专利名称：一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及基因合成、蛋白疫苗和基因疫苗的构建、动物免疫实验、诱导抗血清的体外检测等技术，特别是一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗及其制备方法。
背景技术：
肌肉发生(myogenesis)指个体发育过程中肌组织的形成和生长过程。肌肉发生的研究主要包括肌组织的形成及调控机理、肌组织的生长及控制因素等。肌肉发生研究的重要意义在于肌肉发生一直是发育生物学研究的热点领域之一，骨骼肌细胞在体外培养条件下可以诱导分化，同时有客观的形态学和分子标志来区分正在增殖或已分化的骨骼肌细胞，所以对骨骼肌细胞增殖分化的调控机理研究十分重要，为胚胎发育中肌肉始祖细胞的分化机制研究提供依据；肌肉发育与许多肌肉相关疾病如肌营养不良(MD)、废用性肌肉萎缩、肿瘤恶液质等密切相关，研究肌肉发生可为肌肉相关疾病发病机制研究及肌肉相关疾病诊断、治疗提供理论基础；研究肌肉发育为畜牧业食用肉类的动物育种提供理论依据。
1 Myostatin分子及活性抑制的相关研究1.1 Myostatin基因的发现1997年，McPherron等在《自然》杂志上报道了一种从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆的新的转化生长因子(transforming growth factor beta，TGF)，通过蛋白质同源性比较，证明是TGF-β超家族的新成员，被命名为生长/分化因子8(growth diferentiationfactor 8，GDF-8)。利用基因敲除技术研究GDF-8的功能时发现，GDF-8基因敲除的小鼠体重增加约30％，骨骼肌重量是正常野生型小鼠的2～3倍，骨骼肌肌纤维的数目比野生型小鼠高出86％，但在其他生长发育性状上没有发现任何表现型的差异。而后大鼠、人、鸡、牛、绵羊、狒狒等其他物种的GDF-8基因相继得到克隆，对其功能的研究得到了与小鼠相同的结果。证实GDF-8对骨骼肌的生长具有负调控作用，所以又命名为myostatin(简写为Mstn或Ms)。
Myostatin结构具有TGF-β超家族共有的典型特征①N-端疏水的信号肽序列，可籍以跨越内质网膜，起分泌信号的作用；②前肽有一个糖基化位点；③紧挨着生物活性区由4个氨基酸(RSRR)组成一个蛋白酶加工位点；④C-端包含9个保守的半胱氨酸的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体。但myostatin与TGF-β家族其他成员的同源性很低(最高为45％)，证明是TGF-β超家族的新成员，不属于已发现的亚家族。然而，C-端区域，myostatin序列与其他TGF-β超家族的成员具有高度同源性，而其高度相关蛋白GDF-11也具有这一特性，二者在TGF-β超家族中构成了一个独特的家族。
1.2 Myostatin基因结构与遗传效应Gonzalez-Cadavid等证实人的myostatin基因位于染色体2q33.2，由3个外显子和2个内含子构成，内含子1和内含子2分别为1.8kb和2.4kb，含有三个转录起始位点，转录产物为3.1kb的mRNA。Myostatin基因表达产物是26KD的成熟糖蛋白，由375个氨基酸编码，被分泌到胞外，分泌后形成前体蛋白。在前区的糖基化位点，紧挨着生物活性区由4个氨基酸(RSRR)组成的蛋白酶加工位点，在RSRR区蛋白被酶切。酶切的N-端部分序列(266个氨基酸)包括疏水的分泌用的信号肽序列和前体蛋白序列，C-末端区(109个氨基酸)有9个半胱氨酸残基形成“Cys Knot”的结构，形成二硫键，构成myostatin成熟蛋白分泌至血液循环，组成具有生物学活性的二聚体，与受体结合发挥该蛋白的生物学功能。
1.3 Myostatin基因的同源性分析McPherron等[1]以小鼠保守的C-端cDNA为探针筛选不同物种的骨骼肌cDNA文库，克隆了大鼠、人、猪、牛、绵羊、鸡、火鸡、狒狒和斑马鱼的cDNA序列。序列分析表明，小鼠、大鼠、人、猪、鸡和火鸡的C-端成熟肽myostatin序列同源性为100％，狒狒、牛和绵羊比较仅有1～3个碱基的区别，斑马鱼与上述其他动物的同源性为88％，表明myostatin序列在不同种属间高度保守，可能与myostatin蛋白在不同种属间具有相类似的功能有关。
1.4 Myostatin基因的表达与调控原位杂交分析发现，myostatin基因在胚胎发育过程和成年个体骨骼肌中均有表达。在胚胎发育早期，该基因的表达局限在发育体节的肌节区，成年个体几乎所有骨骼肌中都表达。利用RT-PCR、Western-blotting技术研究表明，myostatin在胚胎期和成体的心脏中也可检测到其表达，该蛋白存在于心肌组织的薄肯野氏纤维和心肌细胞中，当发生心肌梗死时肌肉生长抑制素表达上调，提示肌肉生长抑制素在心肌的生长发育及冠心病等心脏疾病中具有一定的作用。Ji等证实myostatin基因在动物脂肪组织、脑、舌、心、肺、脾、小肠、肾、肝和骨髓也有有少量表达，在乳腺中也有myostatin mRNA的表达。表明myostatin基因除调控骨骼肌形成和生长外，还影响其他有关蛋白质的生长和分化。
Ma等克隆了人myostatin基因包括5’端调节区在内的全长3.3kb片段，发现myostatin启动子序列含有对多种物质的生长反应元件，包括糖皮质激素、雄激素、甲状腺激素、MDF-1、MEF-2、NF-kB等反应元件，并在体外发现，地塞米松以一种剂量依赖的方式不仅可增强myostatin启动子的转录活性，而且可增强内源性myostatin基因的表达。Lang等证明了体内myostatin的升高与IGF-I、II表达降低有关，而且myostatin的表达水平受到应激状态下糖皮质激素升高的正调控。生长激素(GH)对myostatin有抑制作用，骨骼肌细胞在添加GH后，myostatin表达降低。GH受体拮抗物有助于myostatin表达上调。
Myostatin的表达还与肌肉所受负荷密切相关。雄性成年大鼠进行17天模拟宇宙飞行后肌肉的重量显著下降，同时股二头肌、股四头肌、腓肠肌的肌肉myostatin mRNA和蛋白水平显著高于对照组。成年男性卧床25天，伴随着瘦体重、肌肉量的下降，血液myostatin浓度高于基础值12％。雌性Wistar大鼠经10天后肢悬吊，跖肌肌肉湿重下降16％，同时myostatin mRNA升高110％，其蛋白水平上升37％。以上结果表明在肌肉负荷降低的情况下如航空飞行、卧床、后肢悬吊等，肌肉量的下降与myostatin mRNA及蛋白的水平上升正相关，而运动训练可降低人和动物体内myostatin的表达水平，改善肌肉质量。
人体研究发现，肌肉生长抑制素水平随着年龄的增长而升高，中年人比年轻人高，在76～92岁的老年女性中最高，血清肌肉生长抑制素的含量与去脂体重成反比；受HIV感染肌肉重量下降的病人与健康人相比，其血液、骨骼肌中肌肉生长抑制素的免疫活性都增加，说明肌肉生长抑制素是成年人骨骼肌生长的衰减器，是HIV感染病人骨骼肌消瘦的病因，对其深入研究将有助于预防和治疗由于人体增龄、AIDS而导致的肌萎缩等疾病。
1.5 Myostatin的生物学功能1.5.1 Myostatin对骨骼肌的调控研究表明，myostatin C-末端区域对其功能的稳定性具有重要的作用，抑制性区域位于氨基酸42～115之间。利用基因敲除技术(knock-out)使小鼠的GDF-8基因C-端生物活性区域缺失，得到缺陷型突变纯合体小鼠，此小鼠可以正常存活并能够生育后代。检测其体重发现纯合突变的小鼠要比杂合体或野生型的小鼠重约30％(与性别、年龄无关)。突变纯合体小鼠肩和臀部的肌肉明显肥大，移去皮肤发现整个身体的骨骼肌都比野生型的小鼠大的多，单块肌肉的重量约为野生型小鼠的2～3倍，而脂肪重量没有太大的变化，所以骨骼肌重量增加是导致突变小鼠体重增加的主要原因。进一步检测发现突变型小鼠骨骼肌肌纤维的数目比野生型小鼠多出86％，DNA含量约高出50％，这表明突变型小鼠肌肉肥大的原因既有肌细胞的增生(hyperplasia)，也有肌纤维的肥大(hypertrophy)。
Myostatin的功能也在比利时蓝牛(Belgian Blue)和皮尔蒙特牛(Piedmontese)得到了验证。经过长期遗传选育的比利时蓝牛具有十分强壮的骨骼肌，较其它品种普通牛高29％。牛和小鼠Myostatin不但在氨基酸水平有很高的同源性(＞95％)，在功能上也是十分保守的。对“双肌症状”的比利时蓝牛和皮尔蒙特牛的myostatin基因进行测序分析结果，发现比利时蓝牛的myostatin在第三外显子含有11个核苷酸的缺失(937aa-947aa)，导致蛋白活性区的移码突变；由于发生在C区起始端7个氨基酸之后，导致随后的102个氨基酸丢失(274aa-375aa)，不能形成成熟myostatin蛋白；而皮尔蒙特牛的myostatin序列在第三外显子发生一个错义突变，使蛋白活性部位的半胱氨酸被酪氨酸取代，结果myostatin功能全部或几乎全部丧失，导致牛瘦肉率大大增加。在比利时蓝白花牛中myostatin基因缺失，导致该基因阅读框架发生改变，分子活性区域消失，出现双肌比利时蓝牛。皮埃蒙特牛的myostatin基因外显子1中C变成A，外显示子3中G变成A，从而导致双肌牛。Marcq等在分析比利时Texel双肌绵羊的可能遗传机制时发现，与普通羊相比，双肌羊myostatin基因编码区虽没有碱基差异但采用该基因侧翼序列的微卫星标记进行连锁分析表明，在双肌羊染色体2q远端区存在一个对肌肉发育产生效应的数量性状遗传位点(QTL)，该基因座位(gene locus)很可能是myostatin基因。
对人myostatin基因的研究也表明该基因与肌肉生长发育有关。myostatin基因的表达在HIV感染所引起的骨骼肌萎缩的病人中高于正常人，提示myostatin基因表达异常可能与某些肌萎缩性疾病相关。Schuelke等报告了1例myostatin基因非编码区g.IVS1+5位点纯合性G→A突变而导致该基因失活的遗传性肌肉异常发达儿童，从而证实了myostatin在调节人体骨骼肌生长发育中的重要作用。
