一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合及应用的制作方法

专利名称：一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合及应用的制作方法
技术领城本发明属生物技术，主要涉及一组基因组合，用于筛选胰腺导管腺癌。
背景技术：
胰腺癌是预后很差的恶性肿瘤。总体的中位生存时间不到6个月。5年生存率只有0.4-5％。外科切除肿瘤可提高生存期，手术切除肿瘤的病人的中位生存时间可达到11-20个月，5年生存率可达到7-25％。但由于胰腺癌病人缺乏早期的临床表现。病人就诊时多已属晚期。
由于胰腺癌切除和活检的手术风险较大，所以胰腺癌临床标本并不容易得到，这就使得大部分胰腺癌病人得不到明确和及时的诊断，从而延误了病人的治疗。因此，如果能从胰腺癌病人的PBMC中找到肿瘤相关的基因，从而达到诊断肿瘤的目的，将很好地指导我们的临床工作。
目前，CA199是最常使用的胰腺癌肿瘤标志物。关于CA199的研究已很多。大多数研究结果认为，CA199的敏感性在80％左右，而特异性在60-70％左右，是目前能得到的最好的胰腺癌肿瘤标志物。CA199升高还可发生在其他消化道恶性肿瘤，如胃癌、结肠癌、胆道系统恶性肿瘤；也可发生在良性病变，如胰腺炎、肝炎和肝硬化等。
目前还没有理想的来自血液的胰腺癌肿瘤标志物，寻找更好的胰腺癌病人血液中的肿瘤标志物，具有很高的临床应用价值。

发明内容
本发明的目的是提供一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合，包括10个基因L48784、X83300、AI620827、AI494291、NM_020970、BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994。
本发明的另一个目的是提供该基因组合在筛选胰腺导管腺癌中的应用。
本发明通过检测人类外周血单个核细胞的这组基因，可以从健康人群中筛选出胰腺癌病人，具体筛选步骤为1.按照Affymetrix基因表达谱芯片操作指南，使用AFFYMETRIXHUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY检测这组基因在5名胰腺癌和5名正常人的外周血单个核细胞(PBMC)中的表达，得到基因表达的信号值；
2.5名胰腺癌病人外周血单个核细胞(PBMC)的平均信号值高于5名正常人的基因被认为是上调表达基因；5名胰腺癌的平均信号值低于5名正常人的基因被认为是下调表达基因；3.取上述10个外周血单个核细胞中基因表达信号值的中位值作为临界值，以判断受测试的PBMC的基因表达是上调还是下调表达；受测试的人的PBMC，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌PBMC中上调或下调的表达趋势相符合，就推测受测试的人为胰腺癌病人；如果在受测试的人的PBMC中，在10个基因中，有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌中上调或下调的表达趋势不符合，就推测受测试的人为正常人。
本发明利用Affymetrix公司的基因表达谱芯片对胰腺癌病人外周血单个核细胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cells)的表达谱和正常人外周血单个核细胞表达谱进行研究，筛选胰腺癌的肿瘤相关基因，为胰腺癌的临床诊断和筛选提供新的途径。在小样本的实验中已证明本实验具有很高的敏感性和特异性。本发明的有益之处为(1)病人的血液是容易得到的样本；(2)本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法；(3)小样本高通量寡核苷酸表达谱芯片已证明这个基因组合具有很高的推测准确性(100％)。
具体实施例方式
本发明通过实施例作进一步的说明。
实施例11.按照Affymetrix基因表达谱芯片操作指南，使用AFFYMETRIXHUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY检测这组基因在5名胰腺癌和5名正常人的PBMC中的表达，得到基因表达的信号值，(参见表1)。
表1


