一种用于堆肥发酵的复合微生物菌剂及其生产方法和用途的制作方法

文档序号:556101阅读:326来源:国知局
专利名称:一种用于堆肥发酵的复合微生物菌剂及其生产方法和用途的制作方法
技术领域
本发明涉及一种复合微生物菌剂,特别涉及一种用于有机物料腐熟和生产生物有机肥的复合微生物菌剂。本发明还涉及所述复合微生物菌剂的生产方法以及其在有机物料堆肥中的用途。
背景技术
目前国内外有机物料腐熟菌剂主要有固氮菌、解磷菌、纤维素分解菌、复合微生物菌剂等。其中复合微生物由于其适应环境能力强,效果较为稳定,成为近年国内外开发的一个重要方向,代表性的产品有日本的酵素菌、EM菌等。
我国目前已有一些单位相继推出不同组合的复合微生物制剂,但普遍的问题是在复合微生物筛选培养过程中,缺乏基本的理论指导以及成熟的生产工艺,对复合培养的发酵过程及其各菌群之间的相互作用及其机理较为生疏,导致产品活菌总数不能保持一定水平,产品质量不稳定,影响了其在使用过程中的效果。

发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的在于针对上述现有技术的不足,公开了一种复合微生物菌剂及其生产方法,本发明能够较好地解决不同微生物之间的协同、共生关系,从而保证稳定的作用效果。
(二)技术方案本发明从30个不同属、种中筛选出最佳稳定共生菌种组合,通过单独培养筛选高产菌种。筛选出的菌种为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、总状毛霉(Mucorracemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)。
根据上述筛选结果,本发明设计了一种复合微生物菌剂,包括酿酒酵母5.0×108~1.0×1010cfu/mL、植物乳杆菌5.0×108~1.0×1010cfu/mL、总状毛霉1.0×102~5.0×104cfu/mL、米曲霉1.0×103~5.0×104cfu/mL;优选地,酿酒酵母1.0×109~6.0×109cfu/mL、植物乳杆菌1.0×109~6.0×109cfu/mL、总状毛霉5.0×102~5.0×103cfu/mL、米曲霉4.0×103~1.0×104cfu/mL。
本发明所述的复合微生物菌剂的生产方法,包括如下步骤1).斜面培养将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上,将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15~38℃条件下培养2~6天,植物乳杆菌15~42℃条件下培养1~3天,使菌种活化;2).一级种子培养将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15~38℃条件下,100~200r/min摇床培养2~6天,植物乳杆菌15~42℃条件下静止培养1~3天,单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养,制得一级种子;3).二级种子培养按液体培养基的体积比为5~20%的接种量,将一级种子分别接种于发酵罐中,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15~38℃条件下,搅拌速度为100~200r/min,通气量为1∶0.5~1.5,培养2~6天,植物乳杆菌15~42℃条件下培养1~3天,制得二级种子;4).混合发酵培养按液体培养基的体积比为5~20%的接种量,将二级种子接种于发酵罐中,进行高密度发酵培养,获得菌剂。
其中,步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基,植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。固态培养基与液态培养基的区别在于固态培养基在制备过程中添加了适量的琼脂。
其中,步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为糖蜜3~20%、硫酸铵0.5~10%、蛋白胨0.5~5%、碳酸钙0.5~3%,余量为水;所述的高密度发酵培养可以采用补料分批培养(FBC)方式,其中补料碳源为葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物;氮源为硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物;并且,培养过程分阶段调控发酵pH、溶解氧、搅拌转速和温度等条件。具体地说发酵培养过程包括a、有氧培养阶段起始0~24小时内,间隔通气,保持在有氧条件发酵,通气量1∶1~1.5,调控发酵溶解氧5~15%,搅拌转速150~200r/min,搅拌间隔时间1~3小时,搅拌1~3分钟,温度25~35℃;b、微溶氧和厌氧培养阶段24~96小时,保持发酵液上层微溶氧状态,静止培养,间隔搅拌,搅拌间隔时间3~5小时,搅拌3~5分钟,使用碳酸钙调节pH保持稳定在3.8~4.5之间,温度25~35℃。
本发明所述复合微生物菌剂可用于有机物料堆肥,包括动物粪便、植物秸秆、污泥等等的堆肥。
(三)有益效果本发明提供的复合微生物菌剂活菌总数高,协同作用好,作用稳定,能有效提高有机物料的腐熟速度,可用于生产生物有机肥,从而降低了农业生产的成本。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但不用来限制本发明所要保护的范围。
