专利名称：从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的方法。
技术背景肥胖是指由于能量摄入超过消耗，导致体内脂肪积聚过多而造成的疾病。据世界卫生组织统计全球肥胖症患者达3亿人，其中儿童 占2200万人，11亿人体重过重。肥胖与多种疾病的发生相关，是糖 尿病、心脑血管病、高血压、胰島素抵抗、胆结石、某些癌症的危险 因素，此外，由此带来的健康问题还包括生殖与性功能障碍、负重关 节的疾病、精神失常、意外伤害。因此，肥胖已成为全球性的公共卫 生问题。随着肥胖发病率的日益增高，迫切需要新的、有效的且安全 的治疗手段帮助肥胖患者减轻并进一步维持体重，同时降低与肥胖相 关的心血管疾病方面的危险因素。目前国际上减肥药物的开发主要依据两个原理抑制食欲和减少 脂肪吸收。其中，后者可以在维持正常饮食的前提下达到控制体重的 目的。来自饮食的脂肪酸有50%-70%是通过胰脂肪酶的水解作用产生 的[1]，因此胰脂肪酶在脂肪的吸收方面具有重要的作用。胰脂肪酶抑 制剂能通过减少饮食中的脂肪吸收，减少人体的热量摄入，达到控制 体重的目的，并进一步减少与肥胖伴发的疾病危险因素发生的可能性。 这类药物的代表产品是赛尼可，这类产品可以抑制大约30%摄入脂肪 的吸收。[1] F Carriere, J A Barrowman， R Verger et al . Secretion and contribution to lipolysis of gastric and pancreatic lipases during a test meal in human [ J〗.Cflsfroe/^er0/0^7， 1993， 105(3): 876-88
中药是以中医理论为基础，用于防治疾病的物质的总称，其来源 有植物药、动物药、矿物药，中药具有二千多年临床用药历史，是人 类经过了自身长期的筛选所积累的宝责资源，研究表明， 一个羊味中 药的化学成分数以百计，中药是一个数量庞大，资源丰富的天然的混 合化合物库.但中药往往成分复杂，作用机理不明确，基于胰脂肪酶 对于脂肪吸收的重要性，通过建立胰脂肪醉抑制剂筛选模型，以中药 提取物库为对象进行筛选，是开发疗效明确、机理清楚的减肥新药的 一条可行途径。发明内容本发明的目的是提供用于从中药中筛选胰脂肪醉抑制剂的筛选方法。因此，本发明涉及一种从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的方法，其包括a. 将胰脂肪酶采用固相包被方法包被在酶标板上；b. 洗涤后加入活化剂孵育一定时间使酶活化；c. 洗涂后加入中药提取物样品孵育一定时间；d. 洗涤后加入底物试卣灵甘油酯反应一定时间，利用酶标仪测定 反应一定时间后生成的终产物试卣灵(r^ori;/7/z)的荧光强度，该产 物具有荧光，EX-572nm， EM-590nm，通过与对照孔荧光强度的对比， 计算样品对胰脂肪酶的抑制率。与常规的均相筛选方法比较，本发明采用固相包被和加样孵育后 进行洗涤的方法，可大大减少假阳性结果的产生。例如，避免样品对 底物影响造成的假阳性。具体讲，在胰脂肪酶催化脂类底物水解时， 其通过吸附在乳化底物的脂-水界面上改变了自身的结构，从无活性的 关闭构象转变为具有催化活性的开放构象，酶的催化位点暴露出来与 底物结合。采用常规的均相筛选方法时，当体系中存在具有表面活性的物质时，这些物质覆盖在底物表面，妨碍了胰腾肪醉吸附到脂-水界 面，最终导致底物水解的减少。这类具有表面活性的物质在中药提取 物中广泛存在，如皂苷、长链脂肪酸等，会造成假阳性的筛选结果， 同时也可减少样品对酶反应干扰造成的假阳性。具体讲，中药样品的 特点是成分、浓度都不明确。在常规的均相筛选体系中样品中存在的 多种物质可能通过非特异吸附、自身荧光对检测结果的干扰等因素导 致阳性结果.采用固相包被方法，将样品与固定化的酶孵育一定时间 后洗涤，可以除去不与酶结合或与酶结合力弱的物质，从而减少对酶 反应的影响，减少假阳性。进一步讲，本发明除了可以应用在胰脂肪酶抑制刑的筛选之外， 对脂蛋白脂酶、磷脂酶等作用于非水相底物的脂水解酶，由于它们普 遍存在界面活化的催化特性，因此本发明对建立这类酶抑制刑筛选模 型具有指导意义。
图1 胰脂肪酶SDS-PAGE电泳图谦(箭头处为纯化样品)图2 均相反应体系中胰脂肪酶的标准曲线图3 不同酶包被浓度下的反应结果图4 TT对酶反应的影响图5 阳性对照赛尼可在酶的活化与非活化状态下对酶反应的抑制图6 均相反应体系的筛选结果图7 固相包被体系的筛选结果具体实施方式