1.5.2 Myostatin对脂肪沉积的影响Myostatin基因缺失除了影响骨骼肌发育外，还对脂肪沉积起抑制作用。Alexandra等[23]实验证明，myostatin基因突变纯合体小鼠与对照组比平均体脂肪减少70％，因此，突变纯合体小鼠体重升高的原因之一是脂肪沉积减少，可能的机制是myostatin直接作用于脂肪组织，调节其代谢过程；另一种可能是骨骼肌中myostatin信号缺乏间接影响脂肪组织中的myostatin突变，从而影响脂肪代谢。Ji等将myostatin基因敲除小鼠与野生型进行比较也得出类似的结论，myostatin敲除鼠脂肪量减少，瘦素(Leptin)分泌量也相应地减少。
Myostatin是骨骼肌细胞分泌的一种功能性糖蛋白，它可能采取自分泌、旁分泌、内分泌的方式发挥控制骨骼肌生长的功能。目前，对肌肉生长抑制素如何控制脂肪代谢的机理知之甚少。近来的一份研究报告说myostatin能在体外导致脂肪细胞(adipocytes)的分化。如果myostatin在体内也可直接作用于脂肪细胞，那么它可通过系统或原地发挥作用，已知myostatin mRNA在脂肪有表达，尽管其表达水平比在骨骼肌中稍低。或可能是脂肪组织中myostatin的突变作用是骨骼肌中myostatin信号缺乏的间接效果。例如，骨骼肌组织myostatin突变可改变能量代谢，以防止体内脂肪的积累。还有一个可能是肌肉缺乏myostatin信号会影响假设的二级信使。他们由肌肉释放，作用于脂肪组织。尚不能排除myostatin通过直接和间接的方式作用于其它组织如CNS来调节脂肪组织的可能性。间接方式的一个证据是其它遗传发生改变的小鼠在肌肉虽增加时也有类似的脂肪积累效应。例如，骨骼肌中过度表达IGF-I或ski转基因小鼠实际上均缺乏脂肪。肌肉专一性敲除胰岛素受体基因小鼠随肌肉量降低，可见到相反作用，即脂肪积累增加。
彻底阐述myostatin在体内调节脂肪代谢机制需要对遗传操作动物(genetically)进行分析，它们的myostatin信号途径成分在骨骼肌或脂肪组织中被专一性地组织。在体外将myostatin与Act RIIA和Act RIIB结合，与myostatin敲除小鼠相比，骨骼肌中表达Act RIIB显性负形式(adominant negative form)，转基因小鼠骨骼肌急剧增加，初步分析发现这些转基因小鼠的脂肪积累也下降，这与myostatin对脂肪组织的间接作用相吻合。很难对这些数据进行解释，因为尽管骨骼肌专一性肌球蛋白轻链促进子/增强子(promoter/enhancer)可用来驱动突变受体的表达，但转基因表达在脂肪组织也可检测到。虽然脂肪组织的转基因表达水平比骨骼肌中低很多，但这种低水平表达可能对阻止脂肪里的myostatin信号足够了。
1.6 Myostatin的作用机制肌肉生长是一系列复杂过程的结果，包括肌肉生成转录因子的表达与活性，成肌细胞细胞周期的退出(withdrawal)，成肌细胞在肌管中的融合以及一个抗凋亡表型的获得。肌肉生长抑制素通过抑制肌肉前体细胞的增殖而发挥功能，很可能是通过自分泌机制调控肌肉生成性分化，并且生肌素(myogenin)是其重要的作用对象。
1.6.1 Myostatin生物活性形成过程TGF-β超家族成员先以前体蛋白(precursor proteins)的形式合成，随后，在酶切位点以水解的方式加工后，成为生物活性的成熟肽进入循环系统。培养的牛成肌细胞提取物Western印迹分析表明，myostatin特异性抗体检测到了myostatin前肽(52kDa)的存在和LAP(latency-associated peptide，40kDa)形式，该实验显然表明，myostatin确实在成肌细胞中合成并且水解加工。根据已经报道的TGF-β蛋白水解加工机制以及主要结构特征，myostatin的加工位点可能就发生在保守的RSRR残基中。
1.6.2 Myostatin对成肌细胞周期的调控TGF-β超家族成员对许多哺乳动物细胞周期的G1期具有抑制作用。这种发生在细胞周期某一阶段的“停滞”(arrest)据认为与细胞周期中的许多因子有关。Myostatin主要在成肌细胞生长的G1期发挥抑制功能，抑制细胞进入S期。此外，myostatin还影响成肌细胞从G2期进入到M期。而且，这一抑制过程似乎是特异性的，因为在相似的试验中，皮尔蒙特牛myostatin基因等位基因的突变重组没有类似的抑制行为。此外，细胞培养试验表明，myostatin的抑制作用在从培养体系中将其去除后可以逆转。Myostatin有关的细胞生长性“停滞”似乎只是通过p21发生特异性调节，因为在myostatin处理的成肌细胞中，只有p21的水平被正调控。此外，p21表达增加与Cdk2蛋白表达轻微下降相关，该相关将进一步增加p21与Cdk2比率，从而导致Cdk2活性降低。因此，myostatin负调控细胞周期从G1期进入到S期，维持了卫星细胞的静息状态。
1.6.3 Myostatin的信号传导途径TGF-β超家族的信号传导是通过I型(TβRI)和II型(TβRII)受体的异二聚体复合物。在信号传导中由I型和H型丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶受体同型二聚体组成的异二聚体复合物介导的。Smads是细胞质内TGF-β信号转导分子，可直接与DNA结合，它们可以将TGF-β信号直接由细胞膜导入细胞核内。Myostatin对成肌细胞分化的抑制，正是通过Smad3抑制MyoD的活性与表达，使成肌细胞不能分化形成肌管。其机理是myostatin C-端的半胱氨酸二聚体先与II型Ser/Thr蛋白激酶受体(ActR IIB)结合，然后再与I型Ser/Thr蛋白激酶受体(ActR IB)结合，在细胞表面形成一个异源聚合体，通过II型受体的激酶活性，导致I型受体GS域的磷酸化。活化的I型受体可与胞浆内Smad2和Smad3分子的MH2暂时结合，并使C端SSXS区的丝氨酸残基磷酸化而激活。然后与无磷酸位点的Smad4形成聚合物，进入到细胞核中，MyoD的丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化受阻，阻断了碱性区与成肌细胞调控区的E-box结合，干扰有活性MyoD-E-box合成蛋白质形成，从而抑制成肌细胞向肌细胞分化以及形成肌管，阻碍了肌肉的形成。
1.7 阻断myostatin功能的研究进展利用基因敲除技术，基因打靶myostatin的小鼠肌纤维有明显的增生和增粗，脂肪含量随年龄的增长而明显降低。除了基因打靶，科学家们提出一种新的技术思路，认为不必要去掉myostatin基因，只要用一种方法对其进行功能干扰，就可以取得良好效果，其设想是C末端是靠二硫键连接的二聚体，只有两个分子连接在一起才具有生物活性。C末端二聚体和其他蛋白质包括其前肽结合构成非活性复合物，类似于TGF-β家族的前肽在体内和体外抑制TGF-β的作用。假若用转基因的方法，在动物体内产生一种可以干扰二聚体活性的蛋白质，有生理活性的myostatin二聚体就会减少，肌肉就会发育的更好。为此，他们按照这种设想生产了myostatin前肽过量表达的转基因小鼠，并对小鼠肌肉发育状况和身体状况进行了观察和分析。这些前肽与myostatin的C-端二聚体结合，形成没有活性的聚合物，也能收到良好的效果，这种myostatin前体蛋白过量表达的转基因小鼠体重增加20％～110％，其他经济性状不受干扰，小鼠可以正常繁殖。
相比之下，美国霍普金斯大学的实验结果更好。他们用一种转基因小鼠生产一种叫follistatin的蛋白，这种蛋白可以阻止myostatin与肌细胞受体的结合，从而阻止它对肌肉发育的限制，这种转基因小鼠的肌肉是非转基因小鼠的1～3倍，效果非常显著。同时，他们还有一种设想，破坏了与myostatin结合的受体，于是他们生产了一种Act RIIB非活性结构域蛋白过量表达的转基因小鼠，结果同样收到良好的效果，转基因小鼠的体重比对照小鼠重125％。Zhu等生产出一种myostatin的蛋白酶切加工位点突变的转基因小鼠，由于myostatin前体位点被切除，以释放出活性肽二聚体，该蛋白加工位点的突变造成活性肽二聚体的产生障碍，同样收到小鼠重量增加(20％-35％)的结果。
体外实验证实，FLRG和GASP-1似乎同样参与调节myostatin的C-端二聚体的活性。在人和小鼠中FLRG和GASP-1都同血液中的myostatin相结合，用重组蛋白研究的结果表明，这两种蛋白都能够以高亲和力同myostatin的C-端二聚体结合，并且抑制其活性。有趣的是，在C-端二聚体不存在的情况下，GASP-1能够直接同前肽相结合。至今，仍然没有关于这些分子在体内生物功能的遗传资料。
另一种直接针对抗myostatin生物活性的办法就是myostatin抗体。Whittemore等免疫制备了抗myostatin的抗体，并用它处理成年小鼠以验证myostatin对成年动物肌肉调节的作用，结果显示以药理剂量的myostatin抗体处理的小鼠骨骼肌数量增加，握力增强。这一研究首次显示了myostatin作为骨骼肌生成负调节因子对出生后的动物起作用，并提示myostatin抑制剂可用于临床骨骼肌发育抑制性疾病的治疗。总之，阻断myostatin信号传导途径，可能是增加动物肌肉生长有益的制剂，在人类肌肉相关疾病的治疗与农业中的应用非常有意义。
