专利名称：一种含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液及其培养方法，属于家畜胚胎工程技术领域。
背景技术：
随着现代繁殖生物技术的发展及胚胎体外生产技术的逐步完善，利用体外受精技术生产体外胚胎呈现出潜在的广阔应用前景。家畜胚胎体外生产尤其是体细胞核移植是快速扩大优秀种群数量的有效途径。足够数量的成熟卵母细胞是胚胎体外生产的前提条件。从屠宰场获取的卵巢中用注射器抽取卵母细胞并进行体外培养是获取成熟卵母细胞最有效、最经济的途径。由于生殖道内氧的浓度为7％左右，但卵母细胞的体外成熟培养在约含20％氧气的培养箱中完成，因此产生了比体内成熟更高的自由基浓度。自由基是细胞内正常代谢中产生的，在体内正常环境下，自由基的产生和消除处于平衡状态。当自由基过量或持续产生时，平衡遭到破坏，过量的自由基会损害细胞内的脂质、核酸以及蛋白质，使卵母细胞体外培养时细胞质成熟不完全，有关早期胚胎发育的蛋白质没有得到表达，因而早期胚胎体外发育率较低。体内，维持自由基平衡的抗氧化剂主要是一系列的酶类如抗氧化物歧化酶、过氧化氢酶等。但常规的卵母细胞体外培养液中，这些抗氧化的物质是缺乏的，因而不能有效的去除过多的自由基，导致卵母细胞受精后胚胎早期发育率较低。
茶是世界上最流行的饮料之一。茶多酚是茶叶中主要的多羟基酚类物质，约占茶叶干重的20～30％，主要包括儿茶素、黄酮甙类、花青甙类、酚酸类等三十多种多酚成分，它们具有较强的抗氧化和抗自由基的活性，是自由基如过氧化物阴离子、过氧化氢、羟基自由基的清除剂。对于茶多酚的研究已有文献报道。CN1142481A、CN1071660A、CN1194966A、CN1094706A、CN1104621A、CN1386731A、CN1546484A等多种专利申请公开了茶多酚的提取方法。CN1153019A、CN1284275A、CN1365633A等多种专利公开了茶多酚用作保健品的用途。而CN1314148A、CN1314149A、CN1640393A等多种专利公开了茶多酚用作药物的用途。但到目前为止，尚未见有关茶多酚用于家畜繁殖技术领域，特别是用于卵母细胞体外成熟培养的报道。
发明内容本发明即是为了解决现有技术中卵母细胞体外培养液中自由基过多、导致卵母细胞受精后胚胎早期发育率较低的不足，提供了一种具有及时清除卵母细胞胞体内及培养环境中过量自由基、提高卵母细胞体外受精后胚胎发育率的功能的含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液及其培养方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液，所述体外成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有20～150μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素及体积百分含量8％～20％的血清。
茶多酚(Green Tea Polyphenols，简称GTP)是茶叶溶剂浸提物中与亚铁离子产生综合反应的酚类化合物的总称，包括儿茶素、黄酮类化合物、花青素、酚酸等四大类物质，有多种制取方法，属于已知工艺和成熟技术，并已有商品出售，较为成熟的生产厂家有浙大茶叶科技有限公司、浙江绍兴佳利保健制品有限公司、江西绿源生物有限公司、安徽茶多酚厂等。本发明中所用茶多酚由浙大茶叶科技有限公司提供，纯度为99％。
具体的，所述体外成熟培养液每1000mL组成如下茶多酚20～150mg，青霉素100000IU，链霉素100000μg，血清80～200mL，常规培养液补足至1000mL。
所述常规培养液为常见用于牛卵母细胞培养的培养液，可下列之一或其中两种或两种以上的混合物①M199培养液、②DMEM培养液、③F12培养液、④MEM培养液。
所述血清为下列之一①小牛血清、②胎牛血清、③新生牛血清。
优选的，所述茶多酚含量为30～40μg/mL，血清体积百分含量为10％。
所述牛卵母细胞来自奶牛、或黄牛、或水牛中的一种。
一种应用所述体外成熟培养液的牛卵母细胞的体外成熟培养方法，所述方法是将所述体外成熟培养液置38～39℃环境中预热1～3小时，用常规培养液冲洗牛卵母细胞后放入预热的体外成熟培养液，在38～39℃、5％CO2的环境内成熟培养20～24小时，获得成熟的牛卵母细胞。获得的成熟卵母细胞再进行受精、胚胎培养等操作，进行胚胎体外生产。
所述用于培养的牛卵母细胞由屠宰场获取的卵巢中用注射器抽取，其周围至少包裹三层卵丘细胞，通常挑选细胞质比较均匀牛卵母细胞进行体外培养。
