一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌及其在双液相反应中的应用的制作方法

文档序号:441712阅读:255来源:国知局
专利名称:一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌及其在双液相反应中的应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一株恶臭假单胞菌及其应用,尤其涉及一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用。
背景技术
生物催化是新一代工业生物技术的主体,它是指在人为控制条件下于生物反应器中利用生物催化剂实现特定生物转化的过程。这里所说的生物催化剂包括酶、酶的复合体、细胞器、完整细胞,后者可以是生长细胞、静息细胞或死亡细胞。与一般的化学催化相比,生物催化过程具有催化效率高、专一性强、反应条件温和、对环境友好等特点。生物催化一般在水中进行,但是水并不是反应理想介质,因为在反应中许多底物或产物是水不溶性,如固醇类、脂类物质,这会造成水相中底物或产物的浓度太低,从而由于底物浓度低和反馈抑制造成反应速度和产率低下,还有些底物或产物在水中易分解,对这种底物或产物而言,在水相中反应会有很多副反应,甚至得不到到预期的产物。
双液相反应体系是指由两种互不相容的液体构成的反应体系,如有机溶剂和水或者有机溶剂和有机溶剂,本发明涉及的双液相反应体系是指有机溶剂和水构成的双液相反应体系。根据相似相容的原理,上述的水不溶的底物和产物在有机溶剂中一般具有较高的溶解能力和较好的稳定性,因而,对它们而言,在水相中加入合适的有机相构成双液相反应体系,可以提高反应的速率和反应的效率,减少产物(底物)的抑制,便于产物的分离纯化。而且,绝大多有机溶剂是有毒的,很多有机溶剂是杀菌剂,如酒精,甲醛等,用含有有机溶剂的双液相体系作为反应的介质能避免微生物污染。但是,有机溶剂的生物毒性也给双液相生物催化带来了困难,它们会抑制微生物的能量代谢,和生理活动,甚至使之裂解丧失生物学功能,从而破坏其生物催化活性或使之失活。
自1989年Inoue等人发现有机溶剂耐受微生物以来,陆续有一些有机溶剂耐受微生物从溶剂污染的土壤或海底污泥等极端环境种分离出来,它们由于具有独特的细胞结构和独特生理生化特性,而能够在有机溶剂存在条件下,有的甚至可以在高浓度的有机溶剂存在时,保持代谢活力和细胞完整性,甚至生长能力。这种微生物在生物催化中的应用前景是显而易见的,它们在非水相和双液相生物转化中具有其他微生物无可比拟的优势。它们的应用可以解决油水双液相反应体系和非水相反应体系中生物催化剂的活性保持问题。对那些需要辅酶再生或者能量再生的体系而言,它们不仅可以使催化剂活性得以保持,由于保持了微生物细胞的能量代谢和生理代谢功能,还可以使辅酶再生和能量再生变得简单易行。
从环境中直接分离到既能耐受有机溶剂又具有特定生理功能的微生物并非易事,而且,从环境中分离到的有机溶剂耐受的微生物还会具有一些不利于生物催化的特点,比如产生一些副产物等。因此对现有的各种微生物资源的特性进行组合就变成了一种比较理性的选择,比如可以利用基因工程的手段把特定的生物催化功能赋予溶剂耐受的微生物,使之同时具有溶剂耐受的特性和特定的生物催化功能。
二苯并噻吩、苯并噻吩及它们的衍生物是重要的环境污染源,是重油、减压馏分油及渣油中的主要硫化物。它们,尤其是4-甲基二苯并噻吩(4-MDBT)和4,6-二甲基二苯并噻吩(4,6-DMDBT)等,热稳定性较高,是油品中最难脱除的硫化物。它们在燃油中存在,会随着燃油的燃烧而氧化,产生大量的二氧化硫等毒性气体,由此转化成的大面积酸雨严重污染大气和水源,破坏生态平衡,危害人类生存。硫化物的存在还会对炼油储油设备造成腐蚀,造成巨大的经济损失。二苯并噻吩及其衍生物,释放到环境中以后,不易被降解,又具有生物毒性,会对水体,土壤造成污染,破坏生态环境。
现在已经发现许多微生物,如红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)和节杆菌属(Arthrobacter)等,能够沿着硫专一途径降解DBT,即能够把二苯并噻吩中的硫原子专一性的脱除,且不破坏二苯并噻吩原有的碳架结构。硫专一性脱硫途径主要由基因簇dszABC编码,它编码三个酶,分别为DszA、DszB、DszC。另外,还有一个黄速还原酶基因DszD也与专一性脱硫有关,它为反应提供必须的还原力,过表达该酶可提高脱硫的活力。
把这种专一性脱硫微生物应用于脱除二苯并噻吩、苯并噻吩及它们的衍生物,相比与物理、化学法,具有操作压力、温度低,运转成本少,且不不破坏二苯并噻吩、苯并噻吩及它们的衍生物碳架有利于降解产物的回收利用,具广阔的应用前景。但是,由于二苯并噻吩、苯并噻吩及它们的衍生物是水不溶的,一般要在双液相体系中进行反应,因而存在和双液相反应一样的保持生物催化剂活力困难的问题,而且,在双液相体系中,为保持催化剂活力需要加入大量的水,这样会增大处理体积,不利于产品的回收,从而使成本大幅度提高。
同非水相和双液相生物催化反应一样,利用基因工程方法改造菌株获得能耐受高油水比又有生物脱硫能力的菌株是解决这一问题的明智手段。

发明内容
针对现有技术的不足本发明要解决的问题是,提供一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌,以及利用可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌进行双液相反应,以实现在多种有机溶剂存在时降解有机硫化合物。
本发明提供了一株可耐受有机溶剂,又能通过硫专一性途径降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的菌株,该菌命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4。该菌株于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学,中国武汉),保藏中心编号为CCTCC No.M206011。
上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011具有如下生物学特性革兰氏阴性杆菌,有极端鞭毛,有动力,无芽孢,无荚膜;在血琼脂瓶板上形成大而湿润、灰色的菌落;在麦康凯琼脂平板上呈无色较大、湿润的菌落;在营养琼脂平板上菌落呈黄绿色;氧化酶试验阳性;分解葡萄糖、果糖、木糖,不分解蔗糖,葡萄糖O/F为氧化型;动力试验、精氨酸双水解酶试验阳性,鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阴性,不能液化明胶,42℃环境中不生长,生长后期阶段培养物有恶臭。
上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能降解二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩。
上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能在高毒性有机溶剂对二甲苯中生长,并能在庚醇、苯乙烯、对二甲苯、乙苯、环己烷、间二氯苯、二苯醚、异辛烷和正十二烷存在时保持降解能力。