1.8 Myostatin与肌肉相关性疾病Myostatin作为肌肉生长发育抑制因子可能与肌肉相关性疾病有直接的联系。Gonzalez-Cadavid等首先证明在HIV感染出现恶病质的病人骨骼肌和血清中，myostatin表达量明显高于健康人，说明了人消耗性疾病所致的肌萎缩与myostatin的异常表达相关。Yarasheski等研究了正常人群中随年龄增长而表现的肌肉萎缩，也于血清中myostatin的升高有关。Zimmers等利用可操纵myostatin基因在体内循环表达增高的动物模型证实，体循环中高表达myostatin蛋白可以诱发动物出现明显消瘦、肌肉萎缩、眼窝凹陷等恶病质表现。Yamanouchi等发现，在一些浸润伤口的纤维母细胞中也有myostatin的表达，认为可能是由于在肌肉再生早期阶段发生的炎症过程造成的，而新生骨骼肌myostatin基因表达水平却下降。Reardon等实验证明，myostatin是次级肌纤维的肌萎缩因子。Krik等通过对照实验发现在再生的肌管部分，myostatin含量极低，说明myostatin对肌肉再生起负调控作用。
最近的研究报道确实了myostatin参与肌营养不良的病理发生，在mdx(Duchennemuscular dystrophy，DMD)表型小鼠中阻断myostatin蛋白的表达能够缓解mdx小鼠的肌肉萎缩症状。Bogdanovich等利用自制的小鼠myostatin蛋白抗体治疗杜氏肌营养不良模型小鼠(DMD)，治疗组比对照组小鼠相比，肌肉质量，肌张力强度明显增强，患病的治疗小鼠症状明显改善。Wagner等利用myostatin基因突变的蛋自的纯合体小鼠与具有DMD及BMD(Becker muscular dystrophy)表型的mdx小鼠杂交，在后代中筛选myostatin突变的mdx小鼠，这些小鼠比mdx小鼠更强壮并富有肌肉，表明阻断myostatin基因表达可能缓解肌营养不良患者的肌萎缩表型。Myostatin拮抗剂还可以用来治疗横纹肌肉瘤。Sharma等实验表明，当心肌梗塞时，在受损部位周围的心肌细胞myostatin表达上调，推测myostatin在心肌病理和生理过程中期起重要作用。2004年，Schuelke等报告了1例因myostatin基因非编码区g.IVS1+5位点纯合性G→A突变而导致基因失活的遗传性肌肉异常发达儿童病例，从而证实了myostatin在人肌细胞生长调控中的重要作用。
研究发现，myostatin基因缺失小鼠(Mstn-/-mice)不但表现为肌肉增生、肥大、而且伴随脂肪堆积减少。随后用肥胖和糖尿病两种模型小鼠证实，myostatin基因缺失后能有效抑制脂肪堆积和糖代谢紊乱，为治疗肥胖和II型糖尿病提供了新的药物作用靶点。
2 治疗性疫苗1902年，Wright用加热灭活的金黄色葡萄球菌疫苗治疗复发性疾病，并提出了疫苗疗法学说而成为现代疫苗疗法的奠基人。治疗性疫苗(Therapeutic Vaccine)是指能够打破慢性感染者体内免疫耐受！重建或增强免疫应答的新型疫苗。治疗性疫苗能在已患病个体诱导特异性免疫应答，消除病原体或异常细胞，使疾病得以治疗，是抗病毒、抗肿瘤的新治疗手段。主要应用于目前尚无有效治疗药物的疾病，如慢性病毒感染、过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。治疗性疫苗作为一种新型的以治疗为目的的疫苗，是传染病综合性治疗中一种提高免疫应答能力的辅助手段，与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展就要缓慢的多。但是，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功，预示着能够在体内诱导抗体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。
2.1 治疗性疫苗的基本特征治疗性疫苗作为一种新型的以治疗为主要目的的疫苗，在设计思路、制备手段及应用技术方面均体现多元化、多层面和与现代分子生物学及细胞学技术密切结合的特点，其复杂程度远远超出传统的预防性疫苗。治疗性疫苗的应用对象则是已感染病毒微生物的持续性感染的个体，应用较为严格、应有选择的使用，疫苗成份可根据需要作各种组合，旨在打破机体的免疫耐受，提高机体的免疫应答，属于免疫治疗范畴，可能伴有免疫损伤，有一定的副作用。然而目前许多传染病、肿瘤等疾病尚无有效的治疗药物，相比之下，治疗性疫苗的副作用远比药物小得多。另外治疗性疫苗作为传染病综合治疗中的一种提高免疫力的辅助手段，对某些至今尚无有效治疗手段的人类某些疾病，如乙肝、麻风、利什曼病菌、布氏杆菌病等具有一定的治疗作用。
动物试验表明可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病通过主动免疫诱导出TNF-α特异性的中和性抗体，可以治疗动物关节炎；针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1(NMDAR1)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotro-pin，HCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(GnRH)的疫苗可以治疗晚期前列腺病人；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。
2.2 治疗性疫苗的分类治疗性疫苗按组成成份主要分为以下三类2.2.1 蛋白质复合重组治疗性疫苗治疗性疫苗靶抗原的结构或组合需相近又有异于传统疫苗的靶抗原，能唤起患病机体的功能性免疫应答。实践证明可从三方面对蛋白质疫苗进行改造在蛋白质水平上进行修饰，如脂蛋白化；在组合上进行多蛋白的复合及多肽偶联；在结构或构型上加以改造，如固相化、交联、结构外显及构象限定等。
作为理想的免疫原，抗原分子中可同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，可诱导出度高特异性的体液或细胞免疫反应，从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用，因此可赋予较广的保护性。通过设计隐藏于抗原分子内部的表位可增强抗原的免疫原性，泛DR辅助T细胞表位(pan-DR helper T cell epitopes，PADRE)或通用T细胞表位(universal T epitope)以高亲和力与人群常见人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)分子结合，较少受MHC限制。制备表位疫苗的关键是要确定可被免疫细胞识别的特异性多肽。因此表位的鉴定是构建表位疫苗的第一步。鉴定表位常用的方法有①酶解法；②用噬菌体显示肽库技术筛选模拟表位；③洗脱法将表位从MHC分子或单抗上洗脱下来，进行测序；④合成重叠肽法；⑤用计算机软件分析整个基因组，将预测获得的候选表位肽再以实验方法验证，能够快速准确的鉴定出抗原表位。由于表位多肽分子量小，易被细胞内的蛋白酶降解，可通过各种方法来增强其免疫原性。将B细胞表位与载体蛋白如牛血清白蛋白(bovine serus albumin，BSA)或匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或破伤风类毒素等相偶联，所产生的保护力可与大分子抗原相比。
在疟疾疫苗研制中，Birkett等将多种环子孢子蛋白的B细胞表位和T细胞表位与乙肝病毒表面抗原或核心抗原串联重组后免疫人体，可激发机体产生高水平的抗体和Th1型细胞免疫应答，而且以合适的佐剂免疫人体后对恶性疟原虫攻击感染产生了50％的保护力。
2.2.2细胞疫苗以细胞为组成的疫苗主要有肿瘤细胞和树突状细胞(DC)疫苗。以各种辅助分子修饰肿瘤细胞或DC可增强其免疫原性，达到治疗的目的。树突状细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞，能合成大量的MHC II类分子；具有摄取和转运抗原的特殊膜受体；能有效摄取和处理抗原然后迁移至T细胞区域，具有一个成熟化的过程；能强有力地激活幼稚型T细胞，少量的抗原和少量的树突状细胞即足以激活T细胞。
DC可诱导很强的初次免疫应答，而巨噬细胞及B细胞等其它抗原提呈细胞只能激活已受抗原刺激的T细胞。机体抗肿瘤免疫反应的主要形式是细胞免疫，而激发机体产生有效的抗肿瘤细胞免疫应答，是提高免疗疗效的关键，有效的抗肿瘤细胞免疫反应的核心是产生CD8+的细胞毒性T细胞。树突状细胞一般通过巨胞饮、受体介导的内吞及吞噬3种方式摄取抗原，并可直接向CD8+CTL提呈抗原，启动CTL细胞的杀伤活性。
目前，应用树突状细胞回输疗法治疗的肿瘤包括多发性骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺癌和结直肠癌等，临床应用I、II期试验取得了令人鼓舞的结果。
2.2.3 核酸疫苗核酸疫苗是近年来备受人们关注的一种新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗及RNA疫苗，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。DNA疫苗经肌肉注射或基因枪导入机体后，可被宿主细胞摄取，进入宿主细胞的细胞核中转录为mRNA，再在胞浆中翻译成蛋白质。一部分蛋白质在降解后与MHC I类分子结合，并被提呈到细胞的表面被CD8+T细胞的受体识别，而激活细胞毒T细胞的活性，杀伤靶细胞；而另一部分蛋白质也可以分泌出去，再像外源蛋白一样被抗原提呈细胞摄取，在吞噬溶酶体内降解成多肽，进一步与MHC II类分子结合，并由抗原提呈细胞提呈到细胞表面被Th2细胞的受体识别，然后由Th2细胞分泌的细胞因子作用于B细胞，而刺激以产生抗体为主的体液免疫反应。
与其他疫苗相比，DNA疫苗具有许多优点①提供给免疫系统天然的抗原形式，没有病原体可能在体内复制和复制后致病的危险不存在毒力返祖或突变。②免疫应答全面，可同时引起细胞免疫和体液免疫，而且能诱导细胞毒性T淋巴细胞，从而预防细胞内感染性疾病。研究者将编码流感病毒A核蛋白的DNA插入载体质粒，注射于鼠股四头肌，成功的生产了保护性CTL。Davis等还发现，HBVenvAg基因免疫的CTL应答是纯化HBVenvAg免疫的CTL应答的100倍。③单次接种可诱导长期或终身免疫。Davis等在基因免疫过程中仅注射一针。1周后测的良好的免疫应答，并在1个月内持续升高，保持了至少17个月。④生产迅速简便，成本低廉。⑤无须冷藏，易于保存和运输。⑥易于针对相同或不同病原体的几种抗原分子进行联合接种，提供了设计新的联合疫苗的可能。⑦核酸疫苗还能完善婴儿的抗体应答，促进细胞内抗原的消除，防止母体抗体介导的抑制。
