管花肉苁蓉鉴定引物dna序列及管花肉苁蓉鉴别方法

文档序号:441333阅读:535来源:国知局
专利名称:管花肉苁蓉鉴定引物dna序列及管花肉苁蓉鉴别方法
技术领域
本发明是一种检测中药材的技术领域的鉴定引物DNA序列及鉴别方法,具体是一种管花肉苁蓉鉴定引物DNA序列及管花肉苁蓉鉴别方法。
背景技术
肉苁蓉(Herba Cistanches),俗称大芸。中国药典(2005年版)规定肉苁蓉为列当科(Orobanchaceae)植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉苁蓉C.tubulosa(Schrenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。肉苁蓉属为寄生植物,生于干旱沙漠,寄主为梭梭(Haloxylon ammodena(C.A.Mey.)Bunge)、白梭梭(H.persicum)、柽柳(Tamarixspp.)、盐爪爪(Kalidium spp.)等,世界约有20余种,我国分布有荒漠肉苁蓉(C.deserticola)、管花肉苁蓉(C.tubulosa)、盐生肉苁蓉(C.salsa)、沙苁蓉(C.sinensis)和兰州肉苁蓉(C.lanzhouensis),也有报道称兰州肉苁蓉实际为沙苁蓉。由于肉苁蓉生长繁殖的特殊性,加之疗效显著而被人为的滥挖以及大批砍伐其寄主梭梭,致使肉苁蓉野生资源急骤减少,因此同属其它植物也在各地区作肉苁蓉入药。市场上甚至也有以列当(Orobanche cumina)及锁阳(Cynomoriumsongaricum)混淆使用。
鉴于肉苁蓉药材资源紧缺以及市场上伪品较多等问题,因此需要快速、准确鉴别药材真伪的方法。然而传统的形态鉴别要求有一定的经验,对于破碎后的药材就更加难以准确鉴别。DNA分子标记直接分析生物基因型而非表现型,所以鉴定结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响,不仅可以弥补中药的形态鉴别中的主观因素,同时具有用量少、效率高、准确可靠的特点,对于肉苁蓉的资源保护与药材鉴别有着重要意义。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种对管花肉苁蓉药材能够准确鉴别其真伪的聚合酶链式反应的引物及其鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的,本发明所设计的管花肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物的序列为引物15’-AGT CTT GAC CCG CGA TTT-3’引物25’-ACA ACG GAA GGC ATA GAA-3’中药管花肉苁蓉的聚合酶链式反应鉴定的方法为1)肉苁蓉药材的DNA的提取;2)鉴别性聚合酶链式反应反应体系以25μl为参考,鉴定引物用无离子水调至10mM,采用TIANGEN公司的2×Taq Plus Master Mix进行反应;反应条件94℃预变性5分钟,然后按下列参数进行40次循环反应;3)聚合酶链式反应产物的检测取上述反应混和液6~8μl,与2μl加样缓冲液混合均匀,用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙锭,即EB),电压5v/cm,电泳检测扩增结果。
4)若有阳性扩增,则供试样品为正品管花肉苁蓉;若为阴性,即无扩增条带,则供试样品不为管花肉苁蓉。
所述的肉苁蓉药材DNA的提取,可以采用QIAGEN公司的DNeasy PlantMini Kit,具体方法(1)称取干燥药材样品400mg,分别用蒸馏水和75%酒精冲洗表面,剪至1~2mm碎片,置于灭菌的研钵中,加入液氮并迅速研磨成细粉,置于2ml离心管中。
(2)加入400μl提取缓冲液AP1和4μlRNase A贮存液(100mg/ml),用涡旋混匀器混匀。40℃保温30min-60min,其间翻转2-3次以保证充分混匀。
(3)加入130μl缓冲液AP2,混匀后置冰上恒温30min。1,0000rpm离心10min。
(4)将上清液转移置2ml的QIA shredder Mini Spin Column收集管中,1,0000rpm离心10min。得到的离心液转移至一个新的离心管中。
(5)加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E,混匀。吸取650μl混合液(包括产生的絮状沉淀),加入到2ml的DNeasy Mini Spin Column收集管中,8,000rpm离心1min,弃离心液。
