用金磁微粒纯化dna的方法

文档序号:442476阅读:575来源:国知局
专利名称:用金磁微粒纯化dna的方法
技术领域
本发明涉及一种对DNA进行纯化的方法。
背景技术
DNA纯化是分子生物学实验中的一项关键技术,是下游实验的前提和基础, 纯化的质量将直接关系到以后实验的成功与否,如PCR扩增、酶切反应、从血 液、唾液等样品中纯化DNA用于亲子鉴定、刑事犯罪的基因鉴定以及从各种组 织中纯化DNA以构建文库等。因此寻求快速、高效、简易、低成本的DNA纯化 方法一直是人们关注的方向。
目前常用的几种DNA提取方法均存在一些缺点。酚-氯仿纯化方法,虽然适 用于大多数生物样本,但实验操作时间长、步骤繁琐、容易造成DNA的污染,也 不利于自动化和多个样本的同时纯化,对微量生物样品DNA纯化亦存在困难。此 外,酚、氯仿等有机试剂易造成环境污染,有损操作者的健康。Chelex—100方 法简单,其原理基于树脂的络合作用,提取的DNA可直接用于PCR扩增,但该方 法得到的DNA纯度不高而不利于后继分子生物学实验的进行,并且这种方法只适 用于微量样品,不适合大量样品的操作。玻璃珠法依赖于DNA与玻璃珠表面的静 电吸附,优点在于操作简便,采用物理吸附法纯化DNA不需要特殊的设备。但是 由于玻璃珠比表面积小,纯化效率低,而且不能彻底除去抑制剂,限制了其应 用的范围。
磁珠法是近年来发展迅速的一种DNA纯化方法,它具有操作简单、纯化质 量高、无酚、氯仿等有机试剂的污染等优点,因此该方法越来越受到人们的亲 睐。专利ZL 02139818.6采用氨基化二氧化硅磁性纳米颗粒快速抽提纯化DNA 的方法,专利CN 1370230A采用二氧化硅磁性颗粒对DNA的分离和专利CN 1535979A用磁性纳米复合材料提取DNA的方法都对以磁性材料为载体纯化DNA 进行了公开,但是现有的磁性材料纯化技术中存在纯化率低、纯度差、操作时间长等缺点。
组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组
成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开,但其应 用中主要包括分子固定以及相关检测的内容,未涉及到对DNA进行纯化的内容。

发明内容
本发明目的是提供一种用金磁微粒纯化DNA的方法,其解决了现有技术对 DNA纯化效率低、纯度差、操作时间长等缺点。 本发明的技术解决方案是-
一种用金磁微粒纯化DNA的方法,该方法包括以下步骤
l]制备含有DNA的液态样品用裂解液将细胞或组织等样品裂解得到含有 DNA的液态样品,或者对DNA分离凝胶进行溶解得到含有DNA的液态样品,或者 直接使用PCR扩增产物中含有DNA的液态样品;
2]将金磁微粒和含有DNA的液态样品混合将金磁微粒与含有DNA的液态 样品混合,加入偶联缓冲液,形成含有金磁微粒一DNA复合物的混合溶液;所述 偶联缓冲液为聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的分子量在6000 10000 之间,浓度为10% 35%,其中的盐是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化 钙、氯化镁或氯化铯,浓度为0.5 M 5.0 M;
3]将金磁微粒一DNA复合物从混合溶液中分离将混合溶液磁性分离,弃上 清,用清洗缓冲液清洗金磁微粒,重复磁性分离,直至上清澄清,移除上清, 得金磁微粒一DNA复合物;所述的清洗缓冲液为50% 100%的乙醇溶液;
4]将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱用洗脱缓冲液对金磁微粒进行洗脱, 磁性分离至上清澄清,所得上清即为纯化后的DNA的液态样品,所述洗脱缓冲 液为水或pH二7. 0 9. 0的TE缓冲液。
上述方法还包括金磁微粒的预处理步骤为了去除影响DNA吸附的游离铁 氧化物,在金磁微粒与含有DNA的液态样品混合前,先用预处理缓冲液对金磁 微粒进行清洗,所述预处理缓冲液为0.1M 1. 0 M的pH=6. 0 8. 5的EDTA溶液。