实施例1从中药中筛选胰蛋白酶抑制剂 实验材料胰脂肪酶本实验室克隆、表达及纯化。纯度达95%， SDS-PAGE电泳 图谦见图1。
标准品购自sigma反应底物试由灵甘油酯(人W/c"o-J-^7i/"r/c sc/(/ re5"on//7/7 e"er)， 购自sigma阳性对照赛尼可(/e/ /ca/) Roche公司产品固相栽体Costar96孔酶标板实验仪器酶标仪Perkin-Elmer HTS7000 plus 洗板机Biorad 1575 恒温培养箱上海精宏DNP-9082 全自动加速溶剂萃取仪Dionex ASE-300 真空冷冻离心干燥仪Thermo Savant SVC 100H 高速中药粉碎机浙江大鹏LD-02实施步骤酶反应的检测方法底物试面灵甘油酯(简称RES)以二氧六环溶解，lmg/ml冻存于 -20t;。在检测胰脂肪酶活性时，将RES母液以TN緩沖液(50mMTris， 150mMNaCl， pH8. 5 )配制为终浓度4 m g/ml，加入不同的酶量，最终 反应体积50nl/孔，37C反应45分钟。在酶标仪上测定焚光强度， EX=570nm， EM=590nm。图2为在该反应条件下均相反应体系中检测的狭脂肪酶的标准曲 线。由曲线可见，当胰脂肪酶浓度在10nmol/l范围内，它与产物荧光 强度之间有良好的线性关系(R-O. 999 )。在该线性范围内，荧光强度 正比于酶浓度，可根据样品孔的荧光强度计算样品对酶反应的抑制率。筛选模型的建立 包被条件包被浓度的选择依据是保证包被在酶标板上的酶量达到 一 定程 度，能满足酶反应生成的产物的荧光强度值达到必要的灵敏度；同时 包被的酶量应在标准曲线的线性范围内。以TN緩冲液为包被液，在25X:以不同浓度的狭脂肪酶包被lhr，将酶标板置于洗板机以TN緩沖 液洗涤，加入底物反应检测荧光强度.采用不同浓度的睐进行包被， 测定的包被曲线见图3,可见，当酶浓度为8Mmol/l时，包被巳近饱 和。选择以4jamo1/1为包被浓度，根据图2胰脂肪酶的标准曲线，根 据检测的荧光强度可换算得到包被在酶标板上的具有活性的酶为 6.56nmo1/1。 活化条件在均相反应体系中，胰脂肪酶首先通过与底物脂-水界面的作用实 现活化，即完成向活性构象的转变，然后对底物进行催化.在固相包 被法中，由于酶与样品的孵育独立于酶催化底物水解的反应过程，因 此在酶与样品孵育过程中必须先实现酶的活化，这样才能保证样品与 具有活性构象的酶作用。选择以三油酸甘油酯(简称TT )为活化剂研究.其对酶反应的影响， 将不同浓度的TT加入到经过洗涤的已包被胰脂肪醃的醉标板中，25 x:孵育io分钟，洗涤后加入底物反应，检测荧光强度，结果见图4。 可见在低浓度时，TT对RES的水解具有促进作用，该作用是由于TT 形成的脂-水界面对胰脂肪酶的活化；在高浓度时TT对酶反应表现出 抑制作用，这是由于TT作为胰脂肪酶的底物，对RES的水解具有竟争 性抑制作用。在固相包被板上，以5.5nmo1/1 TT或TN緩沖液为活化 剂对酶进行活化，洗涤后加入阳性对照赛尼克在251C孵育20分钟， 研究其对酶反应的抑制，结果见图5。可见当采用TT为活化剂时，胰 脂肪酶转变为活性构象，催化位点处的丝氨酸被奉露出来，因此赛尼 可能够与之结合[21，从而抑制酶反应。[2] Kyeong K K， Hyun K S， Dong H S et al The crystal stru cture of a tricylglycerol lipase from Pseudomonas cepacia reveals a highly open conformation in the absence of a bound inhibitor [ J ] . 57ri/"z/re， 1997， 5(2): 173-185中药样品的制备U)取5g中药材，置于中药粉碎机中粉碎15秒；(2) 将粉碎中药与10g聚耽胺、10g硅藻土混匀，加入到加速溶刑萃 取仪提取罐中，用80W乙醉在8()1C、 1500psi提取13分钟；(3) 将提取液分装于5ml离心管中，置于真空冷冻离心干燥仪中浓缩 至干，称重；(4) 将样品以2.5mg/ml溶于含2%DMS0的TN緩冲液中，离心收集上 清，500nl/管分装；(5 )取上清液500^1至15ml试管中，加入10ml石油鍵(沸程30-60 X:)，强烈振摇后静置20分钟，取下相重复上述操作3次；(6)将下相转移至lml离心管中，在40C水浴中加热20分钟，样品 于-20iC保存备用。