然而DNA疫苗还存在很多不足之处①刺激机体免疫反应的能力比自然感染弱。②目的基因的表达不够理想；③体内蛋白的表达能持续多久有待进一步研究，④导入机体的外援DNA有整合的潜在危险，而且DNA免疫接种后可能引起免疫系统本身的功能紊乱。因而，进一步的深入研究，进行安全性和长期效果观察，全面权衡核酸疫苗的利弊，综合评价其效益和危险性是当前核酸疫苗研究的新课题。
抗原提呈细胞在DNA疫苗诱导的免疫反应中起着重要的作用，但DNA疫苗的主要局限在于其引起的免疫效率太低，即仅有很少部分的提呈细胞被外源DNA转染，因此，如何改进DNA疫苗以提高抗原提呈细胞对目的抗原的吸收和提呈成为众多学者研究的方向。You等将编码IgG Fc段的基因与HBV e抗原基因融合，制成DNA疫苗，这种DNA疫苗无论在CD4+辅助细胞，CD8+细胞毒性T细胞，还是B细胞反应上都较单纯e抗原的DNA疫苗高。Hung等分别构建了表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白以及E7和VP22连接蛋白的DNA疫苗，然后将疫苗皮内接种于实验小鼠，结果发现VP22/E7 DNA疫苗产生的E7-特异性CD8+T细胞较单纯E7 DNA疫苗产生的E72特异性CD8+T细胞高50倍。多种抗原表位的组合是提高DNA疫苗的免疫原性的有效策略。
从1995年开始，美国FDA生物制品审核和研究中心已经批准了6种人的DNA疫苗的临床试验，包括艾滋病、流感、单纯疱疹、乙型肝炎、疟疾和癌胚抗原的DNA疫苗。由于DNA疫苗是一种新型疫苗，目前大多数DNA疫苗处于第I期临床试验阶段，其主要目的是证明疫苗的安全性和免疫原性。数年临床观察尚未发现疫苗的DNA分子会整合到染色体中或诱发自身免疫病的可能性。令人鼓舞的是疟疾DNA疫苗已进入第III期临床试验。
2.3治疗性疫苗的作用机理治疗性疫苗应用对象为已感染病毒的个体，此时机体因已具有病毒的抗原，但由于机体免疫应答部份低下且欠缺，不能支撑正常作用，治疗性疫苗通过不同途径将微生物抗原提呈免疫系统，来弥补或激发机体的免疫应答反应(尤其是细胞毒性，淋巴细胞的杀伤活性)从而达到清除病毒的治疗作用。另有学者认为，机体接受治疗性疫苗后，刺激T/B细胞增殖，激活巨噬细胞，促进NK细胞杀伤肿瘤细胞，从而发挥增强作用。例如，卡介苗治疗肿瘤，就是通过增强机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用而治疗肿瘤，使患者的免疫系统在对新的基因重组体产生反应的同时，也排斥打击自身类似病原，从而达到治疗的效果。另外，抗原-抗体复合物型治疗性疫苗的作用机理可能为抗体对抗原的凝集作用，组成较大分子，易被吞噬及抗原提呈；抗体与抗原结合后，通过Fc段与抗原提呈细胞的Fc受体结合，改变了抗原提呈的过程，更有利于诱生抗体或CTL；抗原-抗体复合物可激活多种淋巴因子的释放，通过淋巴因子间的相互作用，更促进了抗原的提呈与加工及活化CTL或Th细胞；免疫网络系统可进一步发挥作用；抗原-抗体激活补体系统，有利于裂解有无膜的病毒；抗原-抗体复合物本身可作为佐剂加强抗原的免疫原性。
在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生抗体当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHC II类分子的复合物。通常，B细胞不能激活TH细胞。要激活TH细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHC II类分子的复合物，激活TH细胞。激活后的TH细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHC II类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏TH细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一起，就有可能绕过TH细胞耐受自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHC II类分子的复合物，由于TH细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。
与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和TH细胞的共同作用就会被激活[88]。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。利用这种策略，已经被诱导出针对多种自身激素的抗体反应。
膜结合蛋白和以多价形式存在的蛋白能诱导B细胞免疫无能，即在通常情况下对抗原刺激无反应，有的甚至可以导致特异性B细胞克隆的剔除。虽然不可能刺激被剔除的特异性B细胞克隆，但是通过适当的免疫策略，B细胞免疫无能有可能被打破。高拷贝数的抗原能有效地和B细胞受体交联，提供强烈的激活刺激，从而打破B细胞耐受。有人已经证实与病毒样颗粒(VLPs)偶联的多拷贝TNF-α诱导的抗体反应比单体TNF-α诱导的要强得多。这说明使抗原能够被高度识别，从而打破B细胞耐受是可能的。这一方法还有可能解决利用佐剂的问题，因为与VLPs偶联的抗原在没有佐剂的情况下可以诱导出强的抗体反应。与VLPs偶联的抗原不仅在小鼠体内具有高度的抗原性，而且在人体内也具有高度的抗原性。50μg与VLPs偶联的多肽或化学物质在没有佐剂的情况下就可以在人体内诱导出较强的抗体反应。因为后者造价较低，病人容易接受并产生良好的顺应性。
目前，有大约500种生物制品药物正在进行临床研究，其中有近100种疫苗，主要是针对肿瘤和感染性疾病的。很少一部分针对慢性疾病和药物成瘾性的治疗性疫苗代表了此类产品的第一代，一种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗已经开始临床试验，还有许多针对自身抗原的治疗性疫苗临床前试验进展顺利。
2.4治疗性疫苗的改进策略疫苗的免疫与病理机制比较复杂，如治疗性疫苗所激活的免疫反应，细胞是防护性的还是病理性的尚不明确等，造成疫苗疗法的效果并不十分稳定、理想，在实际应用中还不够成熟。因此如何发挥免疫调节，怎样抑制持续性病毒感染等，这些问题是研制治疗性疫苗的前提，在设计治疗性疫苗时，选择何种优势抗原，免疫刺激和免疫抑制剂作为佐剂等技术问题均应比较和推敲。
由此可见，可以从以下几方面发展治疗性疫苗①选择最有利的抗原构象进行接种，增强免疫原性；②发展不同病毒间的重组抗原，病毒与细胞因子融合的嵌合抗原，病毒抗原修饰等，以诱导有效的免疫应答；③将抗原与重组免疫应答基因产生蛋白一起接种，以便被CD8或CD4表面阳性细胞迅速识别；④增加免疫辅助因子及应用新型佐剂；⑤运用新型免疫技术，如DNA免疫技术，抗原化抗体等；⑥直接将编码MHC I类或MHCII类蛋白基因引入机体，使抗原、细胞因子和其他免疫应答基因产物在体内表达处理，在最佳状态下提呈给免疫系统。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗及其制备方法，为肌肉相关疾病治疗提供新的药物。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗，利用人工合成DNA的方法获得了在N-端连接了Th细胞辅助表位TT830-844人myostatin C-末端区基因片段，其基因序列为TT-Ms，对应的氨基酸序列具体如下Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Phe Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr20 25 30Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe35 40 45Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys50 55 60Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His65 70 75 80Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr85 90 95Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu100 105 110Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys115 120 125Ser *** Val Asp130将合成的TT-Ms基因片段克隆至pQE30原核表达载体，构建pQE-TT-Ms重组表达载体，利用PCR扩增Ms基因片段，构建了pQE-Ms重组表达载体；在大肠杆菌中表达了融合蛋白His-TT-Ms和His-Ms，对蛋白进行鉴定后作为myostatin的蛋白疫苗；将合成的TT-Ms基因片段克隆至pVAC1-cms基因疫苗专用质粒，构建了pVAC-TT-Ms重组质粒，体外进行了目的蛋白表达的鉴定，作为myostatin基因疫苗。
本发明的方法所构建的Myostatin蛋白疫苗和基因疫苗，基因疫苗时选用了基因疫苗专用质粒pVAC1-cms，构建蛋白疫苗选用了融合表达6His的质粒pQE30，以提高表达蛋白的免疫原性。免疫健康成年BALB/c小鼠，可诱导出针对人myostatin分子的特异性抗体，免疫小鼠骨骼肌质量和力量明显提高。
