，用此方法分离脐带血多能成体祖细胞可显著提高效率。
文档编号C12N5/0789GK1920010SQ200610013580
公开日2007年2月28日 申请日期2006年4月29日 优先权日2006年4月29日
发明者邱录贵, 李云涛, 徐燕, 孟恒星, 于珍, 韩俊领 申请人:中国医学科学院血液学研究所