专利名称：用低次烟叶蛋白制备抑菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及到用低次烟叶蛋白制备抑菌肽的方法。
背景技术：
中国是烟草种植和生产大国，其种植面积和产量均居世界首位。在烟草种植和加工过程中，产生了大量的低次烟叶、烟梗、烟末和烟籽等烟草废弃物，约占烟叶总产量的25％。对低次烟叶资源的综合利用，一直受到国内外研究者的重视。有很多研究报道从低次烟叶中提取类似大豆蛋白质的烟叶蛋白质，作为食物蛋白来源和优质饲料添加剂。从烟叶蛋白的提取方法来看，早期研究工作者所提取的烟叶蛋白往往带有颜色和味道，并且生产工艺复杂，投资大，产量低，成本难以被接受。后来许多科研工作者对烟叶中的烟叶蛋白进行了提纯，得到了高纯度的烟叶蛋白，其中特别是Kung和Tso、Lowe对烟叶中FI蛋白提纯方法的逐步简化做了很大贡献。但纵观国内外科研工作者所研究总结出的提取方法，都需有超速或高速冷冻离心步骤，并且大多过程需控制在0～4℃左右；亦有采用等电聚焦、凝胶电泳、超滤等方法提取烟叶蛋白。这些方法虽然能获得纯净的烟叶蛋白，但成本太高，单位时间提取的产量较低，难以适应大规模工业化生产。我国开发利用烟叶蛋白的研究工作起步较晚，仅对烟叶蛋白的提取方法进行了一些初步探讨，但规模化提取烟叶蛋白的技术难题还有待解决。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种用低次烟叶蛋白制备抑菌肽的方法。本发明通过高效提取低次烟叶蛋白(烟叶蛋白提取率达到86.71％，比文献报道中的提取率高出一倍多)、有效控制烟叶蛋白的酶解过程、分级膜分离酶解液富集生物活性肽、具有工艺操作简便、生产成本低、没有任何污染、所得抑菌活性肽生物活性稳定，最低抑菌浓度为0.05％，安全性高等优点，能广泛应用于食品领域中，为低此烟叶的深加工利用提供了一条新的途径。
本发明的用低次烟叶蛋白制备抑菌肽的方法，包括如下步骤(1)用碱溶酸沉法提取低次烟叶中的蛋白质制备烟叶蛋白浆；(2)采用复合蛋白酶对烟叶蛋白浆进行限制性酶解后，灭酶，制备烟叶蛋白酶解液；(3)采用超滤膜对烟叶蛋白酶解液进行分级分离获得烟叶蛋白抑菌肽混合液；(4)将烟叶蛋白抑菌肽混合液冷冻干燥或喷雾干燥。
优选方案如下步骤(1)中，将低次烟叶粉碎成60-100目的烟叶粉末后，将烟叶粉末与水以1∶10～15混合，40～60℃磨浆，用氢氧化钠调整pH值至为7.5～8.5，搅拌1小时后用200目滤布过滤，滤液为碱提烟叶蛋白溶液；滤渣采用上述工艺再碱溶1-2次，过滤除杂，合并碱提烟叶蛋白溶液；用盐酸调整碱提烟叶蛋白溶液的pH值至2.5～3.5，在4-10℃下酸沉6-10hr后，离心沉淀蛋白，即得烟叶蛋白浆。
所述离心沉淀蛋白中的离心条件是4800rpm，4-10℃，20-30min。
步骤(2)中，将烟叶蛋白浆溶解在水中，使蛋白浓度达到4-8％，混合均匀后用0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠将溶液pH值调节到6.0-7.5，温度保持在40-50℃，加入蛋白酶3000-4500U/g蛋白，水解度控制在3-7％，灭酶，得到烟叶蛋白酶解液。
步骤(2)得到的烟叶蛋白酶解液通过分子量10000Da的超滤膜除去大分子物质后得透过液；用截留分子量为1000Da的超滤膜对透过液进行二次超滤剔除小分子肽、氨基酸及其他杂质成分，即得分子量为1000Da-10000Da的烟叶蛋白抑菌肽混合液，将其冷冻干燥或喷雾干燥保存。
步骤(2)中所述酶采用ProtamexTM或木瓜蛋白酶。