上述方法还包括金磁微粒的再生步骤将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱 完毕,磁性分离后的金磁微粒可以重复使用或是保存在预处理缓冲液中备用。
上述预处理缓冲液优选0. 6 M的pH=7. 6的EDTA;偶联缓冲液优选25%的 PEG 8000和2.0 M的氯化钠的混合溶液;清洗缓冲液优选75%的乙醇溶液;洗 脱缓冲液优选pH=7. 6的TE缓冲液。
上述裂解液包括碱性裂解液、酸性裂解液、碘化钠裂解液、胍裂解液或SDS
裂解液。
上述碱性裂解液是裂解液I 、裂解液II、裂解液III和RNase A溶液。 上述DNA的液态样品包括血液、精液、唾液、微生物、植物、质粒、凝胶、 PCR液及动物组织。
本发明的优点是
1、 纯化率高,DNA的纯化率一般在90%左右。现有技术采用纳米技术(CN 1535979A)的纯化率为80%,本发明金磁微粒均具有金、银组成的表面具有较大 的比表面积,因此具有更大的固定容量,在相同条件下,金磁微粒纯化相同样 品时用量比现有技术(CN 1535979A)的磁性微粒少,lmg的金磁微粒能够纯化 0.6 mg的基因组DNA。
2、 金磁微粒纯化的DNA完整性好金磁微粒表面的金、银颗粒,因其较大 的比表面积使得在吸附同样长度的DNA链时,所需要的金磁微粒数量少,对DNA 链的破坏小,纯化的DNA完整性好。
3、 得到的DNA纯度高。本发明纯化的DNA的0D加)/0D28()在1.7 1.9之间, 表明本发明能够有效的去除抑制剂和污染物;另外在金磁微粒和DNA形成复合 物时加入的偶联缓冲液可以促进DNA的吸附,同时减少其他物质的吸附;清洗 过程中使用乙醇溶液多次洗涤,可以洗掉一些吸附的杂质,尤其是易溶于有机 试剂的脂类或多糖,由于乙醇易挥发,不会留下残留,所以得到的DNA纯度高。 现有技术(CN 1535979A)的洗涤液成分复杂,特别是洗涤液II中的乙酸钠容易 残留,对后继实验有一定的影响,而且乙酸钠不易挥发,导致磁粒干燥时间长。
4、 操作方便、快捷。 一支离心管即可完成全过程,整个过程用时不到一个 小时。偶联缓冲液中合适的聚乙二醇(PEG)和盐浓度可以促进DNA在磁粒表面 的吸附。
5、 碱性裂解液相比胍裂解液和酸性裂解液,纯化效果好。


图1为利用本专利方法纯化全血中基因组DNA的电泳照片;
图2为纯化前和纯化后样品的UV对比图3是利用本专利方法纯化全血中基因组DNA与传统的酚/氯仿提取法相对 比的电泳图片;
图4为利用本专利方法纯化的基因组DNA所作的PCR电泳图片。
具体实施例方式
实施例1是从全血中快速纯化基因组DNA具体过程
l]金磁微粒的预处理
1. l]充分混匀金磁微粒确保磁粒完全悬浮在溶液中;
1.2]取100 "1金磁微粒于1.5 ml离心管中,把离心管置于磁性分离器上 磁性分离直至上清澄清;分离可在l min内完成,移除上清;
1.3]把离心管和磁性分离器分开。向管中加入200 "1预处理缓冲液,用 移液器吹打混匀,然后重新置于磁性分离器上,移除上清;
1.4]重复步骤1.3] 1. 4]两次。然后在离心管中加入200 lU偶联缓冲液,
充分混匀。
2]DNA纯化步骤
2.1]取200 ul全血加入1.5 ml离心管中,然后在管中加入800 u 1超纯 水,充分混合,室温静置5 min;
2.2]8000 r/min离心3min。移除上清,在管底留有肉眼可见的白细胞层; 如果仍有红细胞残留,重复步骤2. 1] 2.2];
2.3]向管中加入30 iil裂解缓冲液I和60 ul裂解缓冲液II,然后加入l ul RNase A溶液,用移液器吹打混匀;室温静置5 min;
2.4]向管中加入45 ul裂解缓冲液III,用移液器吹打混匀;冰浴IO min;
2.5]向管中加入预处理的金磁微粒,用移液器轻轻吹打混匀;室温静置3 min。把离心管置于磁性分离器上磁性分离5 rniri,移除上清;
2.6]把离心管从磁性分离器上取下;向管中加入200 ul清洗缓冲液并用 移液器吹打混匀;离心管重新置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清,移除
