专利名称：一种使用氧化硅－磁铁矿纳米复合物分离质体dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离质体DNA的方法，更特别的涉及一种使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物从细菌培养物中分离超纯质体DNA的方法。
背景技术：
特定细胞或分子的纯化为生命科学研究的根本，不过某些分离方法可能具有物理和化学危害性。在现有技术中，磁性分离法提供了一种温和的抉择，目标物是经捕捉在涂覆着目标物专一性表面的磁性粒子上，且使用磁场将目标物从样品分离出。对于快速细菌质体DNA分离，使所分离出的DNA不含蛋白质、RNA、盐类和酵素抑制剂的方法的需求已经随着对于需要高度纯化的基因模板的分子实验程序的泛滥而大幅增加。最盛行的质体分离方法都是相当耗时间且需要用到吸附剂、毒性物质、核酸酶和/或过滤介质来使质体从蛋白质、基因组DNA分离出来。DNA的磁性分离法有快速的处理时间、较少的化学品需求、容易使用磁铁分离且容易自动化的优点。阴离子交换层析术吸着剂的低容量是质体DNA纯化中的另一项相关问题。因此，具有更高结合容量的新机体的设计与发展为质体处理领域中的最重要发展之一。
在最近数年内，随着纳米结构材料和纳米技术在生物技术与医学领域中的快速发展，纳米尺寸的磁性粒子已受到逐增的注意。由于强磁性和低毒性，纳米尺寸的磁性粒子在生物技术与医学中的应用已经受到明显的注意。小于约30纳米的磁性粒子具有超顺磁性(superparamagnetism)。严格说来，这些粒子不具磁性而是具有超顺磁性，是指的是其只有在磁场中才具磁性。这种性质使这些粒子可以再分散而不会有磁性聚集物的形成。因此这些粒子可以再使用或回收。这种特性可防止结块且促成粒子的容易分散。微生物细胞溶裂物为相当粘稠者且可能在管柱分离操作中呈现问题。使用磁性粒子在生物分离应用中的另一项优点为其对于各种量的起始样品的用处。对于大部份商业上可以取得的DNA纯化系统，起始物的量都受到在塑料管柱或离心吊篮中固定的纯化用基质的含量所限制。再者，以磁性为基底的程序有适合于自动化系统的额外优点，可减少人力和时间，同时提供更为可复制性的结果且可用于大规模分析。
本发明人报导过聚乙烯亚胺(PEI)-改质磁性Fe3O4纳米珠粒作为从细菌细胞溶裂物纯化质体DNA的介质的用途。偶合到PEI化合物的氧化铁可导入有益于恢复分散的正离子电荷且有助于与DNA的离子性交互作用。PEI-改质磁性纳米珠粒可用磁驱动的分离予以回收且可经由使用有最优离子强度(1.25M)和pH(9.0)的溶析缓冲液予以再生。聚合酶链型反应(PCR)以其高专一性、敏感度和快速的转变时间而广泛地受到使用。不过，抑制性因子可能与目标核酸共同萃取出因而阻碍PCR的效能。因此，大量注意力已经集中于快速且有效的DNA离析方法。磁性粒子也因而适合用于无抑制剂的细胞或DNA的分离。不过，至今为止，氧化硅尚未被利用来开发类似的用于良好品质质体DNA的制备。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种使用100％水性溶液，因而消除因为溶剂、盐浓度所致PCR失败的任何可能性，并可减少沉淀的操作的氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法。
本发明的目的之二是提供一种使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物从细菌培养物中分离超纯质体DNA的方法。
本发明的这些以及其他目的将通过下列详细描述和说明来进一步体现和阐述。
本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，包括如下步骤A、使用Fe2+和Fe3+盐和氢氧化铵在氮气环境下以化学沉淀法制备超顺磁性氧化铁纳米粒子；B、将四乙氧基硅烷(TEOS)用酸水解产生的氧化硅涂覆在A步骤得到的磁性氧化铁纳米粒子上来制备氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体；C、将含质体DNA的样品与上述步骤B所得的氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体接触使其在高盐条件下吸附到该载体上；D、使用溶析缓冲液将该质体DNA从该氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体脱吸附，并且使用永久磁体回收该氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体，留下的澄清液回收该质体DNA。