(6)重复上一步操作,直至加完所有的混合液,弃离心液和收集管。
(7)将DNeasy Mini Spin Colum置于新的2ml收集管中,加入500μl缓冲液AW,8,000rpm离心1min,弃离心液。
(8)在DNeasy Mini Spin Colum中加入500μl缓冲液AW,1,0000rpm离心10min以干燥膜。
(9)将DNeasy Mini Spin Colum置于新的1.5ml离心管中。吸取50μl 65℃预热的缓冲液AE,小心加入至离心柱膜上,室温放置5min后,8,000rpm离心1min洗脱,收集洗脱液。
(10)重复洗脱一次。合并洗脱液,置于-20℃冰箱保存备用。
所述的鉴别性聚合酶链反应,是指(1)反应体系以25μl为参考,引物用无离子水调至10mM,采用TIANGEN公司的2×Taq Plus Master Mix进行反应,聚合酶链式反应各试剂的用量分别为2×Taq Plus Master Mix 12.5μl引物1(10mM) 1μl引物2(10mM) 1μl总DNA模板 25ng无离子水补齐到25μl,混匀后,瞬时离心。
(2)聚合酶链反应条件反应在PCR仪上进行,94℃预变性5分钟,然后按照下列参数进行40次循环反应变性94℃ 50秒复性52~56℃ 1分钟延伸72℃ 1分钟循环结束后在72℃保持8分钟补齐,反应结束后在4℃保存。
所述的聚合酶链式反应产物的检测,是指取出上述反应混和液6~8μl,与2μl加样缓冲液混合均匀,用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙锭,即EB),电压5v/cm,电泳检测扩增结果。
若有阳性扩增,则供试样品为正品管花肉苁蓉;若为阴性,即无扩增条带,则供试样品不为管花肉苁蓉。
本发明解决了中药材管花肉苁蓉真伪的鉴别问题,设计了可以鉴别管花肉苁蓉的一对高效特异性引物,该引物在给定的反应条件下,能够特异性地鉴别管花肉苁蓉,对于其他种类的肉苁蓉或伪品均不能扩增出相应的DNA片段。由于应用了PCR方法,因此可以快速方便地检测样品的真伪,通常只需要极少量的样品,用此引物可以制造用于管花肉苁蓉鉴别的试剂盒。本发明对于从事中药生产、销售的部门快速准确地鉴定管花肉苁蓉,控制药材质量是十分必要的,对于各地药检部门打击假冒伪劣药材,净化药材市场将是十分有效的。


图1本发明PCR实施结果示意图其中M为1kb DNA分子量梯度,1为荒漠肉苁蓉,2为盐生肉苁蓉,3为沙苁蓉,4为管花肉苁蓉,5为锁阳,6为草苁蓉,7为列当,CK为空白对照。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明首先用植物DNA提取试剂盒(QIAGEN,Germany)加以改进的方法从肉苁蓉药材的不同种的原植物以及混淆品的列当、锁阳等植物中提取总DNA,用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化,将各纯化的片段进行DNA序列分析,建立管花肉苁蓉药材及其伪、混品的DNA序列数据库。在比较数据库的基础上,针对药材伪、混品出现的情况选择合适的DNA区段,设计一对鉴别性PCR引物引物15’-AGT CTT GAC CCG CGA TTT-3’;引物25’-ACA ACG GAA GGC ATA GAA-3’。
用全自动DNA合成仪按上述DNA序列进行合成,即可得到鉴定引物的白色粉末结晶。
以上均为本发明的基础工作,本发明的使用者只需按实施例实施即可1.肉苁蓉药材DNA的提取,采用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit进行提取(1)称取干燥药材样品400mg,分别用蒸馏水和75%酒精冲洗表面,剪至1-2mm碎片,置于灭菌的研钵中,加入液氮并迅速研磨成细粉,置于2ml离心管中。
(2)加入400μl提取缓冲液AP1和4μl RNase A贮存液(100mg/ml),用涡旋混匀器混匀。40℃保温30min-60min,其间翻转小管2-3次,保证充分混匀。
(3)加入130μl缓冲液AP2,混匀后置冰上恒温30min。1,0000rpm离心10min。
(4)将上清液转移置2ml的QIAshredder Mini Spin Column收集管中,1,0000rpm离心10min。得到的离心液转移至一个新的离心管中,注意不要吸入沉淀。
(5)加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E,混匀。吸取650μl混合液(包括产生的絮状沉淀),加入到2ml的DNeasy Mini Spin Column收集管中,8,000rpm离心1min,弃离心液。