上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的培养温度为20~35℃,可在含有氨苄青霉素的LB和M187中生长,也可以M9培养基中以二苯并噻吩作为唯一硫源生长。
本发明所涉及的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在双液相生物催化反应中的应用方法和步骤如下(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有0.5~1.5g/L氨苄青霉素的LB中,置20~35℃下,振荡培养8~30小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有0.5~1.5g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积百分比为0.05~0.2%的对二甲苯,置于20~35℃下,振荡培养8~30小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10~20分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2~3次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到5~15克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶5~20,加入50~300mg/L含硫化合物,在20~35℃条件下,180转/分钟振荡反应,4~42小时,进行样品处理;
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心5~20分钟,取1~5μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率。
其中,步骤(2)(3)中所述的种子细胞培养和制备催化剂细胞的优选温度是27~32℃;氨苄青霉素的浓度优选为0.8~1.3克/升。
其中,步骤(2)中所述的种子细胞培养时间优选是15~25小时。
其中,步骤(3)中所述的制备催化剂细胞中,培养时间优选是10~15小时。
其中,步骤(3)中所述的制备催化剂细胞中,培养时添加对二甲苯的浓度优选为体积百分比0.08~0.12%。
其中,步骤(5)中所述的菌体浓度优选是每升6~10克干细胞重的菌体。
其中,步骤(6)中所述有机溶剂相与水相的体积比优选为1∶7~15。
其中,步骤(6)中所述处理样品的温度优选为27~32℃,样品振荡时间优选为5~15小时。
其中,步骤(6)中所述的有机溶剂是指庚醇、苯乙烯、对二甲苯、乙苯、环己烷、间二氯苯、二苯醚、异辛烷和正十二烷之一;步骤(6)中所述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
上述固体M187培养基在上述M187培养基配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的双液相反应过程中使用的M9培养基配方为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
本发明所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011是用基因工程的方法构建的。先从红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCCNo.M205068中克隆出专一性脱硫基因dszABCD然后把它们连接到宽宿主范围载体pMMB66EH上,构建出重组载体pMMABCD(如图1所示);然后用三亲杂交把重组载体导入宿主菌中(如图2所示),经过筛选得到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011。
本发明所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011可以通过硫专一性途径降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩,生成不破坏原含硫化合物碳架结构的化合物2-羟基联苯、2-羟基-3-甲基联苯(2-羟基-3’-甲基联苯)、2-羟基-3,3’-二甲基联苯、2-异丙基苯酚。附图3是3-甲基苯并噻吩经过恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011降解之后得到产物的质谱图。
本发明采用的菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能够在50%以下的对二甲苯中生长,能在10%以下的对二甲苯中生长良好。该菌株在含10%的对二甲苯的LB中生长21.5小时,生物量可达1.8克干细胞/升(如图4所示),这说明该菌具有耐受对二甲苯的能力。对二甲苯的毒性很强,微量对二甲苯就能够抑制微生物生长,它广泛的分布于各种污染环境中,燃油中也含有二甲苯,恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的耐受对二甲苯的能力,为该菌株在双液相反应以及环境修复中应用提供了前提。
本发明使用的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能够在高浓度二甲苯存在时降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩,其降解二苯并噻吩的降解率可达99%,而在相同条件下其对照菌红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068几乎不能降解任何上述含硫化合物(如图5所示),这表明恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCCNo.M206011在双液相反应中比未经过改造的红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M20506有着巨大的优势,有着重要的应有价值。
本发明所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能耐受多种有机溶剂,能在多种有机溶剂存在时降解有机硫化合物,比如能在多种有毒的有机溶剂存在时降解二苯并噻吩(如图6所示),其中许多有机溶剂存在时降解率都可以达到90%以上,如庚醇、二甲苯、乙基苯、环己烷、异辛烷和十二烷。在双液相反应中溶剂的种类要根据反应类型,产物底物的性质等因素来确定,往往要用到多种有机溶剂;石油和被污染的环境中含有的有机物更是纷繁复杂不尽其数,该菌株的这种对多种有机溶剂广泛耐受的特性,在双液相生物催化反应以及环境治理过程中,都将具有重要的意义。


本发明提供的一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4,已于2006年1月15日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心,保藏地址湖北省武汉市武汉大学,邮政编码430072,其保藏编号为CCTCC No.M206011。