样本分组情况胰腺癌组T1，T2，T3，T4，T5；正常人组N1，N2，N3，N4，N5，Public ID基因的公共号，T均数肿瘤样本信号值的平均值，N均数正常对照样本信号值的平均值，差2＝T均数-N均数，差2＞0表明基因在胰腺癌PBMC中上调表达，差2＜0说明基因在胰腺癌PBMC中下调表达。
符合判定标准取上述10个外周血单个核细胞中基因表达信号值的中位值作为临界值，以判断受测试的PBMC的基因表达是上调还是下调表达；受测试的人的PBMC，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌PBMC中上调或下调的表达趋势相符合，就推测受测试的人为胰腺癌病人；如果在受测试的人的PBMC中，在10个基因中，有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌中上调或下调的表达趋势不符合，就推测受测试的人为正常人。
2.5名胰腺癌的平均信号值高于5名正常人的基因被认为是上调表达基因；5名胰腺癌的平均信号值低于5名正常人的基因被认为是下调表达基因。根据上表可以看出L48784、X83300、AI620827、AI49429、NM_020970是下调表达基因；而BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994是上调表达基因。
3.取上述10个PBMC中基因表达量检测结果的中位值作为临界值，以判断受测试的PBMC的基因表达是上调还是下调表达；4.按照Affymetrix基因表达谱芯片操作指南，使用AFFYMETRIXHUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY检测这组基因在受测试的人的PBMC中的表达，用上述筛选标准进行筛选受测试的人的PBMC，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌PBMC中上调或下调的表达趋势相符合，就推测受测试的人为胰腺癌病人；如果受测试的人的PBMC，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌中上调或下调的表达趋势不符合，就推测受测试的人为健康人群；本发明通过k倍交叉验证推测这组10个基因组成的基因组合的诊断价值(参见实施例2-51)k倍交叉验证是将样本分成测试组和训练组，通过训练组样本建立模型来对测试组样本进行推测。重复k次后，再计算k次推测正确率的平均正确率，即得此模型最后的正确率。
根据全部25种可能的排列组合，本实验以25组交叉验证的方式，将样本分成25组，每组有8个样本(4个癌和4个正常)当训练样本，其余2个为测试样本。用训练组样本建立筛选标准(见表2-51)，来推测测试组样本是否为癌的正确率。
在表2-51中各种缩写的含义差1＝受测样本-中位数的信号值，T均数肿瘤样本信号值的平均值，N均数正常对照样本信号值的平均值，差2＝T均数-N均数，差2＞0表明基因在胰腺癌PBMC中上调表达，差2＜0说明基因在胰腺癌PBMC中下调表达，中位数训练组8个PBMC中基因表达量的信号值的中位数。
“符合”判定标准取训练组8个PBMC中基因表达量检测结果的中位值作为临界值，以判断受测试的PBMC的基因表达是上调还是下调表达；在测试组中，受测试的人的PBMC，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌PBMC中上调或下调的表达趋势相符合，就推测受测试的人为胰腺癌病人；如果受测试的人的PBMC，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌中上调或下调的表达趋势不符合，就推测受测试的人为健康人群；(简而言之，差1和差2的同为负数或同为正数，则判定符合；否则，判定为不符合。)实施例2操作参照实施例1，结果参见表2。
表2.交叉验证1-1


表2中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌。
实施例3操作参照实施例1，结果参见表3。
表3.交叉验证1-2

表3中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人。
实施例4操作参照实施例1，结果参见表4。
表4.交叉验证2-1

表4中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌。
实施例5操作参照实施例1，结果参见表5，表5.交叉验证2-2

表5中不符合率为7/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例6操作参照实施例1，结果参见表6。
表6.交叉验证3-1


表6中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例7操作参照实施例1，结果参见表7。
表7.交叉验证3-2

表7中符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例8操作参照实施例1，结果参见表8，表8.交叉验证4-1


表8中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌。
实施例9操作参照实施例1，结果参见表9，表9.交叉验证4-2

表9中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例10操作参照实施例1，结果参见表10，表10.交叉验证5-1

表10中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例11操作参照实施例1，结果参见表11，表11.交叉验证5-2


表11中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例12操作参照实施例1，结果参见表12，表12.交叉验证6-1

表12中符合率为8/10。推测受测样本为胰腺癌。
实施例13操作参照实施例1，结果参见表13，表13交叉验证6-2


表13中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例14操作参照实施例1，结果参见表14，表14.交叉验证7-1