图1是His-Ms表达、纯化和鉴定结果。其中，图(A)是His-Ms在大肠杆菌中明显表达，图(B)是Ni亲和色谱柱纯化目的蛋白His-Ms，纯度在90％以上。图(C)是纯化后的His-Ms融合蛋白进行免疫印迹鉴定，发现新生蛋白条带能够与抗GDF-8多抗及抗His单抗发生特异性结合。
图2是His-TT-Ms表达、纯化和鉴定结果。其中，图(A)是His-TT-Ms在大肠杆菌中明显表达，图(B)是Ni亲和色谱柱纯化目的蛋白His-TT-Ms，纯度在90％以上。图(C)是纯化后的His-TT-Ms融合蛋白进行免疫印迹鉴定，发现新生蛋白条带能够与抗GDF-8多抗及抗His单抗发生特异性结合。
图3是pVAC-TT-Ms质粒纯化和体外表达检测结果。其中，图(A)结果显示，pVAC-cms质粒OD260/OD280为1.78(1.25ug/ul)，pVAC-TT-Ms质粒OD260/OD280为1.82(1.32ug/ul)，说明质粒基本不含蛋白质等杂物，电泳分析表明质粒超螺旋、螺旋和线形条带明晰。图(B)为纯化质粒转染CHO细胞，RT-PCR结果检测到目的基因有明显的转录；图(C)为细胞免疫组化检测到目的蛋白在真核细胞表达。
图4是以ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度pVAC-TT-Ms重组质粒免疫动物结果显示，在每组测定的6只小鼠中，有4只免疫后有抗体产生(图A)，平均抗体滴度在2×103以上(图B)。Myostatin蛋白疫苗免疫动物结果显示，在每组测定的6只小鼠中，His-Ms组在2×102稀释度有2只小鼠免疫后有抗体反应(图C)，平均抗体滴度在2×102以上(图E)。而His-TT-Ms组在2×102稀释度有3只免疫后有抗体反应，在2×103稀释度有1只免疫后有抗体反应(图D)，平均抗体滴度在2×103以上(图E)。
图5是myostatin基因疫苗免疫小鼠的体重变化(图A)和蛋白疫苗免疫小鼠的体重变化(图B)。
图6是免疫小鼠肌肉质量的变化。结果显示，与正常对照组比较，插入TT表位的基因疫苗pVAC-TT-Ms组和蛋白疫苗His-TT-Ms组小鼠股四头肌、腓肠肌和胸大肌重量显著增加增加，而His-TT组小鼠胸大肌重量与对照组有明显增加外，其余两补肌肉组织股四头肌和腓肠肌重量虽有增加，但无显著性。pVAC-TT-Ms基因疫苗免疫对小鼠股四头肌、腓肠肌和胸大肌重量的影响略好于His-TT-Ms蛋白疫苗。免疫小鼠腹腔游离脂肪组织的平均重量各组之间无明显差别。
图7是免疫小鼠肌肉组织形态变化。结果显示，基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫小鼠和蛋白疫苗His-TT-Ms免疫小鼠股四头肌细胞有肥大现象。
图8是免疫小鼠前肢握力变化。结果显示，针对myostatin的基因疫苗和蛋白疫苗可明显增强小鼠前肢的握力，与正常对照组比较，pVAC组无明显变化，基因疫苗pVAC-TT-Ms组小鼠前肢握力平均增加了30.9％，蛋白疫苗His-Ms组和His-TT-Ms组分别增加了26.6％和29.6％，说明针对myostatin的疫苗免疫动物可明显提高动物肌肉的力量。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
具体实施例方式
本发明利用合成基因的方法人工合成了myostatin C-末端区(133个氨基酸)基因序列，构建了针对myostatin的基因疫苗和蛋白疫苗两种治疗性疫苗。为了打破myostatin疫苗的免疫耐受和加强疫苗免疫原性，在构建myostatin蛋白疫苗和基因疫苗时在其N-端插入了来源于破伤风毒素的具有激活Th细胞作用的通用Th细胞表位TT830-844，以增强myostatin两种治疗性疫苗的免疫效果。利用抗原表达载体对抗原免疫原性的影响，构建基因疫苗时选用了基因疫达蛋白的免疫原性。免疫健康成年BALB/c小鼠，可诱导出针对人myostatin分子的特异苗专用质粒pVAC1-cms，构建蛋白疫苗选用了融合表达6His的质粒pQE30，以提高表性抗体，免疫小鼠骨骼肌质量和力量明显提高。具体内容是1合成TT-Ms基因序列合成N-端插入TT表位的人myostatin成熟肽C-末端基因序列(133aa)，合成的基因序列简写为TT-Ms，TT-Ms对应的氨基酸序列具体如下Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Phe Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr20 25 30Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe35 40 45Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys50 55 60
Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His65 70 75 80Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr85 90 95Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu100 105 110Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys115 120 125Ser *** Val Asp130合成PCR两对引物P1和P2与P3和P4。引物P1和P2将5’端和3’端的酶切位点分别突变为BamH I和Sal I，以构建pQE-Ms重组质粒；引物P3和P4将5’端和3’端的酶切位点分别突变为BamH I和EcoR I，以完成与pVAC1-cms质粒的重组。
Primer15’CG GGATCC GATTTTGGTCTTGACTGTG 3’Primer25’GCGTCGACTCATGAGCACCCACAGCG 3’Primer35’CG GGATCC CAGTATATAAAAGCAAATTCT 3’Primer45’GCGAATTCTCATGAGCACCCACAGCG 3’2基因克隆及载体构建2.1重组质粒pQE-TT-Ms和pQE-Ms的构建用BamH I和SalI双酶切pQE30质粒，质粒大片段与合成的TT-Ms基因序列连接，构建pQE-TT-Ms；用BamH I和Sal I双酶切pQE30质粒和PCR产物Ms，再进行连接。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定和DNA序列分析。将测序正确者命名为pQE-Ms和pQE-TT-Ms。
2.2重组质粒pVAC-TT-Ms的构建以pQE-TT-Ms为模板，应用合成引物1和引物2将pQE-TT-Ms 5’端和3’端的酶切位点分别突变为BamH I和EcoR I。PCR扩增取1μL pQE30-TT-Ms质粒为模板，加入10×PCR缓冲液5μl，25mmol/L MgCl25Ml，25mmol/L 4×dNTPs 1μl，25μM的引物2、3各1μl，加入TaqDNA聚合酶1μl，用水补足体积至50μl。然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为95℃预变性5min后，按下列参数循环30次94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸10min。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段。用BamH I和EcoR I双酶切pVAC1-cms质粒和回收的基因片段，回收的质粒大片段与TT-Ms片段连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定和DNA序列分析，将测序正确者命名为pVAC-TT-Ms。
3重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定3.1重组蛋白的诱导表达重组质粒pQE-TT-Ms和pQE-Ms转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中，37℃培养2小时至对数生长中期，OD600nm值在0.4～0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，收集菌体进行SDS-PAGE。
3.2目的蛋白的纯化与鉴定SDS-PAGE取500μl诱导或未诱导的菌液离心收集沉淀，加入30μl水及30μl的2×载样缓冲液(5％β-巯基乙醇，4％SDS，20％甘油，100mmol/L Tris·HCl，pH6.8，0.2％溴酚蓝)，振荡混匀后，沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μl上清加样于15％分离胶和6％浓缩胶。上样后恒压90V电泳，样品进入分离胶后电压升至120V电泳1h。
包涵体的分离和初步纯化按1克菌体加入10ml的STE缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris·HCl(pH8.0))的比例将菌体重悬，然后于冰浴中进行超声裂菌，超声时间5s，间隔时间10s，功率200W，破碎15min，4℃离心15min，12000rpm，弃上清液，收集沉淀。用洗涤液(2MUrea，2％TritonX-100，STE)洗涤沉淀(按1克菌体加入20ml洗涤液)，4℃搅拌1h，12000rpm 4℃离心15min，弃上清液，再收集沉淀。重复洗两次。
将沉淀在变性缓冲液(8M尿素，10mM Tris·HCl(PH 8.0)，100mM NaH2PO4)室温搅拌3～5h，彻底溶解。12000rpm 4℃离心10min，收集上清，用镍亲和色谱层析柱(Ni柱)纯化目的蛋白。
