专利名称：灰树花菌株、培养方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种一种生物材料——灰树花菌株，其发酵产物及其提取物具有药用功能的微生物，及其在灰树花多糖，尤其是灰树花β-葡聚糖生产、片剂、软胶囊及硬胶囊剂等胶囊剂、水针和冻干粉针剂等注射剂生产方面的应用。
背景技术：
自从1969年日本科学家千原吴朗发现香菇多糖具有抗肿瘤活性之后，各国科学家纷纷致力于真菌多糖在抗肿瘤领域的研究，开创了肿瘤生物治疗，尤其是免疫治疗的新领域，并取得突出进展。在真菌多糖中，涌现出一大批疗效显著的多糖类抗肿瘤制剂。
宫崎利夫和大野尚仁(1984)发表了灰树花子实体多糖具有抗肿瘤活性的报道之后，日本对灰树花多糖的研究逐步深入。大野尚仁(1986)比较了液体培养的菌丝体多糖与子实体多糖的抗肿瘤活性，发现二者十分相似。指出通过液体培养菌丝体生产多糖的工艺条件较从子实体提取多糖温和而简单，适合于大规模生产。在药理方面，大野尚仁报道了灰树花多糖的抗肿瘤活性受巨噬细胞系统的调节作用的影响，除对多种实体瘤有抑制作用外，对腹水瘤也同样有效。
Takahiro.T等(1987)揭示了灰树花多糖的抗肿瘤机制。灰树花多糖对培养的肿瘤细胞无直接细胞毒作用，但可增加对肿瘤细胞有细胞毒作用的腹腔渗出细胞和内皮网状细胞的数量，增加有细胞毒作用的T细胞的效应。揭示了灰树花多糖的抗肿瘤活性是通过宿主的中介反应及巨噬细胞和T细胞的共同作用而实现的。
Iwao.S等(1989)报道了液体培养菌丝体多糖在抗肿瘤活性及免疫调节活性方面与子实体多糖有相似之处，可促进自然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞的活性，同时促进抗体反应，腹腔渗出细胞(PEC)数量，白细胞介素1(IL-1)，酸性磷酸酶，PEC中附着细胞的吞噬能力均大大提高。同时，碳粒廓清能力也增加。这一发现为灰树花多糖的发酵生产及其应用奠定了理论基础。
水野卓(1991)报道了灰树花糖蛋白的抗肿瘤活性，它具有抑制肿瘤发生和抑制肿瘤转移作用，不仅注射有效，口服也同样有效，而且其起效剂量低于纯多糖。Nanba.H等(1995)报道，灰树花多糖除具有免疫调节和抑制肿瘤两方面的功能外，还同时具有抗HIV病毒、降低血压、降低血脂、降低血糖等方面的作用。
1986年，灰树花人工栽培的成功，为灰树花多糖的研究提供了一定的物质基础。随后，大野尚仁等发现，灰树花多糖是所发现的具有最强的抗肿瘤活性的真菌多糖之一。
灰树花多糖的生产多以子实体为原料提取获得。由于灰树花子实体栽培困难，生物学产量低，质量难以控制，使灰树花多糖的开发生产受到极大限制。随着灰树花发酵工艺研究的不断完善，使灰树花菌丝体的大规模获得成为可能，灰树花多糖的药理活性及其在肿瘤治疗和免疫调节方面的价值也不断得到揭示。但由于生产成本高，提取灰树花多糖的纯化问题得不到解决，尤其是适合大规模发酵生产的灰树花菌株始终很难获得，灰树花多糖的实际应用进展缓慢。
本发明所涉及的灰树花菌株，通过野生菌分离纯化，经过长期发酵培养驯化，克服了生长缓慢、培养基生物利用率和生物转化率低的缺点，具备了工业化生产用菌株的特性，为灰树花多糖的应用，特别是灰树花β-葡聚糖的应用，奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种生物材料——灰树花菌株，从其发酵产物中能够获得灰树花多糖，尤其是灰树花β-葡聚糖。