表14中符合率为8/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例15操作参照实施例1，结果参见表15，表15.交叉验证7-2


表15中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例16操作参照实施例1，结果参见表16，表16交叉验证8-1

表16中符合率为8/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例17操作参照实施例1，结果参见表17，表17.交叉验证8-2

表17中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例18操作参照实施例1，结果参见表18，表18.交叉验证9-1

表18中符合率为8/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例19操作参照实施例1，结果参见表19，表19交叉验证9-2

表19中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例20操作参照实施例1，结果参见表20，表20.交叉验证10-1


表20中符合率为8/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例21操作参照实施例1，结果参见表21，表21.交叉验证10-2

表21中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例22操作参照实施例1，结果参见表22。
表22.交叉验证11-1


表22中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例23操作参照实施例1，结果参见表23。
表23.交叉验证11-2

表23中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例24操作参照实施例1，结果参见表24。
表24交叉验证12-1

表24中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例25操作参照实施例1，结果参见表25。
表25交叉验证12-2


表25中不符合率为7/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例26操作参照实施例1，结果参见表26。
表26.交叉验证13-1

表26中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例27操作参照实施例1，结果参见表27。
表27.交叉验证13-2


表27中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例28操作参照实施例1，结果参见表28。
表28交叉验证14-1

表28中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例29操作参照实施例1，结果参见表29。
表29.交叉验证14-2

表29中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例30操作参照实施例1，结果参见表30。
表30交叉验证15-1


表30中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例31操作参照实施例1，结果参见表31。
表31.交叉验证15-2

表31中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例32操作参照实施例1，结果参见表32。
表32交叉验证16-1


表32中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例33操作参照实施例1，结果参见表33。
表33交叉验证16-2

表33中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例34操作参照实施例1，结果参见表34。
表34.交叉验证17-1


表34中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例35操作参照实施例1，结果参见表35。
表35.交叉验证17-2

表35中符合率为7/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例36操作参照实施例1，结果参见表36。
表36.交叉验证18-1

表36中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例37操作参照实施例1，结果参见表37。
表37交叉验证18-2


表37中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例38操作参照实施例1，结果参见表38。
表38.交叉验证19-1

表38中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例39操作参照实施例1，结果参见表39。
表39.交叉验证19-2


表39中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例40操作参照实施例1，结果参见表40。
表40.交叉验证20-1

表40中符合率为10/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例41操作参照实施例1，结果参见表41。
表41.交叉验证20-2

表41中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例42操作参照实施例1，结果参见表42。
表42.交叉验证21-1


表42中符合率为9/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例43操作参照实施例1，结果参见表43。
表43.交叉验证21-2

表43中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例44操作参照实施例1，结果参见表44。
表44.交叉验证22-1


表44中符合率为9/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例45操作参照实施例1，结果参见表45。
表45.交叉验证22-2

表45中不符合率为7/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例46操作参照实施例1，结果参见表46。
表46.交叉验证23-1

表46中符合率为9/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例47操作参照实施例1，结果参见表47。
表47.交叉验证23-2


表47中不符合率为9/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例48操作参照实施例1，结果参见表48。
表48.交叉验证24-1

表48中符合率为9/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例49操作参照实施例1，结果参见表49。
表49.交叉验证24-2


表49中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
实施例50操作参照实施例1，结果参见表50。
表50.交叉验证25-1

