专利名称：利用核糖体操纵子间区探针检测水生动物病原菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌检验技术，具体的讲是运用核酸分子杂交反应检测致病细菌，特别是水生动物病原菌(包括杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、鮰鱼爱德华氏菌、杀鱼肠球菌、链球菌、嗜冷屈挠杆菌、柱状屈挠杆菌、多杀巴斯德氏菌、杀鱼巴斯德氏菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香组假单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、哈维弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23种细菌)的技术。
背景技术：
目前，水生动物病原微生物检测方法基本上依靠生化鉴定和培养鉴定。这些鉴定费时费力，并且又是在种水平的鉴定上结果并不可靠。随着分子生物学鉴定方法的发展，基于这些方法的细菌分类正逐渐被修正。这一状况从侧面说明了建立分子生物学鉴定方法的必要性。相关研究在国际上已广泛开展，国内这方面研究也在逐渐兴起。
在水生动物病原微生物检测方面，国内基本上采用的是生化方法，鲜有芯片或微阵列应用的文献报道，国际上虽有水生动物致病微生物检验芯片的研究报道，但其检测的范围并不全面。从技术层面讲，目前细菌分子检测运用最多DNA靶点是16S rRNA基因。但在许多情况下，相近种之间在16S rRNA基因序列上的差异非常有限(同属的细菌16S rRNA基因序列差别基本上小于4％相似度)，并且有时候这些差别位点分布比较均匀。所以用16S rRNA基因上的差别位点设计相近种鉴别探针难度较大，而且鉴别效果往往不理想。16S-23S rRNA可变区域多，分子量更大，与16S rRNA基因相比变异位点丰富而集中，但在种的水平上具有保守性。再加上一般细菌都有多个拷贝的rRNA操纵子，使得利用16S-23S设计种特异性探针非常便利，并且大大提高了探针的特异性。
DNA微阵列在水生动物疫病检测方面有广泛的应用前景，能够大大提高检验的效率，节省人力，时间。真正能够做到一次检验给出可能感染的病原微生物的感染状况的全面信息，并且结果准确，操作简便快速。
发明内容
目前我国尚没有在水生动物疫病检测方面运用寡核苷酸微阵列检测病原菌的标准方法，依然沿用了增菌法、PCR方法、荧光PCR方法检测水生动物疫病病原菌。增菌法需要经过前增菌、分离培养、生化鉴定等经典的检验方法检测目标菌。试验时间长，处理样品量小，而且灵敏度和特异性都相对较低。而PCR方法、荧光PCR方法检测通量低，一次只能实现一种病原菌的检验。
针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种运用寡核苷酸微阵列检测病原菌技术检测水生动物疫病病原菌的方法(包括杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、鮰鱼爱德华氏菌、杀鱼肠球菌、链球菌、嗜冷屈挠杆菌、柱状屈挠杆菌、多杀巴斯德氏菌、杀鱼巴斯德氏菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香组假单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、哈维弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23种细菌)为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的首先用生物信息学方法设计特异性探针序列如下序列一星状诺卡氏菌探针Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA序列二星状诺卡氏菌探针Nser1 GGCAAACCATCAGAGCATG序列三巴斯德氏菌属通用探针PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG
序列四多杀巴斯德氏菌探针2 Pmulii3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA序列五杀鱼巴斯德氏菌探针1 Pmulii2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC序列六鮰鱼爱德华氏菌探针 Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG序列七鮰鱼爱德华氏菌探针2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG序列八迟缓爱德华氏菌探针1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC序列九迟缓爱德华氏菌探针2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA序列十耶尔森氏菌属通用探针YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC序列十一鲁氏耶尔森氏菌探针1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA序列十二气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT序列十三杀鲑气单胞菌探针1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC序列十四杀鲑气单胞菌探针2 AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT序列十五豚鼠气单胞菌探针1 AcavG1ip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG序列十六豚鼠气单胞菌探针2 AcavG1ip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA序列十七温和气单胞菌探针1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG序列十八温和气单胞菌探针2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA序列十九鲑鱼肾杆菌探针1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC序列二十鲑鱼肾杆菌探针2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC序列二十一产气荚膜梭菌探针1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTTAATTT序列二十二产气荚膜梭菌探针2 Cperfip2AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA序列二十三肉毒梭菌探针1 CbotripTAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT序列二十四肉毒梭菌探针2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG序列二十五海分支杆菌探针2Mm2 ATTGGATGCGCTGCCTTTTGGTGGC序列二十六霍乱弧菌及拟态弧菌探针1 VcmIIp1 GAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT序列二十七霍乱弧菌及拟态弧菌探针2 VcmI3 p2AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG序列二十八霍乱弧菌探针1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG序列二十九霍乱弧菌探针2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT序列三十创伤弧菌探针1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT
