专利名称：无伤害提取活体蜜蜂dna的方法
技术领域：
本发明涉及无伤害提取活体蜜蜂DNA的方法。
背景技术：
蜜蜂的育种根据蜜蜂遗传和变异的特性，通过选择和繁殖，不断地扩大、积累和加强蜜蜂群体中因自然突变或基因重组而产生的某种有益变异，并使这种有益变异朝着同一变异性质的方向发展而进行的一种育种方法。因此，它是对自然界中存在的自发突变或基因重组现象的利用。现有的蜜蜂品种中，将某一因自发突变或基因重组而产生的有益变异的蜂群选拔出来，把它专门繁育成一个系统，通过连续选择，严格控制交配，朝着同一个育种目标，进行选择和繁育。这样，经过若干世代以后，某一有益的突变基因或重组的基因组合所控制的优良性状，就有可能在后代蜂群中获得稳定遗传。通过扩大繁育，使决定某一优良性状的有益等位基因的频率增高，使个别优秀个体的特点迅速扩散为群体共有的特点，甚至使分散在各个个体中的优良性状迅速集中并转变为群体共有的特点。从而达到育成新品种或新品系的目的。
可见，在育种过程中，对优良性状选择的准确与否是育种成败的关键。蜜蜂是完全的社会性昆虫，蜂群是蜜蜂生物学的基本单位，蜜蜂的生产性能和经济性状表现必须通过蜂群的生产性能考察才能反映出来，蜂群的生产性能考察受时间、蜜粉源条件、气候等多种外界环境条件影响而不够稳定，且要花费大量的劳力、物力才能完成。随着科技的进步和分子生物学技术的快速发展，利用与经济性状相关的分子标记开展分子辅助选择育种技术在农作物和家养动物育种中得到广泛应用。
在分子辅助选育过程中，蜂王和雄蜂的DNA提取是必不可少的环节，蜂王和雄蜂的个体不象其他家养蜂动物或农作物一样，取一小部分组织就足以提取DNA以供检测，割取蜂王或雄蜂的任何组织都将对其造成严重的伤害甚至死亡，对蜂王或雄蜂的伤害将影响其性能考察和种用价值。因此，寻找一种既能获得蜂王或雄蜂的DNA又不伤害蜜蜂的方法在蜜蜂育种中具有重要的应用价值。
目前，提取活体蜜蜂DNA的方法主要有以下几种1)蜜蜂胸部肌肉的DNA提取方法 捕获蜂王或雄蜂，将其处死，解剖胸部获取肌肉，置于1.5ml离心管中，用眼科手术剪将其剪碎。加入560μl DNA抽提液，再加入RNA酶A(10mg/ml)4ul，置于恒温箱中37℃消化2h。取出，加入蛋白酶K(10mg/μl)，充分混匀，用封口膜将离心管盖封好，55℃消化12～24h。加入等体积的苯酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，以12000rpm离心12min，将上清液移至另一干净离心管。加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，离心，取上清液。加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，重复上述抽提步骤。向最后获得的上清液中加入无水乙醇800μl和3M NaAC45μl。以12000rpm离心10min，小心倒去液体。用75％乙醇洗涤2次。将DNA自然晾干后溶入适量TE中，-20℃保存，获得成年蜂的DNA。
2)蜜蜂组织的DNA提取方法 捕获蜂王或雄蜂，用眼科剪剪取足、翅膀或触角等的组织器官，置于1.5ml离心管中，用眼科剪将其剪碎。加入560μl DNA抽提液，再加入RNA酶A(10mg/ml)4ul，置于恒温箱中37℃消化2h。取出，加入蛋白酶K(10mg/μl)，充分混匀，用封口膜将离心管盖封好，55℃消化12～24h。加入等体积的苯酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，以12000rpm离心12min，将上清液移至另一干净离心管。加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，离心，取上清液。加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，重复上述抽提步骤。向最后获得的上清液中加入无水乙醇800μl和3M NaAC45μl。以12000rpm离心10min，小心倒去液体。用75％乙醇洗涤2次。将DNA自然晾干后溶入适量TE中，-20℃保存，获得成年蜂的DNA。
