专利名称：青蟹的种质检测和鉴定方法
技术领域：
本发明涉及海洋经济水产蟹类检验技术的改进，具体讲是一种青蟹的种质检测和鉴定方法，其属于中国沿海青蟹的种质检测和鉴定技术领域。
背景技术：
青蟹属(Scylla)蟹类属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，广泛分布于太平洋、印度洋的温带、亚热带和热带海区的红树林地区及河口区，是亚洲许多发展中国家沿海渔业的重要组成部分。青蟹在我国长江以南沿海均产，尤以广东、广西、海南、福建为多，是我国重要的海洋经济蟹类之一。近年来，国内许多科研工作者致力于青蟹的人工苗种培育及养殖。最初，青蟹属被认为仅有S.serrata一种。自1949年Estampador提出该属应分成两大类群、3种1亚种之后[5]，许多国外学者对锯缘青蟹属种间亲缘关系进行了形态学、生态学、遗传学研究[6-16]。但是关于青蟹的种间的系统发育关系还没有详尽的工作开展，基于不同的基因标记得到的结果也不尽相同。青蟹的种间系统发育关系尚未得到详细阐明。尤其我国青蟹的分类地位一直没有得到澄清，虽然Keena认为分布于我国厦门的的青蟹与分布于香港水域的青蟹应该都属于S.paramamosai，但是这一观点并没有得到国内学者的广泛认同。国内有关青蟹的研究基本还是沿用以前的学名S.serrata。国内关于青蟹mtDNA研究的报道极少。
目前，青蟹养殖业尚处于初期阶段，青蟹资源现状严峻。因此，研究和保护青蟹种质的检测和鉴定技术，对保护我国青蟹养殖业的持续、稳定的发展十分迫切。本领域迫切要开发尽可有效、准确地鉴别青蟹的种质检测和鉴定技术，尤其是有效、准确鉴定青蟹的系统发育关系及中国沿海青蟹的分类地位。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效、准确地青蟹的种质检测和鉴定方法。本发明对青蟹属几种青蟹以及中国温州、厦门、海南等近海的青蟹样品进行了12S rRNA基因序列测定，并与Genbank库中其他蟹类的同源序列进行比较分析，为解决青蟹属物种间系统发育关系、澄清中国青蟹的分类地位提供分子依据。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种青蟹的种质检测和鉴定方法，其包括如下步骤(1)提取青蟹样品的DNA；(2)以(1)步的DNA为模板，采用一对引物对其线粒体DNA 12S rRNA部分片段进行PCR扩增，纯化；(3)利用该PCR扩增产物进行DNA序列测定；(4)对测序所得的青蟹样品的DNA序列结果进行数据分析首先，选定已发表在美国基因数据库(Genbank库)中的相关青蟹的DNA同源序列作为标准对比序列，其次，将所测青蟹样品的DNA序列经校对而得到该样品的同源序列片段，再将得到的同源序列进行如下项目的比较鉴别①单倍型序列长度，
②单倍型的分布情况，③碱基A，T，G，C的组成(％)，④单倍型个体数，⑤种间净遗传距离和种内个体间遗传多样性，⑥采用简约法或邻接法构建系统进化树，从这六个项目的比较鉴别，来确定所测的分类地位未知的青蟹样品的分类地位。
所述的标准对比序列，其是所述的基因数据库(Genbank库)中检索号分别为AY647179、AY647182、AY647183的青蟹S.serrata、S.olivacea、S.paramamosain的12S rRNA的同源序列。
所述的②单倍型的分布情况项目的比较鉴别，是指是否具有共享单倍型，是否具有变异位点。
所述的⑤，⑥项目的比较鉴别，其中的种间净遗传距离，种内个体间遗传多样性和构建的系统进化树的结果，是使用Mega软件运算而得到的。
本发明的优点在于由于对测序所得的青蟹样品的DNA序列结果进行数据分析首先，选定已发表在美国基因数据库(Genbank库)中的相关青蟹的DNA同源序列作为标准对比序列，其次，将所测青蟹样品的DNA序列经校对而得到该样品的同源序列片段，再将得到的同源序列进行如下项目的比较鉴别①单倍型序列长度，②单倍型的分布情况，③碱基A，T，G，C的组成(％)，④单倍型个体数，⑤种间净遗传距离和种内个体间遗传多样性，⑥采用简约法或邻接法构建系统进化树，从这六个项目的比较鉴别，来确定所测的分类地位未知的青蟹样品的分类地位。从而确定了中国沿海青蟹的分类地位；即本发明通过对青蟹样品进行生化遗传分析，采用单倍型序列长度、变异位点、碱基组成、单倍型个体数、净遗传距离和构建系统进化树的方法确定了中国沿海青蟹的分类地位，中国沿海青蟹实际上是S.paramamosain。本发明青蟹的种质检测和鉴定方法是一种有效的分子标记技术。该种质检测方法简便，结果可靠。