实施例1 复合微生物菌剂的构成总菌数为 3.1×109cfu/mL酿酒酵母 1.6×109cfu/mL植物乳杆菌 1.5×109cfu/mL总状毛霉 4.1×102cfu/mL米曲霉 6.2×103cfu/mL实施例2 复合微生物菌剂的构成总菌数为 1.0×1010cfu/mL酿酒酵母 1.0×1010cfu/mL植物乳杆菌 5.0×108cfu/mL总状毛霉 5.0×104cfu/mL米曲霉 1.0×103cfu/mL实施例3 复合微生物菌剂的构成总菌数为 1.0×1010cfu/mL酿酒酵母 5.0×108cfu/mL植物乳杆菌 1.0×1010cfu/mL总状毛霉 1.0×102cfu/mL米曲霉 5.0×104cfu/mL实施例4 复合微生物菌剂的构成总菌数为 6.0×109cfu/mL酿酒酵母 1.0×109cfu/mL植物乳杆菌 5.0×109cfu/mL
总状毛霉 5.0×102cfu/mL米曲霉 4.0×103cfu/mL实施例5 复合微生物菌剂的构成总菌数为 6.0×109cfu/mL酿酒酵母 5.0×109cfu/mL植物乳杆菌 1.0×109cfu/mL总状毛霉 5.0×103cfu/mL米曲霉 1.0×104cfu/mL实施例6 复合微生物菌剂的生产方法1).斜面培养将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上,将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下培养3天,植物乳杆菌37℃条件下培养2天;2).一级种子培养将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下,150r/min摇床培养3天,植物乳杆菌37℃条件下静止培养2天,制得一级种子,结束培养时酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉以及植物乳杆菌各菌悬液光密度OD600值均达到4.0;3).二级种子培养按液体培养基的体积比为10%的接种量,将一级种子分别接种到100L的发酵罐中,发酵罐内培养液的总体积为60L,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下,搅拌速度为150r/min,通气量为1∶1,培养3天,植物乳杆菌37℃条件下培养2天,制得二级种子;4).混合发酵培养按液体培养基的体积比为15%的接种量,将二级种子接种到1吨的发酵罐中,发酵罐内的培养基总体积为700L,进行高密度发酵培养,获得菌剂,其中,步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基,植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。
其中,步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为糖蜜8%、硫酸铵5%、蛋白胨2.5%、碳酸钙2%,余量为水;高密度发酵培养采用补料分批培养方式,其中补料碳源为葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜;氮源为硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨。
发酵培养过程包括a、有氧培养阶段起始0~24小时内,间隔通气,保持在有氧条件发酵,通气量1∶1.2,调控发酵溶解氧10%,搅拌转速180r/min,搅拌间隔时间2小时,搅拌2分钟,温度30℃;b、微溶氧和厌氧培养阶段60小时,保持发酵液上层微溶氧状态,静止培养,间隔搅拌,搅拌间隔时间4小时,搅拌4分钟,使用碳酸钙调节稳定pH4.0,温度30℃。
实施例7 复合微生物菌剂的生产方法1).斜面培养将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上,将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15℃条件下培养6天,植物乳杆菌42℃条件下培养1天;2).一级种子培养将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15℃条件下,200r/min摇床培养6天,植物乳杆菌15℃条件下静止培养3天,制得一级种子,结束培养时酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉以及植物乳杆菌各菌悬液光密度OD600值均达到3.0;3).二级种子培养按液体培养基的体积比为5%的接种量,将一级种子分别接种到100L的发酵罐中,发酵罐内培养液的总体积为60L,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15℃条件下,搅拌速度为200r/min,通气量为1∶0.5,培养6天,植物乳杆菌42℃条件下培养1天,制得二级种子。
4).混合发酵培养按液体培养基的体积比为20%的接种量,将二级种子接种到1吨的发酵罐中,发酵罐内的培养基总体积为700L,进行高密度发酵培养,获得菌剂。
其中,步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基,植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。
其中,步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为糖蜜3%、硫酸铵10%、蛋白胨5%、碳酸钙0.5%,余量为水;高密度发酵培养采用补料分批培养方式,其中补料碳源为葡萄糖、甘油;氮源为牛肉膏、蛋白胨。
发酵培养过程包括a、有氧培养阶段起始0~24小时内,间隔通气,保持在有氧条件发酵,通气量1∶1,调控发酵溶解氧5%,搅拌转速200r/min,搅拌间隔时间3小时,搅拌3分钟,温度35℃;b、微溶氧和厌氧培养阶段96小时,保持发酵液上层微溶氧状态,静止培养,间隔搅拌,搅拌间隔时间3小时,搅拌3分钟,使用碳酸钙调节稳定pH4.5,温度35℃。