本发明所述的灰树花菌株，命名为灰树花Grifola frondosa(Dichs.ex Fr)S.F.Gray，GF-932，异名Polyporus frondosus(diks.)Fr.，是从野生环境天然菌株中分离筛选得到。该生物材料样品保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.1709，保藏日期为2005年5月11日。
上述灰树花Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.)S.F.Gray的微生物分类学地位，属于真菌门，担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属。
本发明所述菌株的培养特征斜面菌种培养基采用马铃薯琼脂加富培养基，成分如下马铃薯200g；葡萄糖20g；磷酸二氢钾1g；硫酸镁0.5g；琼脂20g；水1000mL；pH＝7.0在PDA平板培养基上27℃培养5～6d，菌落白色，从中心向外呈放射状，菌丝贴生于培养基表面，中部稀疏，向外密集，粉状至絮状，直径达8cm，背面灰白色。
在试管斜面培养基上，25℃培养5～7d可长满斜面，菌丝白而粗壮，在上部沿斜面边缘菌丝密集、厚、呈絮状。
本发明所述菌株的形态特征在显微镜下，形态结构表现为菌丝无色、壁薄、平滑、具隔膜，分枝，无锁状联合，宽2～3.2μm。液体培养基中纠集成团，浅黄色球形或絮状，边缘呈绒毛状，直径1～4mm。
子实体肉质，短柄，呈珊瑚状分枝，末端生扇形至匙形菌盖，重叠成丛；菌盖直径2～7cm，灰色至浅褐色。表面有细毛，老后光滑，有反射性条纹，边缘薄，内卷。菌肉厚白，厚2～7mm。菌管长1～4mm，管孔延生，孔面白色至淡黄色，管口多角形，平均每毫米1～3个。孢子无色，光滑，卵圆形至椭圆形。菌丝壁薄，分枝，有横隔。
本发明的第二个目的是提供所述灰树花菌株的发酵培养方法和培养基的组成。
液体培养用培养基马铃薯1～3％、麸皮提取物1～5％、葡萄糖1～5％、玉米粉0.3～2％、蛋白胨0.1～3％、酵母粉0.1～3％、磷酸二氢钾0.01～1％、硫酸镁0.05～1％。
本发明所述菌株的液体发酵培养特征发酵罐中液体培养第1d，即可见大量细小菌丝球产生。培养第2d，菌丝增值迅速，培养基中有大量形状不规则的菌丝球形成，菌丝球悬浮生长于液体培养基中，菌液黏稠，静置仅有少量分层。培养第3d，菌丝体几乎呈饱和状态，静置不分层，菌丝体形态有带刺菌丝球、絮簇菌丝球和颗粒菌丝球。3～5d即可完成一个发酵培养周期。
该菌株超过用于生产的传代水平(6～9代)后，斜面培养生长速度无明显变化，液体培养过程中菌丝体生长速度也无明显变化，菌丝体收率和多糖得率也无明显下降的趋势，说明该菌株在生产限定传代内性能稳定。
灰树花菌株的发酵条件参数为三级发酵，发酵罐放大比例为1∶10。种子罐和发酵罐的装料系数为50～80％，液体种子接种量为5～10％(V/V)。培养条件培养基C/N为20～30∶1，pH值4～7，溶解氧含量10～100％，温度24～29℃，罐内压力0.5～1.5Mp，搅拌转速100～600r/min。
上述特征表明，本发明所述的灰树花菌株与树花属的其他真菌有很大的不同，与其他用于食用菌栽培的灰树花菌株也有显著差异。主要不同点在于，无论在固体培养基上，还是在液体培养基中，其生长速度异常迅速。本菌株适合于液体深层发酵培养，菌丝体产量高，对培养基的利用率高，多糖等次生代谢产物的产量高，适合工业化大规模生产。
本发明的第三个目的是提供所述灰树花菌株其发酵产物中的灰树花多糖，尤其是提供灰树花β-葡聚糖在片剂、胶囊剂、注射剂等生产方面的应用途径。
利用本发明所述菌株发酵获得灰树花多糖和灰树花β-葡聚糖的工艺流程发酵终点时，对发酵液进行固液分离，回收发酵液分离胞外多糖。滤出的菌丝体真空干燥并超微粉碎，脱脂后用热水提取，残渣用弱酸和碱分别提取。分别对提取物进行浓缩醇沉，真空干燥即得灰树花多糖和糖蛋白。取其中含有β-葡聚糖的提取物，除蛋白后用分离出灰树花β-葡聚糖。