图1重组载体pMMABCD的构建过程图;其中,基因操作使用普通大肠杆菌HB101进行;(PCR)聚合酶链式反应,(Ptac)乳糖启动子,(SD)核糖体结合位点,(ori)复制起始区,(bla)氨苄青霉素抗性基因。
图2重组质粒导入受体菌的流程图。
图3使用气相-质谱联用技术(GC-MS)分析恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011降解3-甲基苯并噻吩的代谢产物得到的质谱图。
图4恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在含有10%对二甲苯中生长曲线;(■)600nm时的光密度(OD值);(□)细胞干重。
图5恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011和红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068在二甲苯中对二苯并噻吩的降解曲线;(■)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011,(○)红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068。
图6恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在庚醇、苯乙烯、对二甲苯、乙苯、环己烷、间二氯苯、二苯醚、异辛烷和正十二烷中对二苯并噻吩的降解,从左到右有机溶剂的极性依次降低。
具体实施例方式
实施例1恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的构建。
根据文献报道的Rhodococcus erythropolis IGTS8的专一脱硫基因,设计引物dszf5’CACTCTAGAAGGACGCATACGCG ATGACTC-3’(下划线部分为限制性内切酶XbaI的酶切位点)和dszr 5’-GATCAAAGCTTCA GATCCTCAGGAGGTGAA-3’(下划线部分为限制性内切酶HindIII的酶切位点)。用这两个引物以常规方法提取的红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068的基因组DNA为模板使用常规聚合酶链式反应的方法(PCR)扩增专一性脱硫基因dszABC。扩增后的基因连接到pMD18-T载体(大连宝生物工程公司生产的TA克隆载体)上,常规方法测序验证克隆的正确性。
根据文献报道的Rhodococcus erythropolis IGTS8的黄素还原酶基因序列设计引物dszDf5’-GAGGAATTCATGTCTGACAAGCCG AATGCC-3’(下划线部分为限制性内切酶EcoRI的酶切位点)和dszDr 5’-CACTCTAGACTATTGACCTAACGGAGTCGG-3’(下划线部分为限制性内切酶XbaI的酶切位点)。用这两条引物以常规方法提取的红平红球菌(Rhocooocous erythropolis)XP CCTCC No.M205068的基因组DNA为模板用常规聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增dszD片段,连接到pMD18-T载体(大连宝生物工程公司生产的TA克隆载体)上,常规方法测序验证克隆正确性。
用限制性内切酶把dszD(EcoRI和XbaI)和dszABCD(XbaI和Hind III)从上述构建的pMD18-T上切下来回收纯化,用EcoRI和Hind III处理载体pMMB66EH(柏林自由大学),回收纯化。把上述处理好的基因片段和载体用T4 DNA连接酶连接起来构成重组载体pMMABCD(如图1所示),使用该重组载体转化E.coli HB101得到转化子命名为E.coli HB101/pMMABCD,用作供体菌。
无菌条件下把供体菌E.coli HB101/pMMABCD和辅助菌E.coli HB101/pRK2013(哥伦比亚大学微生物系),接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养12小时,然后以4%接种量,转接到新的无抗生素LB培养基中,37℃振荡培养4小时。受体菌Pseudomonas putida Idaho(NRRL B-18435)。与供体菌和辅助菌同时接入无抗生素LB中,30℃振荡培养16小时,以上三株菌培养好后,收集三种无抗生素LB中的培养物,置于离心管中,8,000转/分钟离心5分钟,弃上清,菌体用无菌生理盐水重悬至原体积,再8,000转/分钟离心,重复两次,最后用无灭菌生理盐水重悬菌体至原来的体积,制成菌悬液。分别取上述供体菌悬液、辅助菌悬液、受体菌悬液400uL、400uL、2mL,混合起来,制成混合菌液,用无菌0.45um滤膜,过滤混合菌液,截留细菌,然后把滤膜平贴在无抗生素固体LB平板上,使滤膜无菌的平贴在固体LB平板中的培养基上,37℃培养箱培养10小时,再转移到30℃培养箱培养10小时。培养完成后用无菌的镊子取下滤膜,置于1mL无菌生理盐水中,洗下菌体,用无菌涂布器把菌液均匀涂在含100mg/L氨苄青霉素的M9平板上30℃培养3~4天(流程见附图2),直至长出大小合适的菌落。
上述实验过程使用的受体菌Pseudomonas putida Idaho(NRRLB-18435)和辅助菌没有氨苄青霉素耐受能力,不能在含有氨苄青霉素的平板上生长,即在含有氨苄青霉素的M9平板上受体菌不能生长,供体菌是大肠杆菌不能耐受柠檬酸盐,在M9培养基中含有0.5%的柠檬酸盐,因而供体菌也不能生长,另外氨苄青霉素还能抑制许多环境中常见的细菌在培养基中生长。基于这两点,对所得培养物用含氨苄青霉素和柠檬酸盐的M9培养基进行筛选和纯化,经过几轮筛选得到一些转化子。
在无菌条件下把上述转化子分别接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中,30℃振荡培养12小时后,提取各转化子的质粒DNA,琼脂糖电泳检测,挑选有重组载体pMMABCD存在的转化子进一步实验。
在无菌条件下把上述含有质粒的转化子分别接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中,加入1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),30℃振荡培养12小时后,8,000转/分钟离心5分钟,用M9培养基洗菌体两次,再用同样体积的M9重悬菌体,加入92mg/L的二苯并噻吩,30℃振荡12小时后,用Gibbs法测定各转化子的反应体系中是否有2-羟基联苯生成。经测定命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4的转化子含有质粒pMMABCD且能转化二苯并噻吩为2-羟基联苯。
上述构建的菌株命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4,已于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学,中国武汉),保藏中心编号为CCTCC No.M206011。