序列三十一创伤弧菌探针2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT序列三十二副溶血弧菌探针1 Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA序列三十三副溶血弧菌探针2 Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG序列三十四鳗弧菌探针1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT其中D代表碱基A或G或T中的任意一个；W代表碱基A或T中的任意一个。
然后PCR扩增待测样品中全部原核微生物的16S-23S rRNA基因内的部分DNA片断运用寡核苷酸微阵列检测多种水生动物病原菌的方法包括以下步骤1.设计特异性寡核苷酸探针，用于分子杂交-酶联免疫显色检测；2.PCR扩增待测样品中全部原核微生物的16S-23S rRNA基因的部分DNA片断，同时进行地高辛标记；3.将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上，组成探针微阵列，微阵列的点制按图1中的顺序和位置，在长波紫外灯下进行交联5-10分钟；本专利申请书的所有附图中的点所对应的探针均和图1中所示一样为1.阳性对照2.阴性对照3.星状诺卡氏菌探针Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA4.星状诺卡氏菌探针NSER1 GGCAAACCATCAGAGCATG5.巴斯德菌属通用探针PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG6.多杀巴斯德氏菌探针2 Pmulii3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA7.杀鱼巴斯德氏菌探针1 Pmulii2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC8.鮰鱼爱德华氏菌探针Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG9.鮰鱼爱德华氏菌探针2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG10.迟缓爱德华氏菌探针1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC11.迟缓爱德华氏菌探针2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA12.耶尔森氏菌属通用探针YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC13.鲁氏耶尔森氏菌探针1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA14.气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1 GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT15.杀鲑气单胞菌探针1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC16.杀鲑气单胞菌探针2AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT17.豚鼠气单胞菌探针1AcavG1ip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG18.豚鼠气单胞菌探针2AcavG1ip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA
19.温和气单胞菌探针1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG20.温和气单胞菌探针2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA21.鲑鱼肾杆菌探针1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC22.鲑鱼肾杆菌探针2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC23.产气荚膜梭菌探针1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTFAATTT24.产气荚膜梭菌探针2 Cperfip2 AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA25.肉毒梭菌探针1 Cbotrip TAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT26.肉毒梭菌探针2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG27.海分支杆菌探针2Mm2 ATTGGATGCG CTGCCTTTTG GTGGC28.霍乱弧菌及拟态弧菌探针1 VcmIIp1 CGAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT29.霍乱弧菌及拟态弧菌探针2 VcmI3p2 AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG30.霍乱弧菌探针1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG31.霍乱弧菌探针2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT32.创伤弧菌探针1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT33.创伤弧菌探针2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT34.副溶血弧菌探针1 Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA35.副溶血弧菌探针2 Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG36.鳗弧菌探针1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT4.杂交和杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
PCR反应体系中各组分构成比例如下成分 浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物1 10μmol/L 2μL引物2 10μmol/L 2μLdNTPs 每种 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L0.3μLDNA样品 2μL双蒸水33.1μL总体积50μLPCR方法中扩增程序为
1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重复5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重复25次9)72℃2min将浓度为1mmol/L的寡核苷酸探针溶液0.1μL点在带有正电荷的尼龙膜上，在长波紫外灯下进行交联5-10分钟。
其地高辛标记PCR产物与寡核苷酸探针杂交方法如下*预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入塑料袋，加入预杂交液，封好口。预杂交30min，50℃。
*扩增PCR产物热变性DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛标记靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的芯片装入塑料袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10uL，再加入1mL杂交液，封好口。50℃，杂交1hr，温和搅动。