通过上述工艺流程获得的灰树花多糖、糖蛋白和灰树花β-葡聚糖，除具有真菌多糖的一般药理活性，如免疫调节、抑制肿瘤和对放化疗的增效减毒作用外，还具有灰树花多糖特有的药理活性，如抗病毒、体外抗肿瘤活性、肿瘤细胞凋亡诱导活性、抗炎镇痛活性等。
另一个重要的特点在于，本发明所述的灰树花菌株，其代谢产物灰树花多糖不仅注射有效，而且口服也有效。
利用本发明所述菌株发酵获得的灰树花多糖和灰树花β-葡聚糖可应用于保健食品、化妆品和药品等生产领域，可应用于片剂、硬胶囊和软胶囊等胶囊剂的生产，也可用于水针和冻干粉针等注射剂的生产。
附图1为本发明所述菌株的菌丝体和菌球显微形态图(Olympus显微镜，100X、40X)。
附图2为本发明所述菌株得到的灰树花β-葡聚糖的红外吸收光谱图。
附图3为本发明所述菌株得到的灰树花β-葡聚糖的化学结构图。
具体实施例方式
实施例1菌体培养传代培养方法采用斜面传代培养，斜面培养基采用马铃薯琼脂加富培养基，成分如下马铃薯200g；葡萄糖20g；磷酸二氢钾1g；硫酸镁0.5g；琼脂20g；水1000mL；VB1适量，pH自然。
斜面菌种培养基按常规方法制作；接种培养，按无菌操作要求，于无菌室超净台上，采用双斜面接种法接种。接种后，置27±1℃培养1d，即可看到从移接的组织块周围先长出匍匐状菌丝和基内菌丝，然后由匍匐状菌丝伸长成气生菌丝，也有直接伸长成气生菌丝的。4～7d后，幼嫩的菌丝长满斜面，菌丝体呈白色绒毛状，粗壮发达，后期呈毡状。
实施例2摇瓶培养液体培养用培养基马铃薯1％、麸皮1％、葡萄糖2％、玉米粉0.7％、蛋白胨0.3％、酵母粉0.14％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.1％。
制备培养基装入锥形瓶中，装料系数为0.2～0.4，棉塞封口，灭菌。按装料量的5～10％(V/V)接种灰树花菌种，置摇床培养。温度25～30℃、转速90～150r/min。培养2d可见大量新生菌丝球产生，3～5d后液体培养基中即有大量菌丝形成，菌丝悬浮生长于液体培养基中，形态有分枝菌丝、絮簇菌丝物、颗粒菌丝物。
按上述方法培养3～5d，灰树花菌丝体产量为9～15g/100mL。胞内多糖产率8～12％(W/W)，胞外多糖产率0.5～1％(W/V)。
实施例3发酵培养三级发酵，发酵罐放大比例为1∶10。种子罐和发酵罐的装料系数为50～80％，液体种子接种量为5～10％(V/V)。
培养条件培养基C/N为20～30∶1，pH值4～7，温度24～29℃，罐内压力0.5～1.5Mp，搅拌转速100～600r/min，溶解氧含量10～100％。
发酵罐逐级放大，在含有充足氮源和碳源的合成或半合成培养基中，灰树花菌丝体可以在有氧条件下大量生长繁殖，使菌丝量不断积累。种子罐生长周期24～48h，发酵罐生长周期36～72h。用连续放大的方式可在几天内使其生物量成百倍的增长，在3～5d的时间内即可完成一个生长周期。
发酵终点时，菌丝体得率1～2％，多糖得率5～8％，β-葡聚糖得率1～3％。
权利要求
1.一种灰树花菌株，其特征是命名为灰树花Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.)S.F.Gray，菌种编号GF-932，异名Polyporus frondosus(diks.)Fr.，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1709。