在上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的双液构建过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5gK2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011构建的过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25g NaCl,0.5g NH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例2恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的16S rDNA的扩增和测序。
使用LB培养基培养5ml的细菌培养物至饱和状态,取1.5ml培养物,6,000转/每分钟离心2分钟;沉淀物加入565μl的TE缓冲液,TE缓冲液配方如下10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0,用吸管反复吹打使之重悬,加入30μl质量体积比为10%的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1小时;加入100μl,5mol/L NaCl,充分混匀,再加入80μl的CTAB/NaCl溶液,所述CTAB/NaCl溶液配方如下质量体积比为10%的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中,混匀,于65℃温育10分钟;加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,12,000转/每分钟离心5分钟,将上清液转入一个新管中;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,12,000转/每分钟离心5分钟,将上清转入一支新管中;加入0.6倍体积异丙醇,轻轻混匀直到DNA沉淀下来,用一个封口的离心管将沉淀转移至1ml的70%乙醇中洗涤;12,000转/每分钟离心5分钟,弃上清,用冻干机稍加干燥,重溶于50μl的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板,利用购自上海博亚生物技术有限公司的真细菌引物27f和1492r,进行PCR扩增,在50μl反应体系依次混匀下列试剂35μl H2O,5μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液,10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2,4μl 25mmol/L MgCl2,1μl 4种dNTP的混合物,0.5μl上游引物,0.5μl下游引物,0.5μl模板DNA即上述恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)CCTCC M206011的基因组DNA,0.5μl Taq DNA聚合酶,混匀后离心5秒钟。加入50μl矿物油再离心5秒钟;将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟,50℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,总共30个循环。最后一个循环后,于72℃下保温10分钟,使反应混合物扩增充分,得到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCCM206011的16S rDNA的PCR扩增产物,将产物测序。
测序结果恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M206011菌株16S rDNA基因序列长度为522bp,核苷酸序列如下caccgtggta accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggtgcaa cccactccca 60tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgaca ttctgattcg 120cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat 180cggttttgtg agattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctctgtaccg accattgtag 240cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc 300ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccataac gtgctggtaa ctaaggacaa 360gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 420gcagcacctg tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg 480tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tccgaattaa aa 522上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例3恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在水相中对含硫化合物的降解。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10~20分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到10克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)处理样品取30mL(5)中制备的休止细胞悬液,置于4个300mL摇瓶中,分别加入0.5mM的二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩,30℃振荡反应12小时,进行样品处理。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,在分别加入5mL乙酸乙酯,置于30℃振荡30分钟,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪分别检测样品中二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的残留含量,使用气相-质谱联用分别检测上述四种化合物的代谢产物,得出恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011可以通过硫专一性途径降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩,生成不破坏原含硫化合物碳架结构的化合物,分别为2-羟基联苯、2-羟基-3-甲基联苯(或2-羟基-3’-甲基联苯)、2-羟基-3,3’-二甲基联苯、2-异丙基苯酚,降解率分别为97%、80%、71%和53%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水相含硫化合物降解过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5mL金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水相含硫化合物降解过程中使用的M9培养基培养为每800mL水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例4利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应,反应温度20℃,反应时间4小时,细胞浓度5克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶5。