图1本发明构建的青蟹邻接关系树图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明；本发明的实验材料本发明的样本中3种蟹类及中国沿海的青蟹样本的采集情况如下S.serrata采自日本的和歌山县纪之川、日本的高知、日本的静冈浜名湖、日本的冲绳及马达加斯加；S.olivacea采自日本的和歌山县纪之川、日本的静冈浜名湖、日本的冲绳及泰国Surat Thani；S.paramamosain采自日本的和歌山县纪之川、日本的高知及越南；中国沿海的青蟹样品(暂时命名为Scylla spp.)采自中国的福建、温州及海南。酒精固定或DNA样品运到中国海洋大学渔业资源实验室后，-20℃以下保存备用。本发明分析中采用Keena分类系统对样品命名。
本发明的青蟹种质检测和鉴定的方法，其包括步骤(1)提取青蟹样品的DNA；取约100mg的青蟹步足肌肉，使用试剂盒(上海生工)提取基因组DNA。提取青蟹样品的基因组DNA具体实施例剪取约100mg的青蟹步足肌肉，加入600ul STE(10mmol/L Tris-Cl，PH8.0；0.1mol/LEDTA，PH8.0；0.5％m/v SDS)稍加碾磨，加蛋白酶K15ul(10mg/ml)，55℃作用5～8h。加入600ul(PH8.0)平衡酚，离心(12000g，4℃，10min)，吸取上清液。加入混合液(苯酚∶氯仿∶异戊醇)(25∶24∶1)500ul，颠倒混匀10min，离心(12000g，4℃，10min)吸取上清液，重复两次。加入氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液450ul，混匀10min，离心(12000g，4℃，10min)，吸取上清液，加入2.5倍体积的纯酒精，并于-20℃存放20分钟左右(4℃存放1小时左右)。离心(12000g，4℃，10min)产生白色沉淀，轻柔倒去酒精，再加入200ul 75％的酒精，缓慢颠倒并洗涤管壁，再离心(12000g，4℃，10min)，去酒精。将乙醇沉淀后的DNA干燥后加入100ul的TE溶解并在4℃冰箱保存备用。
(2)PCR扩增、纯化；以(1)步骤的DNA为模板，用一对引物12S-F 5’-ACA CCT ACT ATgTTA CgA CTT-3’和12S-R 5’-ATA AAC TAg gAT TAg ATA CCC-3’进行PCR扩增。PCR扩增反应条件的确定即PCR反应条件为94℃预变性3min，然后进行40个循环，每个循环包括94℃45s，52℃45s，72℃1min，最后72℃延伸10min。反应体积为25μL，其中10×缓冲液2.5μL，MgCl21.5mmol/L，各种dNTP200μmol/L，Ex Taq酶1.25units，每个引物各0.2mmol/L，模板DNA1μL，加灭菌蒸馏水至25μL。以上反应均用阴性对照来检查是否有DNA污染。
(3)DNA序列测定；扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因片段经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海华舜)纯化回收后，取适量回收产物送生物公司进行测序反应和双向测序，以确保DNA序列的可靠性。
(4)数据分析；用DNASTAR和MEGA 2.1软件进行所测序列和美国基因数据库(Genbank库)中其他蟹类的同源片段序列的编辑、排序、系统发育和遗传学分析[24]。采用Kimura双参数模型计算遗传距离，引用同科的日本蟳、底栖短桨蟹和已发表青蟹同源序列(Genbank库中的检索号分别为AY647177-AY647184)进行比较，采用简约法(MP)或邻接法(NJ)构建系统进化树，对所得的系统树进行自展检验(1000次重复)。
本发明通过对青蟹样品进行生化遗传分析分析过程如下；本发明采集了青蟹属三种青蟹及中国沿海的青蟹样本，测定分析了其线粒体DNA 12S rRNA部分片段，研究了青蟹属三种青蟹的系统发育关系，阐明分布于中国沿海的青蟹的分类地位。由于中国沿海青蟹的分类地位未定，所以实验开始，将中国沿海青蟹暂时以Scylla spp来命名，对测序结果进行分析，经过人工校对后，得到了同源序列片段，对这些片段的分析如下首先，分析比较单倍型序列长度中国沿海青蟹和三种青蟹的同源片段长度存在差异，通过分析可知，中国沿海的青蟹Scylla spp的单倍型序列长度分别为406和407；S.paramamosain的单倍型序列长度分别为406和407；S.serrata的单倍型序列长度为408；S.olivacea的单倍型序列长度分别为403和404。