上清;
2. 7]重复步骤2. 6]两次。
2.8]室温晾干3min。向管中加入50 u 1洗脱缓冲液,用移液器吹打混匀, 80。C水浴5 min;
2. 9]把离心管重新置于磁性分离器上分离直至上清澄清;把上清转移到另 一离心管中保存备用。
实施例2是从细菌中纯化质粒DNA的具体过程 l]金磁微粒的预处理
1. l]充分混匀金磁微粒确保磁粒完全悬浮在溶液中;
1. 2]取500 u 1金磁微粒于1. 5 ml离心管中,把离心管置于磁性分离器上 磁性分离直至上清澄清;分离可在1 min内完成,移除上清;
1.3]把离心管和磁性分离器分开。向管中加入200 yl预处理缓冲液,用
移液器吹打混匀,然后重新置于磁性分离器上,移除上清;
1.4]重复步骤1.3] 1.4]两次;然后在离心管中加入200 Ul偶联缓冲液,
充分混匀;
2]DNA纯化步骤
2. l]取lml过夜培养菌液,最高速离心30 sec,移除上清; 2.2]向管中加入60 U 1裂解缓冲液I和120 "l裂解缓冲液n,然后加入
2 ul RNase A溶液,用移液器吹打混匀;室温静置5 min;
2.3]向管中加入90 ul裂解缓冲液III,用移液器吹打混匀;冰浴IO min;
2.4]向管中加入预处理的金磁微粒,用移液器轻轻吹打混匀;室温静置3 iniri;把离心管置于磁性分离器上磁性分离5 min,移除上清;
2.5]把离心管从磁性分离器上取下。向管中加入200 ul清洗缓冲液并用 移液器吹打混匀;离心管重新置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清,移除 上清;
2.6]重复步骤2.6]两次。
2.7]室温晾干3min;向管中加入50 p 1洗脱缓冲液,用移液器吹打混匀, 80。C水浴5 min;
2.8 ]把离心管重新置于磁性分离器上分离直至上清澄清;把上清转移到另
一离心管中,保存备用。
实施例3是从组织中纯化基因组DNA的具体过程
1. l]取10mg 100 mg组织高速匀浆加入1. 5 ml离心管中;
1.2]向管中加入30u 1 300 ul裂解缓冲液I和60ul 600 ix 1裂解缓
冲液II,然后加入lii1 10 iil RNase A溶液,用移液器吹打混匀;室温静置
5 min;
1.3]向管中加入45u1 450 "l裂解缓冲液III,用移液器吹打混匀;冰浴 10 min;
1.4]向管中加入预处理的金磁微粒,用移液器轻轻吹打混匀;室温静置3 min;把离心管置于磁性分离器上磁性分离5 min,移除上清;
1.5]把离心管从磁性分离器上取下;向管中加入200ii1 1000 ul清洗缓
冲液并用移液器吹打混匀。离心管重新置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄 清,移除上清;
1.6]重复步骤1.5]两次;
1.7]室温晾干3min;向管中加入50 u 1洗脱缓冲液,用移液器吹打混匀, 80。C水浴5 min;
1. 8]把离心管重新置于磁性分离器上分离直至上清澄清;把上清转移到另
一离心管中保存备用。
图l为利用本专利方法纯化全血中基因组DNA的电泳照片;泳道l为Marker; 泳道2 泳道6为相同样品纯化的DNA,体现出重复性好,纯化的片段大等优点。
图2为纯化前和纯化后样品的UV对比图,曲线l为纯化前;曲线2为纯化 后。纯化前可以看出样品中包含很多杂质,没有特征峰。而纯化后在0026。处有 明显的特征峰,而且0D湖/0D,在1.7 1.9之间,表明没有或很少有蛋白质和 RNA的污染。
图3是利用本专利方法纯化全血中基因组DNA与传统的酚/氯仿提取法相对 比的电泳图片;泳道l为Marker;泳道2 泳道3为用本发明纯化的DNA;泳 道4 泳道5为相同样品用传统方法一酚/氯仿法纯化的DNA。图中表明本发明 纯化的DNA不但量大而且重复性好。而酚/氯仿法纯化的DNA量每次不一致, 重复性不好,在操作过程中会因人而异。