与现有技术相比，本发明的有益效果是该方法具有检测准确、特异性强的特点，可以快速、准确的鉴定特异的目标细菌。首先，避免了反复培养，节约时间；而且DNA-DNA的杂交鉴定方法较生理生化的鉴定方法更为准确，不受培养条件和细菌生理状态的影响，这将填补使用DNA分子杂交的鉴定方法进行水生动物疫病病原菌检测的空白。
图1微阵列的探针位置示意图。
图2某批次活鱼的微阵列检测检出产气荚膜梭菌的结果。
图3某批次活鱼的微阵列检测检出迟缓爱德华的结果。
图4某批次活鱼的微阵列检测检出创伤弧菌的结果。
图5某批次活鱼的微阵列检测检出多杀巴斯德的结果。
图6某批次活鱼的微阵列检测检出副溶血弧菌的结果。
图7某批次活鱼的微阵列检测检出鲑鱼肾杆菌的结果。
图8某批次活鱼的微阵列检测检出海分枝杆菌的结果。
图9某批次活鱼的微阵列检测检出鮰鱼爱德华氏菌的结果。
图10某批次活鱼的微阵列检测检出霍乱弧菌的结果。
图11某批次活鱼的微阵列检测检出鲁氏耶尔森的结果。
图12某批次活鱼的微阵列检测检出鳗弧菌的结果。
图13某批次活鱼的微阵列检测检出拟态弧菌的结果。
图14某批次活鱼的微阵列检测检出肉毒梭菌的结果。
图15某批次活鱼的微阵列检测检出杀鲑气单胞的结果。
图16某批次活鱼的微阵列检测检出杀鱼巴斯德的结果。
图17某批次活鱼的微阵列检测检出豚鼠气单胞的结果。
图18某批次活鱼的微阵列检测检出温和气单胞菌的结果。
图19某批次活鱼的微阵列检测检出星状诺卡氏菌的结果。
具体实施例方式
实施例1样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出产气荚膜梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提取样品鱼鳞片下表皮、肾组织、肝组织、心脏各一克，匀浆后混合振荡，取匀浆液1mL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，补加TE缓冲液500μl，振荡混匀。加同体积Tris饱和酚pH值8.0，强烈振荡，12000转/分钟，离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，于12000转/分钟离心5分钟。弃去上清，加70％冰乙醇振荡洗涤一次，室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清。加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段成分 浓度 加样量PCR缓冲液10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶5u/μL 0.3μL引物110μmol/L2μL引物210μmol/L2μLdNTPs 每种 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA样品 2μL双蒸水33.1μL总体积50LPCR方法中扩增程序为1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重复5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重复25次9)72℃ 2min
3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交*预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入塑料袋，加入预杂交液，封好口。预杂交30min，50℃。
*扩增PCR产物热变性DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛标记靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的芯片装入塑料袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10uL，再加入1mL杂交液，封好口。50℃，杂交1hr，温和搅动。
4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十三(产气荚膜梭菌探针1 Cperfip1)、探针位点二十四(产气荚膜梭菌探针2 Cperfip2)、均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有产气荚膜梭菌，见图2。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有产气荚膜梭菌。这说明产气荚膜梭菌寡核苷酸探针的阳性结果是有效的。
实施例2样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出迟缓爱德华疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十(迟缓爱德华氏菌探针1 Etar1)、探针位点十一(迟缓爱德华氏菌探针2 Etar2)均为深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有迟缓爱德华氏菌，见图3。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有迟缓爱德华氏菌。这说明迟缓爱德华氏菌探针阳性结果是有效的。
实施例3样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出创伤弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十二(创伤弧菌探针1 VvulI1p1)、探针位点三十三(创伤弧菌探针2 VvulI1p2)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有创伤弧菌，见图4。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有创伤弧菌。这说明创伤弧菌探针的阳性结果是有效的。
实施例4样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出多杀巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点五(巴斯德菌属通用探针PFirc1)、探针位点六(多杀巴斯德氏菌探针2 Pmulii3)、均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有多杀巴斯德氏菌，见图5。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有多杀巴斯德氏菌。这说明多杀巴斯德氏菌寡核苷酸探针的阳性结果是有效的。
实施例5样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出副溶血弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十四(副溶血弧菌探针1Vpar1)、探针位点三十五(副溶血弧菌探针2Vpar2)均为深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有副溶血弧菌，见图6。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有副溶血弧菌。这说明副溶血弧菌探针的阳性结果是有效的。
实施例6样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出鲑鱼肾杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十一(鲑鱼肾杆菌探针1 Rsalip1)、探针位点二十二(鲑鱼肾杆菌探针2 Rsalip2)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有鲑鱼肾杆菌，见图7。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有鲑鱼肾杆菌。这说明鲑鱼肾杆菌探针的阳性结果是有效的。
实施例7样本；某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出海分枝杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十七(海分支杆菌探针2 Mm2)深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有海分枝杆菌，见图8。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有海分枝杆菌。这说明海分枝杆菌寡核苷酸探针的阳性结果是有效的。