(6)重复上一步操作,直至加完所有的混合液,弃离心液和收集管。
(7)将DNeasy Mini Spin Colum置于新的2ml收集管中,加入500μl缓冲液AW,8,000rpm离心1min,弃离心液。
(8)在DNeasy Mini Spin Colum中加入500μl缓冲液AW,1,0000rpm离心10min以干燥膜。
(9)将DNeasy Mini Spin Colum置于新的1.5ml离心管中。吸取50μl 65℃预热的缓冲液AE,小心加入至离心柱膜上,室温放置5min后,8,000rpm离心1min洗脱,收集洗脱液。
(10)重复洗脱一次。合并洗脱液,置于-20℃冰箱保存备用。
2.鉴别性聚合酶链反应(1)反应体系以25μl为参考,引物用无离子水调至10mM,采用TIANGEN公司的2×Taq Plus MasterMix进行反应,各物品的用量分别为2×Taq Plus Master Mix12.5μl引物(10mM)1μl总DNA模板 25ng加灭菌蒸馏水至总体积为25μl,混匀后,瞬时离心。
(2)聚合酶链反应条件反应在PCR仪上进行,94℃预变性5分钟,然后按照下列参数进行40次循环反应变性94℃ 50秒复性52~56℃ 1分钟延伸72℃ 1分钟循环结束后在72℃保持8分钟补齐,反应结束后在4℃保存。
3.反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6~8μl,与2μl加样缓冲液混合均匀,用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙锭,即EB),电压5v/cm,电泳检测扩增结果。
权利要求
1.一种管花肉苁蓉鉴定引物的DNA序列,其特征在于,所设计的管花肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物DNA序列为引物15’-AGT CTT GAC CCG CGA TTT-3’;引物25’-ACA ACG GAA GGC ATA GAA-3’。
2.一种管花肉苁蓉鉴别方法,其具体方法为1)药材DNA的提取;2)鉴别性聚合酶链式反应反应体系以25μl为参考,引物用无离子水调至10mM进行反应;反应条件94℃预变性5分钟,然后按照下列参数进行40次循环反应;3)聚合酶链式反应产物的检测取上述反应混和液6~8μl,与2μl加样缓冲液混合均匀,用2%琼脂糖凝胶,电压5v/cm,电泳检测扩增结果;若有阳性扩增,则供试样品为正品管花肉苁蓉;若为阴性,即无扩增条带,则供试样品不为管花肉苁蓉。
3.根据权利要求2所述的管花肉苁蓉鉴别方法,其特征是,所述的聚合酶链反应,各试剂的用量分别为2×Taq Plus Master Mix 12.5μl,引物1μl;总DNA模板25ng,无离子水补齐到25μl,混匀后,瞬时离心。
4.根据权利要求2所述的管花肉苁蓉鉴别方法,其特征是,所述的循环反应按下列参数进行变性94℃50秒,复性52~56℃1分钟,延伸72℃1分钟,循环40次,循环结束后在72℃保持8分钟,反应结束后在4℃保存。
5.根据权利要求2所述的管花肉苁蓉鉴别方法,其特征是,所述的2%琼脂糖凝胶是指含0.5%溴化乙锭。
全文摘要
一种检测中药材的技术领域的管花肉苁蓉鉴定引物DNA序列及管花肉苁蓉鉴别方法。本发明所设计的管花肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物DNA序列为引物15’-AGT CTT GAC CCG CGATTT-3’;引物25’-ACA ACG GAAGGC ATA GAA-3’。管花肉苁蓉鉴别方法为药材DNA的提取;聚合酶链式反应产物的检测;若有阳性扩增,则供试样品为正品管花肉苁蓉;若为阴性,即无扩增条带,则供试样品不为管花肉苁蓉。本发明解决了中药材管花肉苁蓉真伪的鉴别问题。对于从事中药生产、销售的部门快速准确地鉴定管花肉苁蓉,控制药材质量是十分必要的。对于各地药检部门打击假冒伪劣药材,净化药材市场将是十分有效的。
文档编号C12Q1/68GK1896276SQ200610027990
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月22日 优先权日2006年6月22日
发明者李晓波, 王敬, 屠鹏飞 申请人:上海交通大学
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