以上可以看出，中国沿海的青蟹Scylla spp与paramamosain的单倍型序列的长度范围一样；S.serrata与S.olivacea的单倍型序列长度范围与中国沿海的青蟹Scylla spp的相差较大。
其次，比较单倍型的分布情况中国沿海的青蟹Scylla spp与S.paramamosain的具有共享单倍型，(见表1)，分别为，SP1、SP2和SP1、SP3；其中SP1长度为406bp，SP2；SP3长度为407。
再次，分析比较碱基A，T，G，C的组成(％)
从表2中可看出，中国沿海的青蟹Scylla spp与S.paramamosain的单倍型序列碱基组成基本一样(见表2)，SP1的碱基组成(％)A，T，G，C分别为36.7、38.2、10.1和15.0；SP2的碱基组成(％)A，T，G，C分别为36.6、38.3、10.1和15.0；SP3的碱基组成(％)A，T，G，C分别为36.6、38.1、10.1和15.2；其中，SP2和SP3仅仅相差一个碱基。
然而，S.serrata的单倍型为SS1、SS2、SS3，其长度均为408bp，碱基组成分别为36.0、38.0、10.8、15.2；35.8、38.0、11.0、15.2和36.0、38.0、10.8、15.2。
S.Olivacea的单倍型为SO1、SO2、SO3、SO4、SO5，其长度分别为404、404、404、403、403。
SO1的碱基组成分别为35.9、36.1、10.9和17.1；SO2的为35.9、36.1、11.1和16.8；.
SO3的为35.9、35.9、11.4和16.8；SO4碱基组成为36.0、36.2、10.9和16.9；SO5碱基组成为35.7、36.2、11.2和16.9。
在分析的5个S.olivacea个体中共检测到5个单倍型。各个种内单倍型关系很近，单倍型间最多只有三个核苷酸位点差异(见表2)。
在S.paramamosain和S.olivacea两个种内存在插入/缺失。
从这些单倍型的碱基组成来看，种内个体间差异很小，种间差别显著，但中国沿海的青蟹Scylla spp与S.paramamosain之间差异非常小，变异位点结果显示中国沿海的青蟹Scyllaspp与S.paramamosain仅相差一个碱基。
本发明使用Mega软件运算，采用简约法(MP)或邻接法(NJ)两种方法构建系统进化树，对所得的系统树进行自展检验(1000次重复)。结果两种方法得到的系统树一致，所以本发明只给出了邻接法(NJ)构建的系统进化树(见图1)。系统树结果显示青蟹的12S rRNA基因片段长度存在差异，每一种的个体都单独聚为一支，显示具有很高的自展置信值，邻接关系树还显示中国沿海的青蟹Scylla spp(Fujian1-Fujian3，Wenzhou1-Wenzhou3和Hainan1-Hainan3)与S.paramamosain的序列完全聚在一起，并且与S.paramamosain具有共享单倍型(见图1)。S.serrata和S.paramamosain二个种亲缘关系较近，这二个种形成一个单系群并且具有很高的自展置信值。S.olivacea与其他二个种互为单系，与以上二个种的亲缘关系较远。
本发明运用Mega软件计算了种间的净遗传距离(位于对角线以下)和种内个体间的遗传多样性(对角线上的数值)(见表3)，结果显示中国沿海的青蟹(Scylla spp)与S.paramamosain之间的遗传距离为“0”，结合上面的单倍型序列长度差异分析，变异位点分析，碱基组成及单倍型个体数和构建的系统树的分析结果可以确定Scylla spp实际上就是S.paramamosain，它们同是一个种。
总之，本发明采用了单倍型序列长度差异分析、变异位点分析、碱基组成、净遗传距离和种内个体间的遗传多样性的分析手段确定了，中国沿海青蟹Scylla spp就是S.paramamosain，确定了中国沿海青蟹Scylla spp在S.paramamosain的分类地位。
本发明选定的三种青蟹(S.serrata，S.olivacea，S.paramamosain)种内的遗传多样性(0.0003~0.0030)远低于种间的净遗传距离(见表3)，在这三个品种中，S.paramamosain的种内遗传多样性最低，S.olivacea最高，S.serrata(见表3)。S.olivacea与另外二个种之间的净遗传距离(0.0633~0.0696)明显大于其他二个种之间的遗传距离(0.0342~0.0398)大(见表3)。
表1青蟹采样信息及单倍型分布表
表2三个种青蟹和中国沿海青蟹单倍型序列长度，变异位点，碱基组成，单倍型个体数比较表