在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，在A步骤中，包括如下步骤(1)、将去离子水再次去离子，然后通入氮气1小时以去除水中氧气；(2)、将含Fe2+和Fe3+离子的化合物在激烈搅拌之下溶解在(1)步骤得到的水中，得到FeCl36H2O(例如1.28M)和FeCl24H2O(例如0.64M)；(3)、将步骤(2)得到的含铁溶液加入碱(较好的是NaOH)和脂肪酸(较好的是月桂酸)激烈搅拌，使用超声波槽使磁铁矿粒子稍微分散，然后依序使用丙酮、乙醇和去离子水清洗以去除残留表面活性剂和未反应的药剂；(4)、得到的磁铁矿悬浮液可以用于下一步骤中或者予以干燥得到粉末形式的产品。
在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，在B步骤中，将步骤(A)得到的磁铁矿悬浮液在圆底烧瓶内以超声波分散，在激烈机械搅拌之下，加入HCl，反应1小时之后，在反应混合物中依序加入去离子水、氢氧化铵和四乙氧基硅烷，在70-85℃连续搅拌之下进行水解5-8小时，用永久磁铁进行分离，所得产物用去离子水彻底洗涤三次，将氧化硅-磁铁矿纳米复合物以10毫克/毫升浓度贮存于去离子水中。
较好的是，在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，在B步骤中，将步骤(A)得到的70毫升磁铁矿悬浮液在圆底烧瓶内以超声波分散，在激烈机械搅拌之下，加入1毫升6N的HCl，反应1小时之后，在反应混合物中依序加9.9毫升的去离子水、34毫升的氢氧化铵和98％体积浓度的10.1毫升四乙氧基硅烷，在70-85℃以300-500转/分钟连续搅拌之下进行水解6.5-7.5小时，用永久磁铁进行分离，所得产物用去离子水彻底洗涤三次，将氧化硅-磁铁矿纳米复合物以10毫克/毫升浓度贮存于去离子水中。
在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，在C步骤中，将含质体DNA的样品与氧化硅-磁铁矿纳米复合物在结合缓冲液中于室温下混合1-3分钟，然后使用具有约2000G表面磁化强度的永久磁铁将粒子固定并且去除上澄液。所述的结合缓冲液由0.1-4M的NaCl和0.05M的Tris-HCl组成，溶液的PH为7.0-9.0。
较好的是，在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，在C步骤中，将含质体DNA的样品放入1.5毫升的无DNase/RNase微型离心管之中，并且加入1％(w/v)氧化硅-磁铁矿纳米复合物和100微升结合缓冲液，组成悬浮液，在室温下温和混合该悬浮液2分钟，然后使用具有约2000G表面磁化强度的永久磁铁将粒子固定并且去除上澄液。所述的结合缓冲液由2M的NaCl和0.05M的Tris-HCl组成，溶液的PH为8.0。
在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，在D步骤中，使用300-400微升洗涤缓冲液将粒子洗涤，并且再用磁铁固定之后，添加100微升水将质体DNA脱吸附，最后，将粒子固定且回收上澄液即完成该质体DNA的分离。所述的洗涤缓冲液由0.1-0.5M的NaCl和0.05M的Tris-HCl组成，其PH值为8。较好的是，将上澄液转移到新的无DNase/RNase微型离心管之内，溶液中的核酸浓度从260纳米的吸光度计算出。
在本发明的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法中，所述的含DNA的生物样品为微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫与类似者，动物和植物的细胞、体液、组织萃取物和类似者，以及病毒、载体、质体、黏质体和含DNA的其它生物样品。或者为使用聚合酶链型反应从pEGFP-N1扩增一完整的绿色萤光蛋白质基因(EGFP)，然后使用所得质体转形大肠杆菌，再将转形大肠杆菌培养之后，将回收所得细菌用碱包括氢氧化钠予以溶裂而得的含有质体DNA的细菌细胞溶裂物。