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到5克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶5,加入92mg/L含硫化合物,在20℃条件下,180转/分钟振荡反应,4小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为32%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例5利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应,反应温度27℃,反应时间10小时,细胞浓度6克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶7。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到6克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶7,加入92mg/L含硫化合物,在27℃条件下,180转/分钟振荡反应,10小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为78%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5g NH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例6利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应,反应温度30℃,反应时间10小时,细胞浓度8克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶9。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到8克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶9,加入92mg/L含硫化合物,在30℃条件下,180转/分钟振荡反应,10小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为95%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例7利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应,反应温度32℃,反应时间10小时,细胞浓度10克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶15。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到10克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶15,加入192mg/L含硫化合物,在32℃条件下,180转/分钟振荡反应,10小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为83%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例8利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应,反应温度35℃,反应时间30小时,细胞浓度15克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶20。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到15克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶20,加入112mg/L含硫化合物,在35℃条件下,180转/分钟振荡反应,30小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为41%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例9利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-庚醇双液相反应,反应温度30℃,反应时间10小时,细胞浓度8克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶9。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到8克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶9,加入152mg/L含硫化合物,在30℃条件下,180转/分钟振荡反应,10小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为97%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例10利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-十二烷双液相反应,反应温度30℃,反应时间10小时,细胞浓度8克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶9。