图4为利用本专利方法纯化的基因组DNA所作的PCR电泳图片。泳道1为 Marker,泳道2 泳道5为人类Y染色体片段PCR扩增片段所做的电泳图;泳 道2 泳道3为男性,泳道4 泳道5为女性。图可表明本发明纯化的DNA纯 度可以满足下游的PCR等分子生物学实验。
本发明原理
利用金磁微粒从生物样品中纯化DNA只需通过一步简单的磁性分离,就可 对捕获至金磁微粒表面的反应物进行富集、分离和纯化。核壳型磁粒在水中有 良好的悬浮性,而且对外磁场有良好的磁响应性,更易于与液态混合物中的游 离DNA结合和纯化;组装型金磁微粒的组装层部分是纳米级的金属颗粒,因此 有更大的固定容量和更强的对生物分子的富集能力。因此,金磁微粒在DNA纯 化方面极具应用价值。
样品处理通过某种途径将样品变成含有DNA的液态混合物。样品为血液、 精液、唾液、微生物、植物、质粒、凝胶、PCR液及动物组织等包含DNA的物质。
形成金磁微粒-DNA的复合物向含有DNA的液态混合物中加入偶联缓冲液 和金磁微粒。認A会迅速的非特异性的结合到金磁微粒的表面,形成金磁微粒 -DNA的复合物
分离收集金磁微粒-DNA的复合物利用金磁微粒的超顺磁性,在外加磁场 的作用下可迅速的分离金磁微粒-DNA复合物。
偶联缓冲液中聚乙二醇的分子量可以是从6000 10000,合适的浓度在 10% 35%之间。盐可以是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化l 、氯化镁、 氯化铯等,适合的盐浓度一般在0.5 5.0 M之间。加入含有聚乙二醇(PEG) 和盐的偶联缓冲液。
用75%的乙醇溶液(DNA不溶于75%的乙醇溶液)清洗吸附有DNA的金磁微 粒,以去除残留在金磁微粒表面的污染物;洗脱缓冲液可以是水、TE缓冲液等 溶液。用乙醇溶液对金磁微粒-DNA复合物进行清洗。洗脱液可以是水、TE缓冲 液或其他液体。
细胞或组织等样品的裂解是采用碱性裂解液,分为裂解液I 、 II 、in和RNase
A溶液。
使用前用预处理缓冲液对金磁微粒进行清洗,可除影响DNA吸附的铁氧化 物。
金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核,在核表面包 覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒,也指以磁性纳米粒子或磁性 纳米粒子的聚集体为核,在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复
合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe:A、 Y- FeA等铁的氧化物粒子,单质Fe、 Co、 Ni粒子,或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子;磁性纳米粒子的聚 集体是指经修饰后形成的Fe304、 Y- Fe203等铁的氧化物粒子聚集体,经修饰后 形成的单质Fe、 Co、 Ni粒子聚集体,或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形 成的正铁酸盐粒子聚集体。
权利要求
1、一种用金磁微粒纯化DNA的方法,其特征在于该方法包括以下步骤1]制备含有DNA的液态样品用裂解液将细胞或组织等样品裂解得到含有DNA的液态样品,或者对DNA分离凝胶进行溶解得到含有DNA的液态样品,或者直接使用PCR扩增产物中含有DNA的液态样品;2]将金磁微粒和含有DNA的液态样品混合将金磁微粒与含有DNA的液态样品混合,加入偶联缓冲液,形成含有金磁微粒-DNA复合物的混合溶液;所述偶联缓冲液为聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的分子量在6000~10000之间,浓度为10%~35%,其中的盐是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁或氯化铯,浓度为0.5M~5.0M;3]将金磁微粒-DNA复合物从混合溶液中分离将混合溶液磁性分离,弃上清,用清洗缓冲液清洗金磁微粒,重复磁性分离,直至上清澄清,移除上清,得金磁微粒-DNA复合物;所述的清洗缓冲液为50%~100%的乙醇溶液;4]将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱用洗脱缓冲液对金磁微粒进行洗脱,磁性分离至上清澄清,所得上清即为纯化后的DNA的液态样品,所述洗脱缓冲液为水或pH=7.0~9.0的TE缓冲液。