步骤(2)中，酶解反应结束后，在100℃加热10min灭酶，将酶解产物冷却到25℃。
本发明与现有技术相比，具有如下优点碱溶酸沉法提取低次烟叶中的蛋白可以显著提高低次烟叶蛋白提取率，跟文献报道中所提到的有机溶剂提取法和水浸提法的提取率相比，蛋白提取率提高了一倍多；通过控制低次烟叶蛋白的降解程度，得到具有明显抗菌活性的生物活性肽；通过分级膜分离技术，使其有效抑菌肽得以富集，最低抑菌浓度为0.05％。本发明工艺操作简便、生产成本低、没有任何污染、所得抑菌活性肽生物活性稳定，安全性高，可广泛应用于食品领域中。
具体实施例方式
实施例1第一步将低次烟叶粉碎成100目的烟叶粉末后，与水以1∶10混合，40℃磨浆，用氢氧化钠调整pH值至为7.5，搅拌1小时后用200目滤布过滤，滤液为碱提烟叶蛋白溶液。滤渣采用上述工艺再碱溶2次，过滤除杂，合并碱提烟叶蛋白溶液；用盐酸调整碱提烟叶蛋白溶液的pH值至2.5，在4℃下酸沉6hr后，4800rpm，4℃，离心20min，沉淀蛋白，得烟叶蛋白浆，其回收率达86.71％。
第二步将低次烟叶蛋白浆溶解在水中，使蛋白浓度达到4％，混合均匀后用0.1M盐酸将溶液pH值调节到6.0，温度保持在40℃，加入复合蛋白酶(ProtamexTM)4500U/g蛋白，水解度控制在3％，得到酶解烟叶蛋白液，100℃加热10min灭酶；第三步将烟叶蛋白酶解液控制通过分子量10000Da的超滤膜除去大分子物质后得透过液；采用截留分子量为1000Da的超滤膜对透过液进行二次超滤剔除小分子肽、氨基酸及其他杂质成分，即得分子量为1000Da-10000Da的烟叶蛋白抑菌肽混合液，将其冷冻干燥保存，其最低抑菌浓度为0.09％。
实施例2第一步将低次烟叶粉碎成80目的烟叶粉末后，与水以1∶12混合，50℃磨浆，用氢氧化钠调整pH值至为8，搅拌1小时后用200目滤布过滤，滤液为碱提烟叶蛋白溶液。滤渣采用上述工艺再碱溶2次，过滤除杂，合并碱提烟叶蛋白溶液；用盐酸调整碱提烟叶蛋白溶液的pH值至3.0，在4℃下酸沉6hr后，4800rpm，4℃，离心20min以沉淀蛋白，得烟叶蛋白浆，其回收率达84.24％。
第二步将低次烟叶蛋白浆溶解在水中，使蛋白浓度达到4-8％，混合均匀后用0.1M氢氧化钠将溶液pH值调节到7.0，温度保持在45℃，加入木瓜蛋白酶3000U/g蛋白，水解度控制在5％，得到酶解烟叶蛋白液，100℃加热10min灭酶；第三步将烟叶蛋白酶解液温度控制通过分子量10000Da的超滤膜除去大分子物质后得透过液；采用截留分子量为1000Da的超滤膜对透过液进行二次超滤剔除小分子肽、氨基酸及其他杂质成分，即得分子量为1000Da-10000Da的烟叶蛋白抑菌肽混合液，将其冷冻干燥保存，其最低抑菌浓度为0.07％。
实施例3第一步将低次烟叶粉碎成60目的烟叶粉末后，与水以1∶15混合，50℃磨浆，用氢氧化钠调整pH值至为8.5，搅拌1小时后用200目滤布过滤，滤液为碱提烟叶蛋白溶液。滤渣采用上述工艺再碱溶1次，过滤除杂，合并碱提烟叶蛋白溶液；用盐酸调整碱提烟叶蛋白溶液的pH值至3.0，在4℃下酸沉10hr后，4800rpm，4℃，离心20min，沉淀蛋白，即得烟叶蛋白浆，其回收率达83.53％。
第二步将低次烟叶蛋白浆溶解在水中，使蛋白浓度达到8％，混合均匀后用氢氧化钠将溶液pH值调节到8.5，温度保持在50℃，加入木瓜蛋白酶4000U/g蛋白，水解度控制在7％，得到酶解烟叶蛋白液，100℃加热10min灭酶；第三步将烟叶蛋白酶解液温度控制通过分子量10000Da的超滤膜除去大分子物质后得透过液；采用截留分子量为1000Da的超滤膜对透过液进行二次超滤剔除小分子肽、氨基酸及其他杂质成分，即得分子量为1000Da-10000Da的烟叶蛋白抑菌肽混合液，将其冷冻干燥保存，其最低抑菌浓度为0.05％。