(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有1g/L氨苄青霉素的LB中,置30℃下,振荡培养20小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有1g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积比为0.05%的对二甲苯,置于30℃下,振荡培养12小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到8克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶9,加入92mg/L含硫化合物,在30℃条件下,180转/分钟振荡反应,10小时,进行样品处理;上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心10分钟,取1μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率为98%。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M187培养基配方为每升中加入10g酵母粉,10g蛋白胨,5g K2HPO4,10ml甘油,121℃湿热灭菌20分钟后,加入5ml金属离子混合液,固体M187培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.5%的琼脂。
上述金属离子混合液配方为0.4g FeSO4,0.2g NaCl,0.4g MgSO4·7H2O,0.2gMnSO4·4H2O,溶于1L蒸馏水,用硫酸调pH至3.0以下,然后0.22um滤膜过滤除菌。
在上述利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011进行的水-对二甲苯双液相反应过程中使用的M9培养基培养为每800ml水中加入,0.5g柠檬酸三钠121℃灭菌20分钟,待培养基冷却至50℃以下,加入200ml 5×M9盐溶液,固体M9培养基在上述配方基础上,加入1.5%琼脂。
上述5×M9盐溶液配方每100ml水中加入,8.5g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,0.25gNaCl,0.5g NH4Cl,121℃灭菌20分钟。
上述LB培养基配方如下,1升蒸馏水中含10克蛋白胨,5克酵母粉,10克NaCl,用4N的氢氧化钠调节pH值到7.5±0.2,固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6%的琼脂粉,121℃条件下灭菌20分钟。
实施例11利用红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068进行的水-对二甲苯双液相反应,反应温度30℃,反应时间10小时,菌体浓度8克干细胞/升,对二甲苯与水相体积比为1∶9。
(1)菌株选择选用红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068;(2)细菌细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下,取斜面上的菌苔,用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.005%的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中,30℃条件下,振荡培养40小时,制得种子液。然后以10%的体积比的接种量,将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.005%的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中,30℃条件下,振荡培养42小时。
(3)休止细胞制备取步骤(2)所得的培养物5,000转/每分钟离心15分钟,收集沉淀细胞,使用pH 7.0磷酸缓冲液重悬细胞,再以相同的条件离心,重复2次,收集沉淀细胞。收集的细胞用磷酸缓冲液重悬,使菌体浓度达到8克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液,也称生物催化剂。
(4)双液相反应在20ml反应体系中,以(3)中制备的休止细胞悬液为水相,二甲苯为有机相,使有机相比例达到10%,加入92mg/L的二苯并噻吩,在30℃条件下,180转/分钟,分别振荡反应42小时,每隔2小时取下一瓶,进行样品处理。
(5)样品检测以12,000转/分钟的速度,离心(4)中处理的样品10分钟,取1μl使用装有火焰离子监测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩的残留含量,得出降解率为0。
在上述红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068培养中使用的液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium,BSM),配方为甘油4克/升,KH2PO42.44克/升,Na2HPO414.04克/升,NH4Cl 2克/升,质量百分比为1%的CaCl2100微升/升,质量百分比为10%的MgCl2·6H2O 2毫升/升,质量百分比为1%的FeCl3100微升/升,维生素混合液200毫升/升的,离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.01%的DBT作为硫源。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.6%的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl2·4H2O0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为,每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
通过实施例6跟试试例11的比较,可以看到,恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能在1∶9的对二甲苯-水双液相反应体系中降解二苯并噻吩,降解率达95%,而在同等条件下红平红球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCCNo.M205068不能降解二苯并噻吩,说明上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4CCTCC No.M206011具有更好特性,在双液相反应中比红平红球菌(Rhocococcuserythropolis)XP CCTCC No.M205068有更高的应用价值。
序列表SEQ ID NO.1<110>山东大学<120>一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌及其在双液相反应中的应用<141>2006-2-21<211>512<212>DNA<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)<221>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011 16S rDNA<222>(1)…(522)<400>