在本发明中，可以将一编码绿色萤光性蛋白质与T7激活基因的质体，pRSETB-EGFP，在大肠杆菌DE3菌株(E.coli DE3strain)内扩增，利用其溶裂物作为起始样品分离该质体。经证实从细菌溶裂物的制备起始直到回收纯化质体为止可在8分钟以内完成。与市售以氧化硅为基础的方法及其它方法比较，本发明使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法具有节省时间，整体较高的产率，较低的污染与较佳的聚合酶链型反应(PCR)扩增结果。
四
图1是本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物的透射电子显微照片。
图2是本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物的磁化强度相对于磁场的关系图。
图3为本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物悬浮液在不同的盐浓度和pH的δ电位。
图4为盐浓度对于从本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物溶析出质体DNA的影响。
图5为pH对于质体DNA在本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物上的结合的影响。
图6为本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物在3毫升细菌培养物中的添加量对于从该氧化硅-磁铁矿纳米复合物溶析出质体DNA的影响。
图7为在吸附于本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物上之后，于结合后的上澄液，洗涤溶液与溶析溶液之内所含质体DNA之琼脂糖电泳分离图。
图8为使用UV盒侦测在转形大肠杆菌细胞中的EGFP表现。
图9为使用限制核酸内切酶将纯化出的质体DNA消化后，进行琼脂糖电泳分离脂结果。
图10为纯化出的质体DNA的PCR扩增敏感性。
在图4中，其中流道M分子量标志物；1[NaCl]＝OM；2[NaCl]＝0.25M；3[NaCl]＝0.5M。
在图5中，其中流道M分子量标志物；1pH＝7.0；2pH＝8.0；3pH＝9.0。
在图6中，其中流道M分子量标志物；1700微克；2800微克；3900微克；41000微克。
在图7中，其中流道M分子量标志物；1吸附后的上澄液；2洗涤溶液；3溶析溶液；4从Qiagen Spin管柱出来的溶析溶液。
在图9中，其中流道M分子量标志物；1没有限制核酸内切酶消化的纯化出的质体DNA；2有用限制核酸内切酶消化(EcoRI)的纯化出的质体DNA；3使用两种限制核酸内切酶消化(BamHI和EcoRI)的纯化出的质体DNA。
在图10中，其中流道M分子量标志物；1对照物；2从Qiagen Spin管柱分离出来的样品；3从本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离出的样品；4从经PEI-改质的磁性纳米珠粒分离出来但没有沉淀所得样品；5从经PEI-改质的磁性纳米珠粒分离出来且沉淀所得样品。
在本发明中使用的所有原材料和一些方法等均是常规使用的，可以从市场购得。在本发明中，如非特指，所有的量、百分比均为重量单位。
下面结合实施例对本发明进行具体的描述。由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，下列实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或等同本发明的范围内的改变均被本发明包含。
五具体实施例方式
实施例1材料
氯化铁六水合物是购自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ，USA)。氯化亚铁四水合物是购自Fluka(Buchs，Switzerland)。PEI、四乙氧基硅烷和月桂酸都是由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)所供应。琼脂糖L(低电内渗透压)是得自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。超螺旋阶梯状DNA电泳条带是得自Invitrogen Co.(Carlsbad，CA，USA)。DNA分离和分析中所用到的药剂都是分子生物学品级者。核糖核酸酶A是得自Sigma。所用到的所有其它化学品和溶剂都是分析级且不再纯化即使用。于整个实验中所用的水都是由NihonMillipore Ltd.(Tokyo，Japan)的Milli-Q Ultra-Pure-WaterPurification System所制造。所有溶液都是新鲜制备。