2、 根据权利要求1所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特征在于所述 方法包括金磁微粒的再生步骤将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱完毕,磁性 分离后的金磁微粒可以重复使用或是保存在预处理缓冲液中备用。
3、 根据权利要求1所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特征在于所述 方法包括金磁微粒的预处理步骤为了去除影响DNA吸附的游离铁氧化物,在 金磁微粒与含有DNA的液态样品混合前,先用预处理缓冲液对金磁微粒进行清 洗,所述预处理缓冲液为0. 1M 1. 0 M的pH=6. 0 8. 5的EDTA溶液。
4、 根据权利要求3所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特征在于所述 方法包括金磁微粒的再生步骤将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱完毕,磁性 分离后的金磁微粒可以重复使用或是保存在预处理缓冲液中备用。
5、 根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特 征在于所述预处理缓冲液为0.6M的pH二7.6的EDTA;所述偶联缓冲液为25%的PEG 8000和2. 0 M的氯化钠的混合溶液;所述清洗缓冲液为75%的乙醇溶液; 洗脱缓冲液为pH=7. 6的TE缓冲液。
6、 根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特 征在于所述裂解液包括碱性裂解液、酸性裂解液、碘化钠裂解液、胍裂解液或SDS裂解液。
7、 根据权利要求6所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特征在于所述 碱性裂解液为裂解液I、裂解液II、裂解液m和RNase A溶液。
8、 根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒纯化DNA的方法,其特 征在于所述DNA的液态样品包括血液、精液、唾液、微生物、植物、质粒、 凝胶、PCR液及动物组织。
全文摘要
本发明涉及一种用金磁微粒纯化DNA的方法,包括1)制备含有DNA的液态样品;2)金磁微粒与含有DNA的液态样品混合,形成金磁微粒-DNA复合物;其中金磁微粒是以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核,在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒,也是以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核,在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒;平均直径为0.05~100μm;3)施加外磁场将吸附了DNA的金磁微粒与液态样品其他组分分离;4)将吸附在磁性材料表面的DNA洗脱。本发明可有效地从各种样品中纯化DNA,具有纯化率高,DNA完整性好、纯度高,操作方便快捷的优点。
文档编号C12N15/10GK101165182SQ20061010475
公开日2008年4月23日 申请日期2006年10月19日 优先权日2006年10月19日
发明者崔亚丽, 曹树辉, 超 陈 申请人:陕西西大北美基因股份有限公司
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