caccgtggta accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggtgcaa cccactccca 60tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgaca ttctgattcg 120cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat 180cggttttgtg agattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctctgtaccg accattgtag 240cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc 300ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccataac gtgctggtaa ctaaggacaa 360gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 420gcagcacctg tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg 480tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tccgaattaa aa 52权利要求
1.一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌,其特征在于该菌命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4,已于2006年1月15日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心,其保藏编号为CCTCC NO.M206011。
2.如权利要求1所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌,其特征是,该菌为革兰氏阴性杆菌,有极端鞭毛,有动力,无芽孢,无荚膜;在血琼脂平板上形成大而湿润、灰色的菌落;在麦康凯琼脂平板上呈无色较大、湿润的菌落;在营养琼脂平板上菌落呈黄绿色;氧化酶试验阳性;分解葡萄糖、果糖、木糖,不分解蔗糖,葡萄糖O/F为氧化型;动力试验、精氨酸双水解酶试验阳性,鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阴性,不能液化明胶,42℃环境中不生长,生长后期阶段培养物有恶臭;所述恶臭假单胞菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
3.权利要求1或2所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用。
4.如权利要求3所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其应用方法涉及的步骤顺序如下(1)菌株选择选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011;(2)种子细胞培养用步骤(1)的菌株,在无菌条件下接种到含有0.5~1.5g/L氨苄青霉素的LB中,置20~35℃下,振荡培养8~30小时;(3)制备催化剂细胞以步骤(2)所得的培养物为种子,在无菌条件下转接到含有0.5~1.5g/L氨苄青霉素的M187培养基中,加入体积百分比为0.05~0.2%的对二甲苯,置于20~35℃下,振荡培养8~30小时,得到催化剂细胞培养物;(4)收集催化剂细胞取步骤(3)所得的催化剂细胞培养物,4,000转/分钟离心10~20分钟,收集催化剂细胞,用M9培养基重悬细胞,再以相同条件离心,重复2~3次,收集沉淀细胞;(5)休止细胞制备用M9培养基把步骤(4)收集的沉淀细胞重悬,使菌体浓度达到5~15克干细胞/升,此细胞悬浊液即为制备好的恶臭假单胞菌的悬浊液,也称为生物催化剂;(6)在双液相反应中处理样品在反应体系中,以(5)中制备的休止细胞悬浊液为水相,以有机溶剂为有机相,使有机相与水相体积比是1∶5~20,加入50~300mg/L含硫化合物,在20~35℃条件下,180转/分钟振荡反应,4~42小时,进行样品处理;(7)样品检测(6)中处理的样品先用6N的盐酸酸化到pH值小于2.0,再以12,000转/分钟的速度,离心5~20分钟,取1~5μL上层有机相,使用装有火焰离子检测器的气相色谱仪检测样品中二苯并噻吩,或4-甲基二苯并噻吩,或4,6-二甲基二苯并噻吩,或3-甲基苯并噻吩的残留含量,得出降解率。
5.如权利要求4所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其特征在于,步骤(3)中所述的菌体培养温度是27~32℃;培养时间是10~15小时。
6.如权利要求4所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其特征在于,步骤(3)中所述的对二甲苯体积百分比为0.08~0.12%。
7.如权利要求4所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其特征在于,步骤(5)生物催化剂的菌体浓度是6~10克干细胞/升。
8.如权利要求4所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其特征在于,步骤(6)中所述的有机相与水相的体积比为1∶7~15。
9.如权利要求4所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其特征在于,步骤(6)中处理样品的温度为27~32℃,样品振荡时间为5~15小时。
10.如权利要求4所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其特征在于,步骤(6)中所述的有机溶剂是指庚醇、苯乙烯、对二甲苯、乙苯、环己烷、间二氯苯、二苯醚、异辛烷和正十二烷之一;步骤(6)中所述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
全文摘要
本发明公开了一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),该菌株于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学,中国武汉),保藏中心编号为No.M206011。本发明还公开了所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用,其方法包括(1)菌株选择,(2)种子细胞培养,(3)制备催化剂细胞,(4)收集催化剂细胞,(5)休止细胞制备,(6)在双液相反应中处理样品,(7)样品检测;该菌株具有很强的耐受有机溶剂的能力,且具有较高的降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的能力,在双液相反应方面有十分重要的应用价值。
文档编号C12R1/40GK1861785SQ200610044410
公开日2006年11月15日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者许平, 陶飞, 于波, 马翠卿, 冯进辉, 李福利, 王颖, 蔡晓凤, 周文娟, 曲径遥 申请人:山东大学
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