方法1、质体构成将完整经增强的绿色萤光性蛋白质基因(EGFP)使用聚合酶链型反应从pEGFP-N1(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ，USA)予以扩增。将经过处理而在5’端分别含有BamHI和EcoRI切割部位的上游引子和下游引子(5’-cgggatccACCGGTCGCCAC-3’和5’-cggaattcGCGGCCGCTTTACTTGTACAGC-3’)分别安置于EGFP基因的起始密码子和停止密码子之处。PCR是使用MinicyclerTM(MJ Research)在100微升体积内实施。每一反应包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)明胶，5.0微微莫耳的每一种引子，各200μM的每一种脱氧核糖核苷三磷酸盐(dNTP)，2.5U Ex Tag(Takara)以及0.1微克的pEGFP-N1。循环条件为20循环的95℃下1分钟，60℃一分钟和72℃一分钟。
使用BamHI和EcoRI将扩增的PCR片段线型化，然后使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamBioscience)采用制造商的实验程序从1％琼脂糖予以纯化。将限制酶切过的PCR片段使用BamHI/EcoRI-消化过的pRSETB(Invitrogen Life Technologies Ltd.)在T7激活基因的驱动下与(His)6框构内(in frame)连接而得pRSET-EGFP。
2、细菌转形将含有在IPTG-诱导Lac激活基因控制下的T7 RNA聚合酶之BL21(DE3)大肠杆菌(Invitrogen Life Technologies Ltd.)置于冰上解冻，然后将1毫微克的pRSET-EGFP与大肠杆菌混合。在冰上温置30分钟之后，在37℃下培养大肠杆菌30秒钟，然后保持在冰上2分钟。于热震荡之后于LB液体培养基上培养大肠杆菌1小时以供回收。然后将100微升的大肠杆菌悬浮液展布在含有60微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂上且在37℃下培养整个晚上以形成菌落。
3、细菌溶裂物的制备细菌是使用Birnboim和Doly所述碱法的修改法予以溶裂。将可表现质体pRSET-EGFP的大肠杆菌DE3细胞在含有100微克/毫升氨苄青霉素的Luira-Bertani液体培养基终生长到后对数期。从3毫升的细胞培养物在3000rpm离心3分钟而收获细菌细胞。将沉丸再悬浮于含有0.01M EDTA和100微克/毫升核糖核酸酶X(250微升)的0.05M Tris-HCl缓冲液，pH8.0之中。经由将再悬浮的细胞沉丸于含有1％(W/V)十二烷基硫酸钠的0.2M NaOH(250微升)温和地混合以实施细胞溶裂。经由添加6M胍-盐酸盐，pH5.5(350微升)沉淀出基因组DNA和其它杂质。将该混合物10000xg离2分钟以沉着沉淀出的蛋白质、细胞碎屑和变性的染色体DNA。
4、磁铁矿和氧化硅-磁铁矿纳米复合物的制备磁性纳米粒子Fe3O4是经由将Fe2+和Fe3+离子在氨溶液中于水热条件下处理以化学沉淀法制备。于使用之前将Milli-Q水再去离子且经由通入氮气气体1小时除氧。将含Fe2+和Fe3+离子的化学品于激烈搅拌之下溶解在Milli-Q水中以制备1.28MFeCl36H2O和0.64MFeCl24H2O储液作为铁源。以相同的方式制备1.0M NaOH作为碱源。另外，制备1.5M月桂酸，pH＝10用以涂覆。将使用超声波槽使磁铁矿粒子稍微分散。然后依序使用丙酮、乙醇和去离子水予以清洗以移除残留界面活性剂和未反应的药剂。典型地，是将70毫升上面所制备的磁铁矿悬浮液(0.7克Fe3O4)在一圆底烧瓶内以超声波分散。于激烈机械搅拌之下，加入1毫升的HCl(6N)。于1小时之后，在反应混合物中依序加入9.9毫升的水，34毫升的氢氧化铵(28重量％的NH3)，以及10.1毫升的四乙氧基硅烷(TEOS；98％(v/v))/22.4毫升甲醇。于80℃连续搅拌(350rpm)之下进行TEOS的水解7小时。将藉助永久磁铁的磁性分离所得产物使用去离子水彻底洗涤三次。将氧化硅-磁铁矿纳米复合物以10毫克/毫升浓度贮存于去离子水中。