通常，所述方法是将所述体外成熟培养液在培养皿上做成体积为50～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，用常规培养液冲洗牛卵母细胞后放入预热后的培养小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内成熟培养20～24小时，获得成熟的牛卵母细胞。
获得的成熟卵母细胞再进行受精、胚胎培养等操作，获得体外受精胚胎，具体方法如下受精用常规受精培养液在一次性塑料培养皿上做成体积为50～100μL的受精小滴置38～39℃环境中预热1～3小时，将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后与培养后的卵母细胞一同放入受精小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内培养15～18小时，进行受精；所述常规受精培养液为含5～10mg/mL肝素的BO液或Tyrode′s改良液。
胚胎培养用常规胚胎体外培养液在一次性塑料培养皿上做成体积为50～100μL的培养小滴置38～39℃环境中预热1～3小时，将受精后的早期胚胎用常规胚胎体外培养液冲洗三次后，放入培养小滴中，在38～39℃、5％CO2的环境内培养，获得牛体外受精胚胎。所述的常规胚胎体外培养液为含体积百分比10％血清的SOF培养液，所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中的一种。
本发明所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，是根据卵母细胞体外成熟培养时抗氧化、抗自由基的需要，结合茶多酚的结构特点和功能研制而成。茶多酚结构中富含酚羟基，可提供活泼氢使自由基灭活，本身被氧化形成含有邻苯二酚结构的自由基而具有较高稳定性，是优良的提供氢的自由基清除剂。茶多酚不仅可清除链引发阶段的羟基自由基、过氧化物阴离子自由基，而且还是断链型抗氧化剂，可清除链反应中间产物脂过氧化自由基和烷氧自由基，从而阻止脂自由基的传播扩增。此外茶多酚能调动和激活细胞内的抗氧化防御系统(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶等)的生理活性，在抗氧化作用上与以上物质具有协同作用，能够更好地发挥防御体统的作用，维持体内自由基的动态平衡。因此茶多酚应用于牛卵母细胞体外培养，可以有效地去除培养过程中产生的多余自由基，促进卵母细胞的细胞质成熟，提高了牛体外成熟的卵母细胞受精后胚胎体外发育率。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1制备含茶多酚的卵母细胞体外成熟培养液准确称取茶多酚4毫克，先用20毫升的M199基础培养液(购自美国GIBCO公司)溶解，然后向培养液中加入10毫升小牛血清和1万国际单位的青霉素，1万微克的链霉素，轻微搅拌均匀，再加入M199基础培养液至100毫升体积，再次搅拌混匀。用0.22μM的微滤膜(Millipore Corporation，Bedford.Mass.USA)抽滤消毒后，在4℃下贮存，备用。
实施例2制备含茶多酚的卵母细胞体外成熟培养液准确称取茶多酚3毫克，先用20毫升的DMEM基础培养液(购自美国GIBCO公司)溶解，然后向培养液中加入10毫升胎牛血清和1万国际单位的青霉素，1万微克的链霉素，轻微搅拌均匀，加入DMEM基础培养液至100毫升，搅拌混匀。用0.22μM的微滤膜(MilliporeCorporation，Bedford.Mass.USA)抽滤消毒后，在4℃下贮存，备用。
实施例3含茶多酚的培养液用于奶牛卵母细胞体外成熟培养奶牛卵母细胞分别在不含茶多酚的对照培养液和含有实施例1制备的含茶多酚的体外成熟培养液中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎继续培养8天。培养的第2天，在不含茶多酚的对照培养液中的卵母细胞受精后的分裂率为71.3％，在实施例1制备的含茶多酚的体外成熟培养液中的卵母细胞受精后的分裂率为79.5％，比对照组提高8.2％。培养的第8天，在不含茶多酚的对照培养液中的卵母细胞受精后的囊胚期发育率为19.3％，在实施例1制备的含茶多酚的体外成熟培养液中的卵母细胞受精后的囊胚期发育率为30.7％，比对照组提高11.4％。结果证实，含茶多酚的体外成熟培养液体外成熟培养奶牛卵母细胞可有效提高受精后的早期胚胎发育率。