实施例8 复合微生物菌剂的生产方法1).斜面培养将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上,将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉38℃条件下培养2天,植物乳杆菌15℃条件下培养3天;2).一级种子培养将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉38℃条件下,100r/min摇床培养2天,植物乳杆菌42℃条件下静止培养1天,制得一级种子,结束培养时酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉以及植物乳杆菌各菌悬液光密度OD600值均达到3.0;3).二级种子培养按液体培养基的体积比为20%的接种量,将一级种子分别接种到100L的发酵罐中,发酵罐内培养液的总体积为60L,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉38℃条件下,搅拌速度为100r/min,通气量为1∶1.5,培养2天,植物乳杆菌15℃条件下培养3天,制得二级种子。
4).混合发酵培养按液体培养基的体积比为5%的接种量,将二级种子接种到1吨的发酵罐中,发酵罐内的培养基总体积为700L,进行高密度发酵培养,获得菌剂。
其中,步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基,植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。
其中,步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为糖蜜20%、硫酸铵0.5%、蛋白胨0.5%、碳酸钙3%,余量为水;高密度发酵培养采用补料分批培养方式,其中补料碳源为蔗糖、糖蜜;氮源为硫酸铵、牛肉膏。
发酵培养过程包括a、有氧培养阶段起始0~24小时内,间隔通气,保持在有氧条件发酵,通气量1∶1.5,调控发酵溶解氧15%,搅拌转速150r/min,搅拌间隔时间1小时,搅拌1分钟,温度25℃;b、微溶氧和厌氧培养阶段24小时,保持发酵液上层微溶氧状态,静止培养,间隔搅拌,搅拌间隔时间5小时,搅拌5分钟,使用碳酸钙调节稳定pH3.8,温度25℃。
实施例9 以鸡粪为主要原料的堆肥组成鸡粪80%麦秸18%麦麸1.7%红糖0.1%本发明复合微生物菌剂0.2%制作过程
配料时须先将红糖用水溶解,再加入本菌剂充分搅匀,然后将稀释液均匀拨洒在原材料上,并充分翻搅(用搅拌机最好)均匀。
物料水分一般应控制在50~60%,C/N比调节到25~30∶1,pH值呈中性或弱碱性,物料粒径在2~60mm之间。发酵时,物料堆成条状山形或梯形进行发酵。如堆成条状山形,堆高一般不超过80cm,底部宽约120~150cm,长度不限;如堆成梯形,堆高一般不超过50cm,长宽不限。(这里的C/N指的是物料当中的总碳量和总氮量比值。C/N值高,通过添加含N量高的物料进行调节,C/N值低,通过添加含C量高的物料进行调节。)发酵过程中,应观察物料温度变化,当温度升至60℃以上后,物料每2~3天翻堆一次,连续翻堆3~4次。发酵7~10天基本完成。
堆肥腐熟效果如表1所示,加入本菌剂对于有机碳的分解有一定的促进效果。
表1 添加本菌剂后有机碳的变化

实施案例10 以牛粪为主要原料的堆肥组成牛粪95% 麦麸4.7% 红糖0.1% 本发明复合微生物菌剂0.2%制作过程先将一定量的红糖溶于水,红糖的量为堆肥原料干重的1‰,加入2‰的本菌剂,用少量的麦麸作为菌剂的吸附材料。然后将麦麸与堆肥原料混匀,进行堆肥,并充分翻搅(用搅拌机最好)均匀。
物料水分一般应控制在50~60%,C/N比调节到25~30∶1,pH值呈中性或弱碱性,物料粒径在2~60mm之间。
发酵时,堆高一般不超过80cm,底部宽120~150cm,长度不限;如堆成梯形,堆高一般不超过50cm,长宽不限。物料堆好后,可盖上塑料布,并用草帘等适当遮光。
发酵过程中,应观察物料温度变化,当温度升至60℃以上后,每2~3天翻堆一次,连续翻堆3~4次。发酵7~10天基本完成。
堆肥腐熟效果如表2所示加入本菌剂对于有机碳的分解有一定的促进效果。
表2 添加本菌剂后有机碳的变化

实施案例11 以秸秆为主要原料的堆肥组成玉米秸秆98% 本发明复合微生物菌剂0.2%、红糖1.8%制作过程配料时须先将红糖用水溶化(解),再加入本菌剂充分搅匀,然后将稀释液均匀拨洒在原材料上。将添加本菌剂的玉米秸秆埋入土壤。
结果玉米秸秆还田后,在越冬前两个月内(到12月5日),玉米秸秆加喷本菌剂,平均日分解量达到1.08克,未加喷本菌剂平均日分解量为0.38克。这说明,喷施本菌剂能够加速秸秆的分解。
应用案例12 以污泥为主要原料的堆肥组成污泥∶玉米芯∶回流污泥∶粉煤灰=14∶2∶3∶1(重量比),本发明复合微生物菌剂0.2%,红糖0.1%制作过程人工将物料混合好之后,投入发酵池。物料水分控制在55~65%,最适60%。堆肥体积为12m3。相同配方物料配制两堆,堆肥原料初始C/N为25。
先将一定量的红糖溶于水,红糖的量为堆肥原料干重的1‰,加入2‰的本菌剂,用少量的麦麸作为菌剂的吸附材料。然后将麦麸与堆肥原料混匀,进行堆肥,并用搅拌机充分翻搅均匀。堆肥在长×宽×高为30m×6m×1m的水泥池内进行,发酵池上部有机械翻堆装置,底部铺设有PVC通气管。每日定时通风,共发酵48天。
腐熟结果堆肥原料初始C/N为25,以C/N降低到20以下为腐熟标准,接种本菌剂的处理比不接种本菌剂的处理提前6天达到腐熟。
权利要求