5、磁性粒子的鉴定使用Philips(Eindhoven，The Netherlands)的Tecnai G2F20 FEG-TEM在200kV以透射电子显微术(TEM)观察磁性纳米粒子的尺寸和形态学。使用超导性量子干涉装置(SQUID)Quantum Design(San Diego，CA，USA)MPMS7磁强计进行磁测量。使用Malvern(Worcs，UK)Brook haven Zetasizer 3000分析仪测量氧化硅-磁铁矿纳米复合物在不同pH和盐浓度的δ电位。
6、以氧化硅-磁铁矿纳米复合物纯化质体DNA将透明碱溶裂物的上澄液置于一1.5毫升的无DNase/RNase微型离心管之内且加入1％(w/v)氧化硅-磁铁矿纳米复合物在结合缓冲液(100微升，2M NaCl，0.05M Tris-HCl缓冲液，pH8)中的悬浮液。在室温下温和混合该悬浮液2分钟。然后使用一具有约2000G表面磁化强度的永久磁铁将该等粒子固定且移除上澄液。将这些珠粒再悬浮于洗涤缓冲液(350微升，1.5M NaCl，0.05M Tris-HCl缓冲液，pH8)予以洗涤。在将这些珠粒固定之后，丢弃上澄液且经由添加溶析缓冲液(100微升，水)将质体DNA脱吸附。最后，将粒子固定且将上澄液转移到一新的无DNase/RNase微型离心管之内。溶液中的核酸浓度可以从260纳米的吸光度轻易地计算出。
7、琼脂糖凝胶电泳在一Bio-Rad(Hercules，CA，USA)水平式凝胶电泳单元与使用1kb分子量标准品(Amersham Biosciences)在含有0.5微克/毫升溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。所用的操作缓冲液为TAE(40mM Tris，20mM乙酸，1mM EDTA，pH8.0)。该电泳是在100V进行40分钟。
8、结合缓冲液的盐浓度和pH对于质体DNA吸附的影响结合缓冲液的盐浓度和pH对于质体DNA在氧化硅-磁铁矿纳米复合物上的吸附的影响是分别在0.1-4M的NaCl浓度范围和7.0-9.0范围内的pH评定的。
9、溶析缓冲液的盐浓度对于质体DNA脱吸附的影响溶析缓冲液的盐浓度对于质体DNA从氧化硅-磁铁矿纳米复合物上的脱吸附的影响是在0.1-0.5M的NaCl浓度范围内评定的。
10、最优氧化硅-磁铁矿纳米复合物用量知测定为了测定氧化硅-磁铁矿纳米复合物的最优用量，将其加到3毫升细菌培养物之内。使用于在700至1000微克范围内的数种量的氧化硅-磁铁矿纳米复合物进行研究。离析质体DNA的产率是使用UV光谱光度测定法在260纳米，或较佳者，经由比较在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上脂DNA分离带所具强度而测定。将所有离析质体DNA样品的260/280纳米吸光度比例计算成为纯度的量度。
11、限制核酸内切酶消化将20微升体积的溶析DNA溶液与制造商的反应缓冲液(3微升)，和无菌水(6微升)混合，且与限制核酸内切酶(BamHI和EcoRI，1微升，10单位)在37℃下温置18小时。将消化混合物直接用琼脂糖凝胶电泳分析。
12、PCR扩增
PCR是使用确定的可目标导引基因舆图脂插入组件IS900的引子(5’-cgggatccACCGGTCGCCAC-3’和5’-cggaattcGCGGCCGCTTTACTTGTACAGC-3’)实施的。扩增产物的大小为800bp。将10微升的萃取DNA使用MinicyclerTM(MJResearch)加到含有PCR缓冲液的调合液之中。每一反应包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)明胶，5.0微微莫耳的每一种引子，各200μM的每一种脱氧核糖核苷三磷酸盐(dNTP)，2.5U Ex Tag(Takara)以及0.1微克的pEGFP-N1。循环条件为20循环的95℃下1分钟，60℃一分钟和72℃一分钟。将扩增的PCR片段在含有0.5％EtBr的1％琼脂糖凝胶中进行电泳侦测且以UV照射目视检验。