实施例8样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出鮰鱼爱德华氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点八(鮰鱼爱德华氏菌探针1 Eict1)、探针位点九(鮰鱼爱德华氏菌探针2 Eict2)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有鲁氏耶尔森，见图9。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有鮰鱼爱德华氏菌。这说明鮰鱼爱德华氏菌探针的阳性结果是有效的。
实施例9样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出霍乱弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十八(霍乱弧菌及拟态弧菌探针1)、探针位点二十九(霍乱弧菌及拟态弧菌探针2)探针位点三十(霍乱弧菌探针1 VchoI2p1)探针位点三十一(霍乱弧菌探针2 VchoI2p2)均为深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有霍乱弧菌，见图10。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有霍乱弧菌。这说明霍乱弧菌探针的阳性结果是有效的。
实施例10样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出鲁氏耶尔森氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十二(耶尔森氏菌属通用探针YerFip1)、探针位点十三(鲁氏耶尔森氏菌探针1 YerFip2)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有鲁氏耶尔森氏菌，见图11。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有鲁氏耶尔森氏菌。这说明鲁氏耶尔森氏菌探针的阳性结果是有效的。
实施例11样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出鳗弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十六(鳗弧菌探针1)见图12。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有鳗弧菌。这说明鳗弧菌寡核苷酸探针的阳性结果是有效的。
实施例12样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出拟态弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十八(霍乱弧菌及拟态弧菌探针1 VcmIIp1)、探针位点二十九(霍乱弧菌及拟态弧菌探针2 VcmI3p2)均为深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有拟态弧菌，见图13。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有拟态弧菌。这说明拟态弧菌探针的阳性结果是有效的。
实施例13
样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出肉毒梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十五(肉毒梭菌探针1 Cbotrip)、探针位点二十六(肉毒梭菌探针2 Cbotrip)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有肉毒梭菌，见图14。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有肉毒梭菌。这说明肉毒梭菌探针的阳性结果是有效的。
实施例14样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出杀鲑气单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十四(气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1)、探针位点十五(杀鲑气单胞菌探针1 AF&Valgip3)、探针位点十六(杀鲑气单胞菌探针2 AsalValipr)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有杀鲑气单胞菌，见图15。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有杀鲑气单胞菌。这说明杀鲑气单胞菌探针探针的阳性结果是有效的。
实施例15样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出杀鱼巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点五(巴斯德菌属通用探针PFirc1)、探针位点七(杀鱼巴斯德氏菌探针1 Pmulii2)均为深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有杀鱼巴斯德氏菌，见图16。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有杀鱼巴斯德氏菌氏菌。这说明杀鱼巴斯德氏菌探针的阳性结果是有效的。
实施例16样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出豚鼠气单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十四(气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1)、探针位点十七(豚鼠气单胞菌探针1 AcavG1ip1)探针位点十八(豚鼠气单胞菌探针2 AcavG1ip2)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有豚鼠气单胞菌，见图17。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有豚鼠气单胞菌。这说明豚鼠气单胞菌探针的阳性结果是有效的。
实施例17样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出温和气单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十四(气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1)、探针位点十九(温和气单胞菌探针1 Asobculip1)探针位点二十(温和气单胞菌探针2 Asobculip2)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有温和气单胞菌，见图18。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有温和气单胞菌。这说明温和气单胞菌探针的阳性结果是有效的。
实施例18样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出星状诺卡氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR扩增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三(星状诺卡氏菌探针Nser2)、探针位点四(星状诺卡氏菌探针NSER1)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有星状诺卡氏菌，见图19。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有星状诺卡氏菌。这说明星状诺卡氏菌探针的阳性结果是有效的。