1.一种用于堆肥发酵的复合微生物菌剂,其特征在于该菌剂包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5.0×108~1.0×1010cfu/mL、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)5.0×108~1.0×1010cfu/mL、总状毛霉(Mucor racemosus)1.0×102~5.0×104cfu/mL、米曲霉(Aspergillusoryzae)1.0×103~5.0×104cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂,其特征在于该菌剂包括酿酒酵母1.0×109~6.0×109cfu/mL、植物乳杆菌1.0×109~6.0×109cfu/mL、总状毛霉5.0×102~5.0×103cfu/mL、米曲霉4.0×103~1.0×104cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂,其特征在于该菌剂包括酿酒酵母1.6×109cfu/mL、植物乳杆菌1.5×109cfu/mL、总状毛霉4.1×102cfu/mL、米曲霉6.2×103cfu/mL。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的复合微生物菌剂的生产方法,其特征是包含如下步骤1).斜面培养将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上,将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15~38℃条件下培养2~6天,植物乳杆菌15~42℃条件下培养1~3天;2).一级种子培养将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15~38℃条件下,100~200r/min摇床培养2~6天,植物乳杆菌15~42℃条件下静止培养1~3天,单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养,制得一级种子;3).二级种子培养按液体培养基的体积比为5~20%的接种量,将一级种子分别接种于发酵罐中,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15~38℃条件下,搅拌速度为100~200r/min,通气量为1∶0.5~1.5,培养2~6天,植物乳杆菌15~42℃条件下培养1~3天,制得二级种子;4).混合发酵培养按液体培养基的体积比为5~20%的接种量,将二级种子接种于发酵罐中,进行高密度发酵培养,获得菌剂,其中,所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式,其中补料碳源为葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物;氮源为硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物,发酵培养过程包括a、有氧培养阶段起始0~24小时内,间隔通气,保持在有氧条件发酵,通气量1∶1~1.5,调控发酵溶解氧5~15%,搅拌转速150-200r/min,搅拌间隔时间1~3小时,搅拌1~3分钟,温度25~35℃;b、微溶氧和厌氧培养阶段24~96小时,保持发酵液上层微溶氧状态,静止培养,间隔搅拌,搅拌间隔时间3~5小时,搅拌3~5分钟,使用碳酸钙调节pH保持稳定在3.8~4.5之间,温度25~35℃。
5.一种如权利要求4所述的复合微生物菌剂的生产方法,其特征在于1).斜面培养将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上,将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下培养3天,植物乳杆菌37℃条件下培养2天;2).一级种子培养将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下,150r/min摇床培养3天,植物乳杆菌37℃条件下静止培养2天,单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养,制得一级种子;3).二级种子培养按液体培养基的体积比为10%的接种量,将一级种子分别接种于发酵罐中,酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下,搅拌速度为150r/min,通气量为1∶1,培养3天,植物乳杆菌37℃条件下培养2天,制得二级种子;4).混合发酵培养按液体培养基的体积比为15%的接种量,将二级种子接种于发酵罐中,进行高密度发酵培养,获得菌剂,其中所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式,其中补料碳源为糖蜜;氮源为蛋白胨,发酵培养过程包括a、有氧培养阶段起始0~24小时内,间隔通气,保持在有氧条件发酵,通气量1∶1.2,调控发酵溶解氧10%,搅拌转速180r/min,搅拌间隔时间2小时,搅拌2分钟,温度30℃;b、微溶氧和厌氧培养阶段60小时,保持发酵液上层微溶氧状态,静止培养,间隔搅拌,搅拌间隔时间4小时,搅拌4分钟,使用碳酸钙调节pH保持稳定在4.0,温度30℃。
6.一种如权利要求1~3任一项所述的复合微生物菌剂在有机物料堆肥中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于堆肥发酵的复合微生物菌剂及其生产方法和用途。该菌剂包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、总状毛霉(Mucor racemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae),经过斜面培养、一级种子、二级种子以及混合培养发酵,实现了复合菌生物量及其不同菌种配比的最优化,复合菌剂有效活菌数大于3×10
文档编号C12N1/16GK1966664SQ200610078588
公开日2007年5月23日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者李季, 康文力, 彭生平 申请人:李季
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