实施例4含茶多酚的培养液用于黄牛卵母细胞体外成熟培养黄牛卵母细胞分别在不含茶多酚的对照培养液和含有实施例2制备的含茶多酚的体外成熟培养液中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎继续培养8天。培养的第2天，在不含茶多酚的对照培养液中的卵母细胞受精后的分裂率为72.7％，在实施例2制备的含茶多酚的体外成熟培养液中的卵母细胞受精后的分裂率为82.9％，比对照组提高10.2％。培养的第8天，在不含茶多酚的对照培养液中的卵母细胞受精后的囊胚期发育率为21.9％，在实施例2制备的含茶多酚的体外成熟培养液中的卵母细胞受精后的囊胚期发育率为32.4％，比对照组提高10.5％。结果证实，含茶多酚的体外成熟培养液体外成熟培养黄牛卵母细胞可有效提高受精后的早期胚胎发育率。
权利要求
1.一种含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于所述体外成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有20～150μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素及体积百分含量8％～20％的血清。
2.如权利要求1所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于所述体外成熟培养液每1000mL组成如下茶多酚20～150mg青霉素100000IU链霉素100000μg血清80～200mL常规培养液补足至1000mL。
3.如权利要求1或2所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于所述常规培养液为下列之一或其中两种或两种以上的混合物①M199培养液、②DMEM培养液、③F12培养液、④MEM培养液。
4.如权利要求1或2所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于所述血清为下列之一①小牛血清、②胎牛血清、③新生牛血清。
5.如权利要求1或2所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于所述茶多酚含量为30～40μg/mL，血清体积百分含量为10％。
6.如权利要求1或2所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于所述牛卵母细胞来自奶牛、或黄牛、或水牛中的一种。
7.一种应用如权利要求1或2所述体外成熟培养液的牛卵母细胞的体外成熟培养方法，其特征在于所述方法是将所述体外成熟培养液置38～39℃环境中预热1～3小时，用常规培养液冲洗牛卵母细胞后放入预热的体外成熟培养液，在38～39℃、5％CO2的环境内成熟培养20～24小时，获得成熟的牛卵母细胞。
8.如权利要求7所述的牛卵母细胞的体外成熟培养方法，其特征在于所述方法是将所述体外成熟培养液在培养皿上做成体积为50～100μL的培养小滴，置38～39℃环境中预热1～3小时，用常规培养液冲洗牛卵母细胞后放入预热后的培养小滴，在38～39℃、5％CO2的环境内成熟培养20～24小时，获得成熟的牛卵母细胞。
9.如权利要求7所述的牛卵母细胞的体外成熟培养方法，其特征在于所述用于培养的牛卵母细胞由屠宰场获取的卵巢中用注射器抽取，其周围至少包裹三层卵丘细胞。
全文摘要
本发明提供了一种含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液及其培养方法，所述体外成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有20～150μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素及体积百分含量8％～20％的血清。本发明将茶多酚应用到牛卵母细胞体外成熟培养领域，提高了牛卵母细胞体外受精后早期胚胎体外发育率。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
文档编号C12N5/06GK1904038SQ200610052700
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月28日 优先权日2006年7月28日
发明者俞颂东, 王争光, 陈阿琴 申请人:浙江大学