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学<120>利用核糖体操纵子间区探针检测水生动物病原菌的方法<130>20060710<160>34<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>星状诺卡氏菌<220>
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ggtaataagg tattgcagta aagtc25<210>9<211>25<212>DNA<213>迟缓爱德华氏菌<220>
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<213>温和气单胞菌<220>
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<211>24<212>DNA<213>鳗弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<400>34tttgaacaca atgggcgatt agct 2权利要求
1.一种利用核糖体操纵子间区探针检测水生动物病原菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)设计特异性寡核苷酸探针，用于寡核苷酸微阵列检测检测，所设计的特异性寡核苷酸探针序列如下序列一星状诺卡氏菌探针Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA序列二星状诺卡氏菌探针NSER1 GGCAAACCATCAGAGCATG序列三巴斯德菌属通用探针PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG序列四多杀巴斯德氏菌探针2 Pmulii 3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA序列五杀鱼巴斯德氏菌探针1 Pmulii 2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC序列六鲴鱼爱德华氏菌探针Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG序列七鲴鱼爱德华氏菌探针2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG序列八迟缓爱德华氏菌探针1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC序列九迟缓爱德华氏菌探针2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA序列十耶尔森氏菌属通用探针YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC序列十一鲁氏耶尔森氏菌探针1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA序列十二气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT序列十三杀鲑气单胞菌探针1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC序列十四杀鲑气单胞菌探针2 AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT序列十五豚鼠气单胞菌探针1 AcavGlip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG序列十六豚鼠气单胞菌探针2 AcavGlip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA序列十七温和气单胞菌探针1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG序列十八温和气单胞菌探针2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA序列十九鲑鱼肾杆菌探针1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC序列二十鲑鱼肾杆菌探针2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC序列二十一产气荚膜梭菌探针1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTTAATTT序列二十二产气荚膜梭菌探针2 Cperfip2AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA序列二十三肉毒梭菌探针1 CbotripTAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT序列二十四肉毒梭菌探针2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG序列二十五海分支杆菌探针2 Mm2 ATTGGATGCG CTGCCTTTTG GTGGC序列二十六霍乱弧菌及拟态弧菌探针1 VcmIIp1 GAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT序列二十七霍乱弧菌及拟态弧菌探针2 VcmI3p2 AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG序列二十八霍乱弧菌探针1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG序列二十九霍乱弧菌探针2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT序列三十创伤弧菌探针1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT序列三十一创伤弧菌探针2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT序列三十二副溶血弧菌探针1Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA序列三十三副溶血弧菌探针2Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG序列三十四鳗弧菌探针1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT(2)PCR扩增待测样品中全部原核微生物的23s rRNA基因内的DNA片，同时进行地高辛标记；(3)将寡核苷酸微阵列和地高辛标记的PCR产物进行分子杂交；(4)杂交结果通过酶联免疫显色技术显色；(5)显色结果用肉眼观察，可发现进行杂交的特异性探针位点显色。
2.运用核糖体操纵子间区探针检测多种水生动物病原菌的方法在检测方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用核糖体操纵子间区探针组成寡核苷酸微阵列检验多种能够导致水生动物传染病病原菌的方法，其技术原理为分子杂交——酶联免疫显色技术，属于细菌检测技术，其技术方案是用生物信息学方法设计特异性探针，包括设计筛选的34条用作探针的寡核苷酸序列以及与之配套的PCR和杂交反应条件。通过PCR扩增并用地高辛标记细菌16s－23srRNA基因间区序列，并用该PCR产物和一组特异性的寡核苷酸探针杂交，经酶联免疫显色显色后，可以从待测样品中，精确检测出是否存在水生动物传染病病原菌。该方法的优点是，省去了重复的细菌培养筛选环节，节约时间；分子杂交鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
文档编号C12Q1/04GK1877327SQ20061001476
公开日2006年12月13日 申请日期2006年7月12日 优先权日2006年7月12日
发明者黄熙泰, 侯艳梅, 刘寅, 张立怀, 郑泽军, 高旗利, 周浩, 董志珍, 李永君, 王玉玲, 魏晓娜, 霍蕾 申请人:南开大学, 中华人民共和国天津出入境检验检疫局