2.按照权利要求1所述的灰树花菌株GF-932，其特征是在PDA培养基上27℃培养6d，菌落白色，从中心向外呈放射状，菌丝贴生于培养基表面，中部稀疏，向外密集，粉状至絮状，直径达8cm，背面灰白色。在试管斜面培养基上，25℃培养7d可长满斜面，菌丝白而粗壮，在上部沿斜面边缘菌丝密集、厚、呈絮状。
3.按照权利要求1所述的灰树花菌株GF-932的培养方法，其特征是培养方式为液体深层发酵，在500～1000ml锥形瓶中摇瓶制种，温度25～30℃、转速90～150r/min，培养周期72～96h。在三级发酵罐中逐级培养放大，液体种子接种量5～10％，通气搅拌，溶氧量控制在10～100％之间，一级罐和二级罐发酵周期20～30h，三级罐发酵周期36～72h。
4.按照权利要求1所述的灰树花菌株GF-932的培养方法，其特征是灰树花菌株GF-932在马铃薯葡萄糖麦麸汁培养基中生长，所述的马铃薯葡萄糖麦麸汁培养基，含马铃薯1～3％、麸皮提取物1～5％、葡萄糖1～5％、玉米粉0.3～2％、蛋白胨0.1～3％、酵母粉0.1～3％、磷酸二氢钾0.01～1％、硫酸镁0.05～1％。
5.按照权利要求1所述的灰树花菌株GF-932所产生的灰树花β-葡聚糖，其特征是GF-932灰树花菌种经液体培养后得到的β-葡聚糖多为β(1-3)分支的β(1-6)葡聚糖(见附图3)，分子量50 000～1 000 000Dalton，分子量分布宽度1.5～2.5，并含有少量的结合蛋白。有引湿性；在水中易溶解，在溶解度达30～40mg/mL时溶液变黏稠，最大可溶解140～160mg/mL；不溶解于丙酮、氯仿、乙醚。无固定熔点，在温度达250℃～260℃以上时开始炭化。硫酸-苯酚特征鉴别反应呈黄棕色，在490nm处有最大吸收峰，硫酸-蒽酮特征鉴别反应呈蓝绿色，于620nm附近有最大吸收峰；紫外吸收扫描无明显的特征吸收峰，红外光谱图中在840cm-1波数左右无吸收，在895cm-1波数附近有弱的特征吸收峰(见附图2)，核磁共振1H-NMR图谱中，H1信号均小于4.80ppm。与50mg/L的刚果红溶液结合，最大吸收波长发生明显红移。该β-葡聚糖结构新颖，具有很好的稳定性，经高压灭菌后仍能保持其生物活性，在强碱中也具有很好的稳定性。
6.按照权利要求5所述的灰树花多糖和灰树花β-葡聚糖，其特征是除具有免疫调节、抑制肿瘤作用外，还具有灰树花多糖特有的药理活性，如对放化疗的增效减毒作用、抗病毒、体外抗肿瘤活性、肿瘤细胞凋亡诱导活性、抗炎镇痛活性等。
7.按照权利要求5所述的灰树花多糖和灰树花β-葡聚糖的应用范围，其特征是可用于片剂、硬胶囊和软胶囊等胶囊剂的生产，也可用于水针和冻干粉针等注射剂的生产。
全文摘要
本发明涉及一种其发酵产物的提取物具有药用功能的微生物，一种药食两用真菌灰树花GF－932[Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.)S.F.Gray]，该微生物的培养方法，及其在灰树花多糖，尤其是灰树花β－葡聚糖的生产，包括灰树花多糖在片剂、软胶囊和硬胶囊等胶囊剂、水针和冻干粉针等注射剂生产方面的应用。该灰树花菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1709。本发明所述的灰树花菌株是从野生环境天然子实体中分离筛选并经过长期驯化获得，遗传性状稳定，能够人工发酵生产灰树花β－葡聚糖等多糖，生长速度快，周期短，菌丝体和多糖产率高，适合大规模液体深层培养。
文档编号C12P19/08GK1880444SQ20061004394
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月15日 优先权日2006年5月15日
发明者徐泽平, 王宝琴 申请人:徐泽平, 王宝琴