实施例21、磁性粒子的鉴定磁性纳米粒子的尺寸和形态学是以TEM予以鉴定。图1显示出磁性粒子的典型TEM显微照片。磁性粒子的超顺磁性质是以SQUID测量的磁化强度曲线予以证实。图2显示出在298K的磁化强度对施加磁场的典型标绘图(M-H回线)。所得Fe3O4磁性粒子的饱和磁化强度为64emu/克Fe3O4。这些磁性粒子的大饱和磁化强度使其对磁场非常敏感，因而使固体相和液体相得以容易地分离。非常微弱的磁滞揭露出所得磁性纳米粒子都是近乎超顺磁性者。
2、离子强度的影响所用的结合缓冲液和溶析缓冲液所具盐浓度和pH可决定DNA是结合到磁性珠粒或从磁性珠粒溶析出。透过结合缓冲液和溶析缓冲液的谨慎选择可达到解决。DNA-纳米珠粒交互作用可以透过由离子强度所提供的静电筛选，以及透过DNA的静电荷予以调制，如由溶液的δ电位予以决定者。图3显示出氧化硅-磁铁矿纳米复合物悬浮液在不同的盐浓度和pH所测量到的δ电位。在5.0-9.5的pH范围内随着盐浓度从0增加到2.0M，本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物粒子的δ电位数据会从负值(-43mV)急剧地增加到正值(16mV)。众所周知，DNA因为在核酸骨架上含有磷酸根而为一种聚阴离子性分子，且可以方便地捕捉到用荷正电官能基所衍化的珠粒之上。因此，DNA在氧化硅-磁铁矿纳米复合物上的结合需要高盐浓度的存在。在从0至4M的NaCl浓度所进行的试验中发现大于或等于2M的盐浓度可促成最大的结合。为了测定出离子强度对质体DNA从氧化硅-磁铁矿纳米复合物脱吸附的影响，乃在从0至0.5M范围内的数个NaCl浓度研究溶析缓冲液。其结果显示于图4中，可以看出，增加盐浓度显然地会导致脱吸附效用性的减低。没有NaCl之下，所吸附的质体之溶析会明显地增加。这些结果与在δ电位上所报告者一致，如图3中所示。随着在pH 8下NaCl浓度值从0增加到0.5M，磁性粒子的δ电位值从-40mV急剧地增加到-8mV。由此结果之故，乃使用水来进行所有的后续实验。
3、pH的影响在图5中显示出在7.0-9.0范围内的数个pH进行值体DNA吸附对于溶析缓冲液的pH的相关性。如所预料的，pH对于质体在氧化硅-磁铁矿纳米复合物上的吸附没有明显影响。这些结果也与在δ电位上所报告者一致。在没有NaCl之下，随着pH从7.0增加到9.0，磁性粒子的δ电位值从-36mV稍微增加到-43mV。由此结果之故，因此使用pH8.0的溶析缓冲液来进行所有的后续实验。
4、氧化硅-磁铁矿纳米复合物的最优用量的测定为了测定出氧化硅-磁铁矿纳米复合物的最优用量，将其加到3毫升的细菌培养物中。于700至1000微克范围内研究氧化硅-磁铁矿纳米复合物的数个用量。如图6和表1中所显示者，随着氧化硅-磁铁矿纳米复合物的量从700微克增加到1000微克，从260纳米的UV光谱光度测定法所判断者，溶析出的质体DNA的量从19.9微克明显地增加到43.1微克。此可归因于吸附之后上澄液中的质体DNA之量会从700至1000微克实质地减低的事实(没有显示出数据)。另外，也从QIAGEN(Valencia，CA，USA)Spin管柱套组根据制造商的指示纯化质体DNA。于此情况中，使用QIAGEN Spin管柱套组从3毫升的细菌培养物溶析出的最大质体DNA为约21.3微克。所以，本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物的纯化容量明显地大于使用市售的以氧化硅为基底的树脂所可能达到者。对四种不同的样品，即吸附、洗涤、和脱吸附后的各上澄液，以及从QIAGENSpin管柱所得溶析溶液中的质体DNA进行凝胶电泳实验。为了进行RNA污染的比较，在琼脂糖电泳中的所有装载溶液都经由添加室温液丙醇予以沉淀。混合后立即12,000rpm离心5分钟。使用70％乙醇洗该沉丸且以12,000rpm离心5分钟。如所知者，质体DNA和RNA两者都是聚阴离子分子，且是透过核酸骨架上的荷负电磷酸残基与磁性吸附剂上的荷正电官能基交互作用。对于核酸而言，整体电荷为其大小的函数。被RNase降解的小RNA杂质因而预料会具有低整体电荷。经由在溶析缓冲液中使用适当的盐浓度(2M NaCl)，可以降低溶析出的质体DNA中之RNA杂质含量，如第七图中所显示者。此对于质体DNA纯化中所使用的良好吸附剂而言是非常重要的。
表1.从本发明氧化硅-磁铁矿纳米复合物溶析出质体DNA与用市售Qiagen Spin管柱套组溶析出质体DNA在产率和品质上的比较表1
