专利名称：花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法
技术领域：
本发明属于花鲈(Lateolabrax japonicus)DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测花鲈微卫星标记LJ_liu的技术方法，具体是花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法。
背景技术：
花鲈(Lateolabrax japonicus)，又名鲈鱼，为广温性近岸中下层鱼类，分布于我国、日本、朝鲜沿海水域，是我国沿海养殖和出口创汇的重要品种。为合理利用和保护野生花鲈种质资源，一些学者利用同工酶技术和RAPD技术研究了花鲈的遗传结构及其遗传多样性。然而由于同工酶标记和RAPD标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的另一缺点是多态性低，而RAPD标记的稳定性不好，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏花鲈微卫星标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取微卫星标记以进行花鲈遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种花鲈DNA分子遗传标记技术，即花鲈微卫星标记LJ_liu的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。
本发明的基本构思主要是利用花鲈AFLP条带中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测花鲈每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物(微卫星标记LJ_liu)对花鲈的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从花鲈AFLP产物中获取了一个微卫星标记，命名为LJ_liu，该微卫星标记LJ_liu可用于花鲈遗传多样性分析和系谱认证。
本发明是按照以下操作技术方案完成的首先提取花鲈血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用花鲈AFLP条带中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对花鲈不同地理群或花鲈群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得花鲈的遗传多态性图谱。
提取花鲈基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。
含有微卫星序列的AFLP条带序列为attaatccaa acccagtcca gtcgcccagt gcaaacccag tccaataaaa aatggcctgaaggaagggag agagacacac actcttaaca gaaagagaga gagagttgac gggcccaaacagtataggca gaagaaggac tggctggctg taatgagttg ctgttgttgt tgtgtacgtgtgtgtgtgtg tgtgtctaaa ctagggtttg gggtcgggtt cggatagctg gttccattttggatctggtt ccaggtcact aaaaacacat gaagttcgag gcaaatgatt ctcttatcag其中微卫星核心序列为gttgttgt tgtgtacgtgtgtgtgtgtg tgtgtLJ_liu微卫星引物序列为正链5’GACGGGCCCAAACAGTATAG-3’，负链5’-ATGGAACCAGCTATCCGAAC-3’，使用该引物时的退火温度为53℃。
微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在花鲈遗传多样性检测中呈现多态性。
PCR扩增的加样参数为每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng花鲈基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH2O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为94℃变性5min；94℃45sec，53℃1min，72℃，40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR产物的检测步骤将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色约5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到花鲈微卫星标记LJ_liu的多态性图谱。
因此，本发明的特点是可快捷的获得花鲈的LJ_liu微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出花鲈每个个体的基因型；而应用于不同地理群或花鲈群内花鲈群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
图1是本发明微卫星标记LJ_liu对花鲈20个个体的检测图谱(编号1-20是花鲈的20个个体)。
具体实施例方式
下面通过实施例详细叙述本发明在花鲈LJ_liu微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取花鲈血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用花鲈AFLP条带中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对花鲈不同地理群或花鲈群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得花鲈的遗传多态性图谱。
1、花鲈基因组DNA的提取将100μl花鲈血液加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液500μl和20mg/ml的蛋白酶K 5μl，轻轻摇匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600μl酚氯∶仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液，晃动20min后12000rpm离心10min，取上清液。再加入酚∶氯仿∶异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE缓冲液溶解DNA，4℃保存。
2、含有微卫星序列的AFLP条带筛选花鲈DNA经AFLP扩增后，扩增产物上样6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，然后利用微卫星探针杂交筛选含有微卫星序列的AFLP条带。
3、AFLP条带回收用锋利的刀片切下含有微卫星序列的目的AFLP条带，放入盛有20μl TE和ACNa(3mol/L)(体积比为5∶1)混合液的1.5ml Eppendof管里，在40～50℃水浴中放置2～3h，12000g离心12min，取上清液3～4μl作模板进行二次PCR扩增，反应体系同原选择性扩增反应体系一致。上样再扩增产物200～300μl，以1％琼脂糖电泳分离目的AFLP条带，然后利用QIAquick回收试剂盒回收该条带。
4、微卫星引物的设计回收的片段测序后，找出微卫星序列。再利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为正链5’GACGGGCCCAAACAGTATAG-3’，负链5’-ATGGAACCAGCTATCCGAAC-3’，使用该引物时的退火温度为53℃。
5、PCR扩增首先加样，加样量如下花鲈基因组DNA(100ng/L)，1μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+(25mmol/L)，1.5μl；Taq酶(5u/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo/L)，1μl；引物(各10pmol/μl)，1μl；加灭菌水至25μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为94℃变性5min；94℃45sec，53℃lmin，72℃，40sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
6、PCR产物的检测将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，3％的碳酸钠溶液显色约5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5mi即可得到花鲈在LJ_liu微卫星核心序列的多态性图谱，如图1所示。
权利要求
1.一种花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法，其特征在于首先提取花鲈血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用花鲈AFLP条带中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对花鲈不同地理群或花鲈群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得花鲈的遗传多态性图谱。
2.如权利要求1所述的花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法，其特征在于上述提取的花鲈基因组DNA稀释为100ng/μl。
3.如权利要求1所述的花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法，其特征在于微卫星核心序列两端设计的特异性引物序列分别为正链5’GACGGGCCCAAACAGTATAG-3’，负链5’-ATGGAACCAGCTATCCGAAC-3’，用该引物时的退火温度为53℃。
4.如权利要求1所述的花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法，其特征在于对花鲈不同地理群或花鲈群内个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其加样参数为每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng花鲈基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L 上述特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为94℃变性5min；94℃ 45sec，53℃ 1min，72℃，40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
5.如权利要求1所述的花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法，其特征在于对PCR产物进行检测的步骤将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离，以10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到花鲈在LJ_liu微卫星核心序列的多态性图谱。
6.花鲈微卫星标记LJ_liu应用于花鲈群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建。
全文摘要
一种花鲈微卫星标记LJ_liu的检测方法。首先提取花鲈血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用花鲈AFLP条带中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对花鲈不同地理群或花鲈群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得花鲈的遗传多态性图谱。本发明的特点是可快捷的获得花鲈遗传标记LJ_liu的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出花鲈每个个体的基因型；应用于不同地理群或花鲈群内花鲈群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
文档编号C12Q1/68GK1880477SQ200610044020
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月1日 优先权日2006年5月1日
发明者刘云国, 李八方 申请人:中国海洋大学