用变性A液(8M Urea，10mM Tris·HCl(PH 8.0)，100mM NaH2PO4)充分平衡Ni柱，上样后，用含30mM咪唑的A液洗脱杂蛋白，再用含250mMl咪唑的A液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，透析复性。
蛋白免疫印迹(Western blot)SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mmol/L Tris，192mmol/L Glycine，20％甲醇)中100V恒压1小时电泳，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％ Tween20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃1小时，TBST室温洗3次，每次5min，分别加入兔抗人GDF-8多克隆抗体(dilution 1∶1000)和鼠抗His单克隆抗体(dilution1∶1000)，37℃孵育1小时，TBST洗3次，分别加入羊抗兔IgG-AP和兔抗鼠IgG-AP，37℃孵育1小时，TBST洗3次，再用TBS(20mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCl)洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应。
蛋白透析复性收集Ni柱的洗脱液，采用尿素浓度梯度透析方法透析纯化蛋白至H2O溶液。
4工程菌的培养在实验室研究阶段，申请人采用三角摇瓶对工程菌进行培养，具体步骤如下1％活化的工程菌接种于含200ml LB培养基的500ml摇瓶中，37℃振摇2.5h至对数生长中期，OD600约0.4～0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4h，4500rpm离心15min，收集菌体，立即进行裂菌或者-20℃保存备用。
5重组质粒的扩增和纯化5.1重组质粒的扩增重组质粒pVAC-TT-Ms，转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于10ml含zeocin抗生素的LB培养基中培养8h，再按1∶100的比例接种于200ml含zeocin抗生素的LB培养基，摇菌25h，200rpm，37℃，收菌。
5.2宿主菌的收获和碱裂解用合适转头于4℃以4000rpm离心20分钟，弃上清，将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
将冼过的500ml培养物的细菌沉淀物重悬于10ml(18ml)溶液I中(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌15min，贮存于4℃)。加2ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mmol/L Tris·Cl(pH8.0))，再加20ml(40ml)新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，充分混匀内容物，于室温放置5～10min。加15nl(20ml)用冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10min，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。
用合适转头于4℃以4000rpm离心15min，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000rpm再度离心20min，然后小心将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。用合适转头于室温以500rpm离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴斯德吸管吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽，用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
5.3质粒的纯化(聚乙二醇沉淀法)将核酸溶液转入15ml Corex管中，再加3ml用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4℃下以10000rpm离心10min。将上清转移到另一30ml Corex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10000rpm离心10min，回收沉淀的核酸。小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴斯德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
用500μl含无DNase的胰RNase(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置3min。加500μl含13％(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5min，以回收质粒DNA。吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚∶氯仿、氯仿各抽1次。将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积(约1ml)乙醇，于室温放置10min，于4℃以12000g离心5min，以回收沉淀的质粒DNA。吸去上清，加200μl处于4℃以12000g离心2min。吸去上清，敞开管口，使痕量乙醇蒸发殆尽。用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1∶100稀释(用TE(pH8.0))后测量OD260/OD280，计算质粒DNA的浓度(1OD260＝50μg质粒DNA/ml)，然后将DNA贮于-20℃。
6重组蛋白的真核表达6.1真核细胞转染与蛋白的表达CHO细胞用含100ml/L胎牛血清的低糖DMEM培养基于37℃ 50ml/L CO2条件下在培养。以一定密度分别接种于含盖玻片的6孔板中，继续培养24～48h，使80％以上的细胞贴壁。吸出培养液，用无血清无抗生素的DMEM将细胞冲洗两遍。取2μg DNA溶于100μl无血清无抗生素DMEM培养液中，称为A液。将10μl LipofectAMINETM2000溶于90μl无血清无抗生素的DMEM培养液中，放置10min，称为B液。将A、B两液混合，室温孵育30min，使其形成DNA-liposome复合物。在复合物中加入800μl无血清无抗生素的DMEM培养液，轻轻混匀，缓缓滴加至洗过的细胞中，于37℃、50ml/LCO2条件下培养7h。吸弃转染液，加入1ml含200ml/L小牛血清的无抗生素的DMEM培养液，于37℃、50ml/L CO2条件下继续培养36h后，进行目的蛋白瞬时表达的检测。
7构建疫苗的鉴定以Western Blot来鉴定蛋白疫苗的构建。
SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mmol/L Tris，192mmol/L Glycine，20％甲醇)中100V恒压1小时电泳，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％ Tween20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃1小时，TBST室温洗3次，每次5min，分别加入兔抗人GDF-8多克隆抗体(dilution 1∶1000)和鼠抗His单克隆抗体(dilution1∶1000)，37℃孵育1小时，TBST洗3次，分别加入羊抗兔IgG-AP和兔抗鼠IgG-AP，37℃孵育1小时，TBST洗3次，再用TBS(20mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCl)洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应。
8真核表达蛋白的检测8.1细胞免疫组化取出盖玻片，PBS缓冲液漂洗3次，预冷的丙酮固定细胞10min，再用PBS漂洗3次，在盖玻片滴加10％小牛血清，室温封闭30min，吸掉。滴加兔抗人GDF-8多克隆抗体后4℃冰箱放置过夜或37℃孵育60min，PBS振洗3次，每次5min。滴加FITC标记的羊抗兔IgG，37℃孵育60min，PBS振洗3次，每次5min。甘油封片后立即于荧光显微镜下观察并照相。以PBS替代一抗作阴性对照。
8.2 RT-PCR细胞总RNA的提取取转染后的CHO细胞，弃培养液后加入1ml的Trizol(4℃预冷)，用枪不断吹洗培养瓶底5min，使细胞彻底裂解。将细胞裂解液吸出装入小离心管，12000rpm 4℃离心10min，取上清于室温放置5min；加入0.2ml氯仿后剧烈震荡，使其充分混合，室温放置5min；12000rpm 4℃离心15min使之分为水相和有机相两层，小心取出RNA所在的水相(最上层)，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min；12000rpm 4℃离心10min，弃上清；加入用不含RNA酶的水配制的75％乙醇，洗涤沉淀一次；7500rpm 4℃离心5min，弃上清；室温干燥RNA 10min；取10μl不含RNA酶的水加入离心管中溶解RNA；核酸定量分析仪检测OD260/OD280及RNA含量。