表2注释；表中圆点“.”表示该处与参考序列相同，段划线“-”表示缺失，数字代表发生变异的位点。
表3青蟹四种间遗传距离(对角线下面的内容)和各个种内遗传多样性(对角线)
本发明把中国沿海的青蟹12S rRNA序列与三种青蟹的12S rRNA序列放在一起比对，然后采用简约法(MP)或邻接法(NJ)两种方法构建系统进化树，系统进化树显示中国沿海的青蟹与S.paramamosain的序列聚在一起，并且与S.paramamosain具有共享单倍型(见图1)。种间净遗传距离和种内遗传多样性进一步表明中国沿海的青蟹为S.paramamosain。以下的分析中采自中国沿海的青蟹用S.paramamosain表示。
本发明在所分析的15个S.paramamosain个体中，共检测到3个单倍型，其中一个为13个个体共享的主体单倍型(SP1)，另外两个单倍型分别只在一个个体中发现(见表2)。所分析的3个S.tranquebarica个体中，共检测到两个单倍型。在7个S.serrata个体中共发现3个单倍型，其中SS1及SS2各为3个个体共享，SS3只在一个个体中发现(见表2)。在分析的5个S.olivacea个体中共检测到5个单倍型。各个种内单倍型关系很近，单倍型间最多只有三个核苷酸位点差异(见表2)。在S.paramamosain和S.olivacea两个种内存在插入/缺失。结果表明四种青蟹的12S rRNA基因片段长度存在差异，每一种的个体都单独聚为一支，并且具有很高的自展置信值，中国沿海的青蟹样品全部与Scylla paramamosain聚为一枝，结果提示分布于中国沿海的青蟹主要是S.paramamosain。S.serrata和S.paramamosain二个种亲缘关系较近，这二个种形成一个单系群并且具有很高的自展置信值。S.olivacea与其他二个种互为单系，与以上二个种的亲缘关系较远。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
1.一种青蟹的种质检测和鉴定方法，其包括如下步骤(1)提取青蟹样品的DNA；(2)以(1)步的DNA为模板，采用一对引物对其线粒体DNA 12S rRNA部分片段进行PCR扩增，纯化；(3)利用该PCR扩增产物进行DNA序列测定；其特征在于对测序所得的青蟹样品的DNA序列结果进行(4)数据分析首先，选定已发表在美国基因数据库Genbank中的相关青蟹的DNA同源序列作为标准对比序列，其次，将所测青蟹样品的DNA序列经校对而得到该样品的同源序列片段，再将得到的同源序列进行如下项目的比较鉴别①单倍型序列长度，②单倍型的分布情况，③碱基A，T，G，C的组成(％)，④单倍型个体数，⑤种间净遗传距离和种内个体间遗传多样性，⑥采用简约法或邻接法构建系统进化树，从这六个项目的比较鉴别，来确定所测的分类地位未知的青蟹样品的分类地位。
2.根据权利要求1所述青蟹的种质检测和鉴定方法，其特征在于所述的标准对比序列，其是所述的基因数据库Genbank中检索号分别为AY647179、AY647182、AY647183的青蟹S.serrata、S.olivacea、S.paramamosain的12S rRNA的同源序列。
3.根据权利要求1所述青蟹的种质检测和鉴定方法，其特征在于所述的②单倍型的分布情况项目的比较鉴别，是指是否具有共享单倍型，是否具有变异位点。
4.根据权利要求1所述青蟹的种质检测和鉴定方法，其特征在于所述的⑤，⑥项目的比较鉴别，其中的种间净遗传距离，种内个体间遗传多样性和构建的系统进化树的结果，是使用Mega软件运算而得到的。
全文摘要
本发明是青蟹的种质检测和鉴定方法，其包括(1)提取青蟹样品的DNA；(2)以(1)步的DNA为模板PCR扩增，纯化；(3)利用该PCR扩增产物进行DNA序列测定；(4)对测序数据分析首先，选定标准对比序列，其次，进行比较鉴别①单倍型序列长度，②单倍型的分布情况，③碱基A，T，G，C的组成(％)，④单倍型个体数，⑤种间净遗传距离和种内个体间遗传多样性，⑥采用简约法或邻接法构建系统进化树，来确定所测的分类地位未知的中国沿海青蟹实际上是S.paramamosain。本发明的检测和鉴定方法是一种有效的分子标记技术，为解决青蟹属物种间系统发育关系、澄清中国青蟹的分类地位提供分子依据，其方法简便，结果可靠。
文档编号C12Q1/68GK1900313SQ20061004454
公开日2007年1月24日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者高天翔, 王玉江, 陈艳翠, 程光平 申请人:中国海洋大学