5、纯化质体DNA的表现所纯化出的质体DNA可以立即用于下游应用之中例如转染、转形、限制消化、连接(ligation)、定序(sequencing)与PCR。于一具体实例中，也对所纯化出的质体DNA检验其经电转形到细菌细胞内的生物学活性。如图8中所显示的，以UV盒侦测其在转形过的大肠杆菌细胞内的EGFP表现显示出在从氧化硅-磁铁矿纳米复合物纯化出之后仍然保留DNA片段的生物学活性。EGFP表现是以萤光显微术在转形的大肠杆菌细胞内侦测，显示出在从氧化硅-磁铁矿纳米复合物纯化出之后，DNA片段仍然保留的其生物学活性。于第九图中，使用两种限制核酸内切酶(BamHI和EcoRI)将纯化出的质体DNA消化后，进行琼脂糖电泳分离脂的结果，导致两个笔为消化的纯化出的质体DNA跑得更快的较小簇团(约0.8kb和2.9kb)。经纯化的质体DNA可以使用限制核酸酶予以切断，此即证实该质体DNA的纯度。
6、PCR扩增PCR检定法已在最近成为原样品中所含各种DNA的快速且敏感的侦测所不可缺少的方法。不过，细胞外和细胞内抑制剂时常会干扰检定。因此，磁性粒子适合用为细胞或DNA的无抑制剂分离。无论如何，这些粒子必须不会干扰PCR，PCR对于目标DNA侦测的敏感度可能会因为该等粒子的制备中所用的某些化合物的存在而受到负面地影响。因此，针对pRSET-EGFP的DNA分离方法进行评估，其中包括经PEI改质的磁性珠粒，氧化硅-磁铁矿纳米复合物，和QIAGEN Spin管柱。从粒子溶析出的DNA直接用于PCR扩增中。其结果显示在图10中。在从PEI改质的磁性珠粒分离出的DNA再PCR中观察到抑制剂，而溶析后的沉淀可以减轻此问题。氧化硅-磁铁矿纳米复合物和QIAGEN Spin管柱都证明可以更有效地移除抑制性因子。分离出的DNA的量与品质都足以供PCR所用。通常，劳力为分离程序的最昂贵成分。使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物的分离为最有效且最具成本效益的CAN分离程序。
因此，本发明所提供的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法具有节省时间，整体较高的产率，较低的污染与较佳的聚合酶链型反应(PCR)扩增结果等效益。所分离出的DNA的量与品质都足以供下游应用所用。
权利要求
1.一种使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于包括如下步骤A、使用Fe2+和Fe3+盐和氢氧化铵在氮气环境下以化学沉淀法制备超顺磁性氧化铁纳米粒子；B、将四乙氧基硅烷用酸水解产生的氧化硅涂覆在A步骤得到的磁性氧化铁纳米粒子上来制备氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体；C、将含质体DNA的样品与上述步骤B所得的氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体接触使其在高盐条件下吸附到该载体上；D、使用溶析缓冲液将该质体DNA从该氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体脱吸附，并且使用永久磁体回收该氧化硅-磁铁矿纳米复合物载体，留下的澄清液回收该质体DNA。
2.根据权利要求1所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于在A步骤中，包括如下步骤(1)、将去离子水再次去离子，然后通入氮气1小时以去除水中氧气；(2)、将含Fe2+和Fe3+离子的化合物在激烈搅拌之下溶解在(1)步骤得到的水中，得到FeCl36H2O和FeCl24H2O；(3)、将步骤(2)得到的含铁溶液加入碱和脂肪酸激烈搅拌，使用超声波槽使磁铁矿粒子稍微分散，然后依序使用丙酮、乙醇和去离子水清洗以去除残留表面活性剂和未反应的药剂；(4)、得到的磁铁矿悬浮液可以用于下一步骤中或者予以干燥得到粉末形式的产品。
3.根据权利要求2所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于所述的碱为NaOH，所述的脂肪酸为月桂酸。
4.根据权利要求1所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于在B步骤中，将步骤(A)得到的磁铁矿悬浮液在圆底烧瓶内以超声波分散，在激烈机械搅拌之下，加入HCl，反应1小时之后，在反应混合物中依序加入去离子水、氢氧化铵和四乙氧基硅烷，在70-85℃连续搅拌之下进行水解5-8小时，用永久磁铁进行分离，所得产物用去离子水彻底洗涤三次，将氧化硅-磁铁矿纳米复合物以10毫克/毫升浓度贮存于去离子水中。