逆转录反应(RT)12μl的反应体系中加入提取的总RNA(1μg)、Oligo(dT)1μl、dNTP 2μl和DEPC水，放置于65℃水浴中5min，然后置于冰上。将4μl cDNA合成缓冲液、1μl DTT、1μl RNaseOUT(40U/ml)、lμl DEPC水和lμl反转录酶混合(共8μl)，再加入上述12μl反应体系中，并充分混合，50℃孵育30～60min；85℃孵育5min；加入1μl的RNaseH并于37℃孵育20min即可得到cDNA。cDNA产物可以于-20℃保存或立即进行PCR反应。
PCR反应建立50μl的反应体系，分别加入10×PCR反应缓冲液5μl、dNTP 3μl、上、下游引物(引物2、3)各1μl、cDNA产物10μl和水30μl。然后进行PCR反应，95℃预变性5min后，加入TaqDNA聚合酶。按下列参数循环30次94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸10min。
9免疫动物实验Myostatin基因疫苗和蛋白疫苗可以在小鼠体内诱导出针对该蛋白的抗血清，候选基因疫苗和蛋白疫苗免疫的动物体重增加，肌细胞有肥大现象，肌肉质量和前肢握力明显增加。
9.1实验动物实验动物为雄性BALB/c小鼠，体重12～14g，购自第四军医大学实验动物中心，适应性喂养1周后进行免疫。
9.2小鼠免疫方法将50只小鼠分成5组，每组10只，分别为正常对照组、pVAC组、pVAC-TT-Ms组、His-Ms组、His-TT-Ms组。
蛋白疫苗His-Ms组和His-TT-Ms组免疫抗原为纯化后透析至H2O的析出蛋白沉淀，剂量为100μg/只，每两周免疫一次动物，免疫4次，腹腔注射免疫，最后一次免疫后20天取样检验。
基因疫苗pVAC-TT-Ms组免疫抗原为纯化质粒pVAC1-cms和纯化并在体外能表达蛋白的质粒pVAC-TT-Ms，剂量为100μg/只，股四头肌内注射，每两周免疫一次动物，免疫4次，最后一次免疫后20天取样。正常对照组动物不做任何处理。
9.3 ELISA测定血清抗体滴度9.3.1 ELISA测定基因疫苗免疫小鼠血清抗体滴度所需溶液的配制包被缓冲液Na2CO30.32g(终浓度0.015mol/L)，NaHCO30.59g(终浓度0.035mol/L)，纯水定容至200ml(pH 9.6)。
洗涤液(含0.05％ Tween-20的PBS(pH 7.4)。
封闭液含1％ BSA的洗涤液。
稀释液含0.5％ BSA的洗涤液。
底物缓冲液Na2HPO4·12H2O 1.84g，柠檬酸0.51g，纯水定容至100ml(pH5.0)。
底物显色液OPD 8mg，30％H2O230μl，底物缓冲液10ml。
终止液1mol/L H2SO4操作方法取96孔ELISA板，将纯化透析至双蒸水中的上清可溶性蛋白His-Ms用包被缓冲液稀释(2～5μg/ml)，加入板孔中(100μl/孔)，4℃包被过夜。倒掉包被液，加入封闭液，37℃封闭2h。弃去封闭液，用洗涤液洗6次，每次3min。加入20倍倍比稀释的抗血清(从200倍起)，100μl/孔，37℃孵育1h。弃去抗血清，用洗涤液洗6次，每次3min。加入HRP标记的羊抗兔的二抗，100μl/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，用洗涤液洗6次，每次3min。加入底物显色液，100μl/孔，37℃，显色10～20min。加入终止液，100μl/孔，终止反应。酶标仪读数，测定每孔在450nm的吸光值。
9.3.2细胞ELISA测定蛋白疫苗免疫小鼠血清抗体滴度CHO细胞用0.25％胰酶消化后，调整细胞浓度为1.0×106/ml，以200μl孔加入96孔细胞培养板，37℃，5％ CO2培养箱中培养24h，80％细胞充分贴壁生长后质粒pVAC-TT-Ms和pVAC转染细胞，方法同前。转染36h后，吸去培养液，37℃干燥后用0.025％戊二醛(PBS配制，pH7.4)室温固定20min，PBS洗孔3遍。每孔加入200μl含3％ H2O2PBS，室温反应20min，PBS洗孔3遍。在细胞包被孔中分别加入不同稀释度的待测血清，每孔200μl，设复孔，阴性对照，37℃温箱反应1h，用洗液洗3遍。加入1∶10000生物素化的羊抗小鼠IgG抗体，每孔200μl，37℃反应1h，洗孔3遍，甩干。加入1∶200亲和素化辣根过氧化物酶，每孔200μl，37℃反应30min，洗孔3遍。加OPD-H2O2底物200μl，37℃避光反应，加2M H2SO4终止反应。酶标仪测OD490nm值。
9.4血清常规指标测定方法全自动生化分析仪检测血清指标总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、胆固醇(CHO)、甘油三脂(TG)、肌酸激酶(CK)。检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
9.5骨骼肌形态分析方法9.5.1骨骼肌组化肌肉组织分离，在固定液(10％中性福尔马林，50mmol/L PBS，pH 7.2)中4℃固定24h，固定完全后在肌中间最隆起的部位切片，置于溶液(5％蔗糖，50mmol/L PBS，pH7.2)中4℃过夜，冷50％丙酮脱水，置于纯丙酮脱水2次，二甲苯透明，浸蜡，石蜡(54℃～56℃)包埋，切片，HE(hematoxylin and eosin)染色，显微镜观察。
3.5.2肌纤维横截面积统计利用Scion Image 4.02软件(http://www.scioncorp.com)，按Lee等[18]报道对肌纤维细胞的面积进行了统计分析。
9.6握力测试方法参照Peled-Kamar等[116]报道的方法，在离地80cm高处紧绑一根直径2mm的绳子，让小鼠前肢握住绳子，开始计时，到后肢接触到绳子为止，若前肢和后肢同时握住绳子时间超过10s，即为一次成功的握力测试。在小鼠处死前1d和前4d对其前肢握力进行了两次测试，每次有3次重复，每只小鼠重复间隔时间尽可能一致。
9.7数据统计学处理用Excel 2000对所测数据进行统计处理，实验结果以均数±标准差(x±SD)表示，数据进行组间t检验。
本发明所构建的Myostatin疫苗能够在小鼠体内诱导出针对该蛋白的抗血清，免疫小鼠，使得小鼠骨骼肌质量和力量明显提高。
合成TT-Ms基因序列Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Phe Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr20 25 30Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe35 40 45Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys50 55 60Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His65 70 75 80Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr85 90 95Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu100 105 110Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys115 120 125Ser *** Val Asp130
权利要求
1.一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗，其特征在于，将合成的TT-Ms基因片段克隆至pQE30原核表达载体，构建pQE-TT-Ms重组表达载体，利用PCR扩增Ms基因片段，构建pQE-Ms重组表达载体；在大肠杆菌中表达融合蛋白His-TT-Ms和His-Ms，对蛋白进行鉴定后作为myostatin的蛋白疫苗；或将合成的TT-Ms基因片段克隆至pVAC1-cms基因疫苗专用质粒，构建pVAC-TT-Ms重组质粒，体外进行目的蛋白表达的鉴定，作为myostatin基因疫苗；所述的TT-Ms基因片段对应的氨基酸序列具体如下Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Phe Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr20 25 30Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe35 40 45Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys50 55 60Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His65 70 75 80Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr85 90 95Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu100 105 110Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys115 120 125Ser *** Val Asp130。
2.如权利要求1所述的特异性抗体的治疗性疫苗，其特征在于，所述的TT-Ms基因片段是利用人工合成DNA的方法获得了在N-端连接了Th细胞辅助表位TT830-844人myostatin C-末端区基因片段。