3)幼虫或蛹的DNA提取方法 捕获蜂王或雄蜂幼虫或蛹，置于1.5ml离心管中，用眼科手术剪将其剪碎，加入560μl DNA抽提液，再加入RNA酶A(10mg/ml)4ul，置于恒温箱中37℃消化2h。取出，加入蛋白酶K(10mg/μl)，充分混匀，用封口膜将离心管盖封好，55℃消化12～24h。加入等体积的苯酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，以12000rpm离心12min，将上清液移至另一干净离心管。加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，离心，取上清液。加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，重复上述抽提步骤。向最后获得的上清液中加入无水乙醇800μl和3M NaAC 45μl。以12000rpm离心10min，小心倒去液体。用75％乙醇洗涤2次。将DNA自然晾干后溶入适量TE中，-20℃保存，获得蜜蜂幼虫或蛹的DNA。
上述的蜜蜂DNA提取要么是杀死蜜蜂个体，要么是割取蜜蜂个体的部分组织器官，蜜蜂个体很小，这样的处理都不可避免地伤害活体蜜蜂，影响其生产性能考察和蜂王雄蜂的种用价值。
发明内容
本发明的目的是提供无伤害提取活体蜜蜂DNA的方法，利用蜜蜂的生物学特性，蜜蜂成年蜂在羽化时会把蛹期的蜕皮留在巢房底部，通过收集刚羽化蜜蜂巢房底部的蜕皮，从中提取DNA，以供基因型检测之用。
本发明的无伤害提取活体蜜蜂DNA的方法，步骤如下1)把培养到蛹期的王台、雄蜂蛹脾或工蜂蛹脾放入35℃、相对湿度65％～75％的培养箱内培养，在蜂王、雄蜂或工蜂刚刚羽化时，抓住蜂王、雄蜂或工蜂，在其胸部背板粘上带编号的标记，从相应的巢房内收集蜕皮放入1.5ml的离心管中并记好编号；2)往收集在离心管中的蜕皮加入200ul 5％Chelex 100、10ul 10mg/ml的蛋白酶K和7ul DTT，振荡混匀，确保蜕皮浸泡在Chelex溶液中，55℃温浴20～24小时，取出振荡混匀，在100℃水浴中变性8分钟，在4℃、12,000～13,000g条件下离心3分钟，得到含有活体蜜蜂DNA的上清液。
上述的王台是指由工蜂为培育蜂王所筑成的巢房，巢房内产上卵后称王台，王台房形长、大，房壁较厚，房口朝下，外表粗糙如花生壳，一般筑在巢脾两侧和下沿。蜂王在王台内产卵后经历3天的卵期和6天的幼虫期而后进入蛹期，蜂王蛹期7天。
所说的巢房是由工蜂用蜡筑造为培育后代或贮存蜜粉等的房孔，房孔正六边形，房底由三个平行四边形拼合而成，在同一巢脾上小些的称工蜂房，大些的称雄蜂房；雄蜂蛹脾是指公共边连成一片的、内含雄蜂蛹的雄蜂房，工蜂蛹脾是指公共边连成一片的、内含工蜂蛹的工蜂房。
本发明与现有技术相比，具有的有益的效果是1.采用本发明方法是从蜜蜂在发育过程中丢弃的蜕皮组织中提取DNA，从而避免杀死或割取蜜蜂组织提取DNA而对活体蜜蜂造成伤害。
2.采用本发明方法提取蜂王或雄蜂的DNA可以检测其基因型，在蜜蜂育种中具有重要的应用价值，因为蜂王是一个正常蜂群所有成员的唯一母亲，对蜂王的伤害将直接影响其生产性能考察和种用价值。
3.采用本发明方法提取蜜蜂DNA的操作过程简单，成本较低，适于大批量提取蜜蜂的DNA样本。
4.采用本发明方法提取的DNA可以检测处女王和交配雄蜂的基因型，从而预测该蜂王和雄蜂的生产性能，提高优良蜂王选留和雄蜂配种的准确性，大大提高蜜蜂育种效率。
具体实施例方式
实施例1为了证实从同一个体肌肉和蜕皮中提取的DNA是一样的，我们采用4对微卫星引物分别对5只工蜂、5只蜂王和3只雄蜂的肌肉和蜕皮中提取的DNA进行PCR检测。