5.根据权利要求4所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于在B步骤中，将步骤(A)得到的70毫升磁铁矿悬浮液在圆底烧瓶内以超声波分散，在激烈机械搅拌之下，加入1毫升6N的HCl，反应1小时之后，在反应混合物中依序加入9.9毫升的去离子水、34毫升的氢氧化铵和98％体积浓度的10.1毫升四乙氧基硅烷，在70-85℃以300-500转/分钟连续搅拌之下进行水解6.5-7.5小时，用永久磁铁进行分离，所得产物用去离子水彻底洗涤三次，将氧化硅-磁铁矿纳米复合物以10毫克/毫升浓度贮存于去离子水中。
6.根据权利要求1所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于在C步骤中，将含质体DNA的样品与氧化硅-磁铁矿纳米复合物在结合缓冲液中于室温下混合1-3分钟，然后使用具有约2000G表面磁化强度的永久磁铁将粒子固定并且去除上澄液。
7.根据权利要求6所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于所述的结合缓冲液由0.1-4M的NaCl和0.05M的Tris-HCl组成，溶液的PH为7.0-9.0。
8.根据权利要求6所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于在C步骤中，将含质体DNA的样品放入1.5毫升的无DNase/RNase微型离心管之中，并且加1％(w/v)氧化硅-磁铁矿纳米复合物和100微升结合缓冲液，组成悬浮液，在室温下温和混合该悬浮液2分钟，然后使用具有约2000G表面磁化强度的永久磁铁将粒子固定并且去除上澄液。
9.根据权利要求8所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于所述的结合缓冲液由2M的NaCl和0.05M的Tris-HCl组成，溶液的PH为8.0。
10.根据权利要求1所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于在D步骤中，使用300-400微升洗涤缓冲液将粒子洗涤，并且再用磁铁固定之后，添加100微升水将质体DNA脱吸附，最后，将粒子固定且回收上澄液即完成该质体DNA的分离。
11.根据权利要求10所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于洗涤缓冲液由0.1-0.5M的NaCl和0.05M的Tris-HCl组成，其PH值为8。
12.根据权利要求10或11所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于将上澄液转移到新的无DNase/RNase微型离心管之内，溶液中的核酸浓度从260纳米的吸光度计算出。
13.根据权利要求1-12之一所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于所述的含DNA的生物样品为微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫与类似者，动物和植物的细胞、体液、组织萃取物和类似者，以及病毒、载体、质体、黏质体和含DNA的其它生物样品。
14.根据权利要求1-12之一所述的使用氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，其特征在于所述的含DNA的生物样品为使用聚合酶链型反应从pEGFP-N1扩增一完整的绿色萤光蛋白质基因，然后使用所得质体转形大肠杆菌，再将转形大肠杆菌培养之后，将回收所得细菌用碱包括氢氧化钠予以溶裂而得的含有质体DNA的细菌细胞溶裂物。
15.一种使用权利要求1-14所述的氧化硅-磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法所得的质体DNA。
全文摘要
本发明公开了一种使用氧化硅－磁铁矿纳米复合物分离质体DNA的方法，包括Fe
文档编号C12N15/10GK1908168SQ20061011162
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月18日 优先权日2006年8月18日
发明者江祯立, 宋锦珊 申请人:邱良瑛