表50中符合率为9/10。推测受测样本为胰腺癌病人的PBMC。
实施例51操作参照实施例1，结果参见表51。
表51.交叉验证25-2


表51中不符合率为10/10。推测受测样本为正常人的PBMC。
本发明涉及的序列<110>浙江大学<120>一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合及应用<160>10<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>220<213>人<400>1L487841 gaatcagaga tcattgattt cttcctgggg gcctctctca aggatgaggt tttgaagatt61 atgccagtgc agaagcagac ccgtgccggc cagcgcacca ggttcaaggt acccggctgt121 cctgggaggg ggctgcgctg ggcttgccgg gactctctcg gctctgcata gttgcacttg181 gcttcacccg tgtgactttc gtaacgggga gagagagaaa<210>2<211>1295<213>人<400>2X833001 gtgaaagagc aggttctgct tctttggtgt agtcctgaag cttcctaaga aacttcacat61 caggtgatgg ataggagcaa ccctgtaaaa ccagccttag actatttttc aaacaggctg121 gtgaattacc agatctccgt caagtgcagt aaccagttca agttggaagt gtgtcttttg181 aatgcagaaa acaaagtcgt ggacaaccag gctgggaccc agggccagct gaaggtgctg241 ggtgccaacc tctggtggcc gtacctgatg cacgaacacc ccgcctacct gtactcgtgg301 gaggatggtg attgctcaca ccaaagcctt ggacccctcc cagcctgtga cctttgtgac361 caactccacc tacgcagcag acaagggggc tctgtatgtg gatgtgatcc gtgtgaacgg421 ctactactct tggtatcgca actacgggca cctggagttg attcagctgc agctggccgc481 ccagtttgag aattggtgta agacatcaca atcccattat tcagagcgcg tatggagtgg541 aaacgcttgt agggtttcac caggtaagcg gtgttgaact ttctgcttgt gtattctctc601 tgggcagaga tgccacttgc ctcccccacc atgccatctc tgaagaatat tacagaccat661 tttggagcat ggtgaataag aaattttcac cttaggagtt cagttgaata gtcattttta721 tatttgtgac tgcaagtcac tcttaggggc tgtacttcct tagtactggt agcattatta781 tccaatggac ttttatagct ttcattaggt tttcttttgt ttttgttctt taaagaacgt841 tttacttatc ttagtatttc atttttcatc tatattatga ggcagtaaga gtcttctgtt
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权利要求
1.一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合，其特征是由L48784、X83300、AI620827、AI494291、NM_020970、BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994十个基因组合，分别具有SEQ ID NO1～SEQ ID NO10的基因序列。
2.根据权利要求1所述的一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合在筛选胰腺导管腺癌中的应用。
3.根据权利要求2所述的一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合在筛选胰腺导管腺癌中的应用，通过以下技术方案实现(1)建立筛选标准按照Affymetrix基因表达谱芯片操作指南，使用AFFYMETRIX HUMAN GENOME U133 PLUS 2.0 ARRAY检测这组基因在5名胰腺癌患者和5名正常人的外周血单个核细胞中的表达，得到基因表达的信号值；(2)5名胰腺癌患者外周血单个核细胞的平均信号值高于5名正常人的基因被认为是上调表达基因；5名胰腺癌患者的平均信号值低于5名正常人的基因被认为是下调表达基因；(3)取上述10个外周血单个核细胞中基因表达信号值的中位值作为临界值，以判断受测试的外周血单个核细胞的基因表达是上调还是下调表达；受测试的人的外周血单个核细胞，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌外周血单个核细胞中上调或下调的表达趋势相符合，就预测受测试的人为胰腺癌病人；如果受测试的人的外周血单个核细胞，在10个基因中有7个或7个以上的基因表达情况与这些基因在胰腺癌中上调或下调的表达趋势不符合，就预测受测试的人为正常人。
全文摘要
本发明提供一组筛选胰腺导管腺癌的基因组合，包括10个基因L48784、X83300、AI620827、AI494291、NM_020970、BF433657、J02959、BC022313、NM_000904、NM_004994。本发明提供的基因组合在筛选胰腺导管腺癌中的应用。本发明通过检测人类外周血单个核细胞的这组基因，可以从健康人群中筛选出胰腺癌病人。本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法；本发明的筛选方法设计合理，为胰腺癌的临床诊断和筛选提供新的途径，且具有很高的敏感性和特异性。
文档编号C12Q1/68GK1904072SQ200610052679
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月28日 优先权日2006年7月28日
发明者吴育连, 燕海潮 申请人:浙江大学