1)蜜蜂肌肉和蜕皮的收集 在浙江大学实验蜂场，选用“浙农大1号”意蜂品种作为试验素材，用养王框培育20个王台，王台封盖后的第5天把养王框放到35℃、相对湿度65％～75％的培养箱内培养；同时从蜂群中选择18日龄的封盖雄蜂脾和工蜂脾放到35℃、相对湿度65％～75％的培养箱内培养。每天观察蜂王、工蜂、雄蜂的发育情况，在蜂王、雄蜂或工蜂刚刚羽化时，分别捕获5只蜂王、3只雄蜂和5只工蜂，从相应的巢房内收集蜕皮放入1.5ml的离心管中并记好编号。蜂王、工蜂、雄蜂的蜕皮分别编号为qc1-5、wc1-5、dc1-3。解剖获取蜂王、工蜂、雄蜂的胸部肌肉，放入相应的1.5ml离心管中，蜂王、工蜂、雄蜂的肌肉分别编号为qm1-5、wm1-5、dm1-3。
2)DNA的提取 分别往离心管中的肌肉、蜕皮加入200ul 5％Chelex 100(Bio-Rad Laboratories，CA)、10ul 10mg/ml蛋白酶K和7ul DTT，振荡混匀，确保样品浸泡在Chelex溶液中，55℃温浴20小时，取出振荡混匀，在100℃水浴中变性8分钟，在4℃、13,000g条件下离心3分钟，上清液转移到另一干净的1.5ml的离心管中，上清液中含有提取出的蜜蜂DNA。
3)PCR检测 采用4对微卫星引物，引物序列和各自的PCR反应条件见表1，引物用IRD 700/800(METABION，Martinsried Germany)荧光标记，对蜂王、雄蜂、工蜂的肌肉和蜕皮组织提取的DNA进行PCR扩增，移取4ul上清液作为DNA模板，PCR反应体系按表2进行。PCR反应产物在LI-COR 4300 DNAAnalyzer测序仪上样电泳分离，用SAGA软件对电泳结果进行数据分析，检测各个个体的基因型，结果见表3。
从试验结果可以看出，从5只蜂王、5只工蜂、3只雄蜂的肌肉和蜕皮提取的DNA的PCR结果都完全一致，也就是说一个蜜蜂个体的蜕皮中提取的DNA与从该个体肌肉中提取的DNA完全一样，检测从蜕皮中提取的DNA的基因型就可以准确测定该个体的基因型，从而达到利用DNA分子标记无伤害地测定活体蜜蜂基因型的目的。该试验还证明，从一只蜜蜂蜕皮中提取的DNA样品足以满足PCR检测的要求，只要采用与经济性状相关的PCR引物，就可以对一只蜂王、雄蜂或工蜂蜕皮提取的DNA进行PCR扩增，检测该活体蜜蜂的基因型，达到预期该蜂王或雄蜂的生产性能和种用价值。
表1 蜜蜂4对微卫星引物的序列和PCR反应条件
表2 蜜蜂微卫星PCR反应体系
表3 蜜蜂肌肉和蜕皮提取DNA的PCR反应结果
注wc1-5表示工蜂蜕皮样品1-5；wm1-5表示工蜂胸部肌肉样品1-5；qc1-5表示蜂王蜕皮样品1-5；qm1-5表示蜂王胸部肌肉样品1-5；dc1-3表示雄蜂蜕皮样品1-3；dm1-3表示雄蜂胸部肌肉样品1-3；wc1和wm1代表蜕皮和肌肉组织来自同一工蜂个体；qc1和qm1代表蜕皮和肌肉组织来自同一蜂王个体，其他依此类推这些样品都来自同一蜂群。
权利要求
1.无伤害提取活体蜜蜂DNA的方法，其特征是步骤如下1)把培养到蛹期的王台、雄蜂蛹脾或工蜂蛹脾放入35℃、相对湿度65％～75％的培养箱内培养，在蜂王、雄蜂或工蜂刚刚羽化时，抓住蜂王、雄蜂或工蜂，在其胸部背板粘上带编号的标记，从相应的巢房内收集蜕皮放入1.5ml的离心管中并记好编号；2)往收集在离心管中的蜕皮加入200ul_5％Chelex 100、10ul 10mg/ml的蛋白酶K和7ul DTT，振荡混匀，确保蜕皮浸泡在Chelex溶液中，55℃温浴20～24小时，取出振荡混匀，在100℃水浴中变性8分钟，在4℃、12,000～13,000g条件下离心3分钟，得到含有活体蜜蜂DNA的上清液。
全文摘要
本发明公开的无伤害提取活体蜜蜂DNA的方法，是从蜂王、工蜂或雄蜂在刚刚羽化时留在巢房底部的蜕皮组织中提取DNA，操作过程简单，不伤害活体蜜蜂，成本较低。本发明的无伤害提取活体蜜蜂的DNA方法在蜜蜂育种上具有重要的应用价值，通过提取蜜蜂蜕皮的DNA，PCR检测其经济性状基因位点的基因型，预测蜂王或雄蜂的生产性能，可以提高优良蜂王选留和雄蜂配种的准确性，大大提高蜜蜂育种效率。
文档编号C12N15/12GK1904045SQ20061005287
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月10日 优先权日2006年8月10日
发明者苏松坤, 蔡芳, 杜宏沪, 陈盛禄 申请人:浙江大学