3.实现权利要求1所述的人Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，该方法制备myostatin的蛋白疫苗或myostatin基因疫苗的步骤分别如下一、myostatin的蛋白疫苗制备1)重组质粒pQE-TT-Ms和pQE-Ms的构建用BamH I和Sal I双酶切pQE30质粒，质粒大片段与合成的TT-Ms基因序列连接，构建pQE-TT-Ms；用BamH I和Sal I双酶切pQE30质粒和PCR产物Ms，再进行连接；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定和DNA序列分析；将测序正确者命名为pQE-Ms和pQE-TT-Ms；(2)重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定1)重组蛋白的诱导表达重组质粒pQE-TT-Ms和pQE-Ms转化感受态细胞BL21或DE3，挑取单克隆培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中，37℃培养2小时至对数生长中期，OD600nm值在0.4～0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，收集菌体进行SDS-PAGE；2)目的蛋白的纯化与鉴定SDS-PAGE取500μl诱导或未诱导的菌液离心收集沉淀，加入30μl水及30μl的2×载样缓冲液，载样缓冲液的配方为5％β-巯基乙醇，4％SDS，20％甘油，100mmol/L Tris·HCl，pH6.8，0.2％溴酚蓝，振荡混匀后，沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μl上清加样于15％分离胶和6％浓缩胶，上样后恒压90V电泳，样品进入分离胶后电压升至120V电泳1h；包涵体的分离和初步纯化按1克菌体加入10ml的STE缓冲液的比例将菌体重悬，该STE缓冲液的配方为100mM NaCl，50mM Tris·HCl，pH8.0，然后于冰浴中进行超声裂菌，超声时间5s，间隔时间10s，功率200W，破碎15min，4℃离心15min，12000rpm，弃上清液，收集沉淀物，按1克菌体加入20ml洗涤液洗涤沉淀，4℃搅拌1h，12000rpm 4℃离心15min，弃上清液，再收集沉淀，重复洗两次；将沉淀物在变性缓冲液室温搅拌3～5h，彻底溶解，12000rpm 4℃离心10min，收集上清，用镍亲和色谱层析柱，纯化目的蛋白，变性缓冲液配方8M尿素，PH 8.0的10mMTris·HCl，100mM NaH2PO4；用变性A液充分平衡色谱层析柱，上样后，用含30mM咪唑的A液洗脱杂蛋白，再用含250mMl咪唑的A液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，透析复性，变性A液的配方为8M Urea，PH 8.0的10mM Tris·HCl，100mM NaH2PO4；蛋白免疫印迹SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液中100V恒压1小时电泳，转移缓冲液的配方为25mmol/L Tris，192mmol/L Glycine，20％甲醇，将蛋白转移至硝酸纤维膜上，电泳结束后，取出硝酸纤维膜，洗涤液TBST清洗后浸入封闭液中37℃1小时，TBST室温洗3次，每次5min，分别加入兔抗人GDF-8多克隆抗体和鼠抗His单克隆抗体，37℃孵育1小时，TBST洗3次，分别加入羊抗兔IgG-AP和兔抗鼠IgG-AP，37℃孵育1小时，TBST洗3次，再用TBS洗3次，硝酸纤维膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应；蛋白透析复性收集色谱层析柱的洗脱液，采用尿素浓度梯度透析方法透析纯化蛋白，尿素浓度梯度为8M→4M→2M→H2O溶液，透析上清液中的蛋白作为myostatin的蛋白疫苗；二、myostatin的基因疫苗制备1)重组质粒pVAC-TT-Ms的构建以pQE-TT-Ms为模板，应用合成引物1和引物2将pQE-TT-Ms 5’端和3’端的酶切位点分别突变为BamH I和EcoR I；PCR扩增取1μL pQE30-TT-Ms质粒为模板，加入10×PCR缓冲液5μl，25mmol/L MgCl25Ml，25mmol/L 4×dNTPs 1μl，25μM的引物2、3各1μl，加入TaqDNA聚合酶1μl，用水补足体积至50μl；然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为95℃预变性5min后，按下列参数循环30次94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸10min；PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段；用BamH I和EcoR I双酶切pVAC1-cms质粒和回收的基因片段，回收的质粒大片段与TT-Ms片段连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定和DNA序列分析，将测序正确者命名为pVAC-TT-Ms；2)重组质粒的扩增重组质粒pVAC-TT-Ms，转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于10ml含zeocin抗生素的LB培养基中培养8h，再按1∶100的比例接种于200ml含zeocin抗生素的LB培养基，摇菌25h，200rpm，·37℃，收菌；3)宿主菌的收获和碱裂解于4℃以4000rpm离心20分钟，弃上清，将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中；将冼过的500ml培养物的细菌沉淀物重悬于10ml或18ml的溶液I中，高压灭菌15min，贮存于4℃；加2ml溶菌酶溶液，再加20ml或40ml溶液II，盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，充分混匀内容物，于室温放置5～10min；加15nl用冰预冷的溶液III封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相；置冰上放10min，应形成一白色絮状沉淀；于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物；所述的溶液I为50mmol/L葡萄糖，pH8.0的25mmol/L Tris·Cl，pH8.0的10mmol/LEDTA；所述的溶液II为0.2mol/LNaOH，1％SDS；所述的溶液III为5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml；于4℃以4000rpm离心15min，自然停转；如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000rpm再度离心20min，然后小心将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体；上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min；于室温以500rpm离心15分钟，回收核酸；小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温用70％乙醇洗涤沉积管壁；倒出乙醇，用与真空装置相联的巴斯德吸管吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的乙醇挥殆尽，用pH8.0的3ml TE溶解核酸沉淀；4)质粒的纯化将核酸溶液转入15ml Corex管中，再加3ml用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，于4℃下以10000rpm离心10min；将上清转移到另一30ml Corex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，于室温以10000rpm离心10min，回收沉淀的核酸；去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴斯德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的乙醇蒸发殆尽；用500μl含无DNase的胰RNase20μg/ml pH8.0的TE溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置3min；加500μl含13％(w/v)聚乙二醇PEG 8000的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5min，以回收质粒DNA；吸出上清，用pH80的400μlTE溶解质粒DNA沉淀；用酚、酚氯仿、氯仿各抽1次；将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积乙醇，于室温放置10min，于4℃以12000g离心5min，以回收沉淀的质粒DNA；吸去上清，加200μl处于4℃以12000g离心2min；吸去上清，敞开管口，使乙醇蒸发殆尽；用pH8.0的500μl TE溶解沉淀1∶100稀释后测量OD260/OD280，计算质粒DNA的浓度，其中1OD260＝50μg质粒DNA/ml，然后将DNA贮于-20℃，作为myostatin的基因疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗及其的制备方法，利用人工合成DNA的方法获得了在N－端连接了Th细胞辅助表位TT
文档编号C12N15/62GK101057970SQ200610104728
公开日2007年10月24日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者张英起, 唐量, 韩苇, 李萌, 薛晓畅, 孟洁如, 包春杰, 郝强, 李维娜, 王增禄 申请人:中国人民解放军第四军医大学