权利要求
1.一种用低次烟叶蛋白制备抑菌肽的方法，其特征在于包括如下步骤(1)利用碱溶酸沉法提取低次烟叶中的蛋白质制备烟叶蛋白浆；(2)采用复合蛋白酶对烟叶蛋白浆进行限制性酶解后，灭酶，制备烟叶蛋白酶解液；(3)采用超滤膜对烟叶蛋白酶解液进行分级分离获得烟叶蛋白抑菌肽混合液；(4)将烟叶蛋白抑菌肽混合液冷冻干燥或喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，将低次烟叶粉碎成60-100目的烟叶粉末后，将烟叶粉末与水以1∶10～15混合，40～60℃磨浆，用氢氧化钠调整pH值至为7.5～8.5，搅拌1小时后用200目滤布过滤，滤液为碱提烟叶蛋白溶液；滤渣采用上述工艺再碱溶1-2次，过滤除杂，合并碱提烟叶蛋白溶液；用盐酸调整碱提烟叶蛋白溶液的pH值至2.5～3.5，在4-10℃下酸沉6-10hr后，离心沉淀蛋白，即得烟叶蛋白浆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，将烟叶蛋白浆溶解在水中，使蛋白浓度达到4-89％，混合均匀后用0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠将溶液pH值调节到6.0-7.5，温度保持在40-50℃，加入蛋白酶3000-4500U/g蛋白，水解度控制在3-7％，灭酶，得到烟叶蛋白酶解液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将步骤(2)得到的烟叶蛋白酶解液通过分子量10000Da的超滤膜除去大分子物质后得透过液；用截留分子量为1000Da的超滤膜对透过液进行二次超滤剔除小分子肽、氨基酸及其他杂质成分，即得分子量为1000Da-10000Da的烟叶蛋白抑菌肽混合液，将其冷冻干燥或喷雾干燥保存。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述离心沉淀蛋白中的离心条件是4800rpm，4-10℃，20-30min。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述酶采用ProtamexTM或木瓜蛋白酶。
7.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于步骤(2)中，酶解反应结束后，在100℃加热10min灭酶，将酶解产物冷却到25℃。
全文摘要
本发明涉及用低次烟叶蛋白制备抑菌肽的方法，包括利用碱溶酸沉法提取低次烟叶中的蛋白质制备烟叶蛋白浆；采用复合蛋白酶对烟叶蛋白浆进行限制性酶解后，灭酶，制备烟叶蛋白酶解液；采用超滤膜对烟叶蛋白酶解液进行分级分离获得烟叶蛋白抑菌肽混合液；将烟叶蛋白抑菌肽混合液冷冻干燥或喷雾干燥；得到的烟叶蛋白抑菌肽混合物能有效抑制革兰氏阴性菌的生长繁殖，最低抑菌浓度为0.05％，可以作为食品添加剂广泛应用于食品及相关领域中；本发明通过碱溶酸沉法可显著提高烟叶蛋白的提取率；通过生物酶解可有效控制蛋白的降解程度；通过超滤膜分离酶解液富集生物活性肽，简化分离操作工艺，提高生物活性肽的有效浓度。
文档编号A23J3/00GK1827773SQ20061003469
公开日2006年9月6日 申请日期2006年3月28日 优先权日2006年3月28日
发明者赵谋明, 崔春, 饶国华 申请人:华南理工大学