中药样品的筛选 实验步骤(1) 包被酶浓度4Mmo1/1，包被緩沖液TN，包被量50pl/孔，25"C 包被l小时，TN洗板；(2) 在包被板上50|a 1/孔加入5.5nmo1/1 TT， 25X:活化10分钟， TN洗板；(3) 在包被板上50y 1/孔加入待测样品，每个样品3个复孔，25X: 孵育20分钟，TN洗涤；同时每板均设定阴性对照(2%DMS0的TN緩沖 液)和阳性对照赛尼可(0. Olmg/ml,溶于2%DMS0的TN緩冲液)。(4 )在包被板上50 u 1/孔加入底物RES 4 m g/ml， 37tl反应45分钟， 分别测定O分钟和45分钟的荧光强度FI，计算抑制率，抑制率^50% 为阳性。t 样品孔45分钟-样品孔O分钟、抑制率=1---^^;;;-;;^^——X J 。() ％对照孔45分钟-W对照孔O分钟筛选结果制备5 0种中药样品，按上述中药样品筛选所述步壤测定狭脂肪酶 抑制率；同时，采用相当于实际包被在酶标板上的胰脂肪酶浓度 (6.56nmo1/1)，采用固相包被筛选方法同样的反应条件，但在均相
反应体系中，测定同样样品的胰脂肪酶抑制率，结果见困6和困7, 由图6和图7可见，在均相体系中样品的阳性率非常高(抑制率250% 样品18个)，大大髙于在固相包被体系中的阳性率(抑制率)250% 样品2个)。由此可见，在胰脂肪酶这类需要界面活化的酶的抑制刑筛选中， 以中药提取物为筛选对象时，采用固相包被方法可以减少阳性率。根 据我们的分析，这些阳性结果中包括表面活性物质、非特异性物质等 造成的假阳性结果，实施例1样品叶下珠，采用上述筛选模型，在提取物浓度为2.5mg/ml时检 测其抑制率为84%。复筛检测其IC50为1. 5mg/ml。采用粪便总脂重量法在动物水平检验样品对胰脂肪醉的抑制活 性。选择体重为200 ± 20g的SD大鼠分为3组，每组8只。禁食3h 灌胃2ml高脂乳剂后，阴性对照、阳性对照和样品组分别灌胃2ml生 理盐水、塞尼可和样品，收集48h内的所有粪便。将粪便在60t:烘干 研磨后，取500mg加入10ml30yt酸在沸水浴中处理15min，冷却后加 入乙醚萃取，取上层乙醚萃取液在60X:挥干并称重，换算得到粪便中 含有的未吸收总脂含量。通过测定阴性对照和样品组粪便中的总脂含 量，计算各自粪便中未吸收总脂占给入总脂的百分含量1%，评价样品 对胰脂肪酶的抑制活性。在10mg/kg剂量条件下，赛尼可和叶下珠提 取物的1%分别为36. 5%和16. 3%。这证明采用上迷基于固相包被的筛选模型，从中药中筛选胰脂酶 抑制剂是有效和可靠的。该筛选模型为开发减肥药物提供了一个很好 的技术平台。
权利要求
1.一种从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的筛选方法，其包括a.将胰脂肪酶采用固相包被方法包被在酶标板上；b.洗涤后加入活化剂对酶进行活化；c.洗涤后加入中药提取物样品进行孵育；d.洗涤后加入底物孵育；e.测定反应一定时间后的荧光强度变化，计算样品的抑制率。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用一定浓度的三油 酸甘油酯对固相包被的狭脂肪酶进行活化.
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于对酶进行活化后，经 洗涤后再加入样品孵育。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于加入中药提取物样品 孵育一定时间后，经洗涤后再加入底物反应。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于以试囟灵甘油醋为底 物，以572nm波长光激发，在590nm波长处检测荧光。用酶标仪测定 反应一定时间后样品孔和对照孔的荧光强度变化，计算中药样品对胰 脂肪酶的抑制率。
全文摘要
本发明公开了从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的筛选方法。该方法采用固相包被方法，将胰脂肪酶包被在微孔酶标板上；通过加入活化剂，确保胰脂肪酶转化为具有活性的开放构象；洗涤后加入中药提取物样品孵育，洗涤除去不结合或结合力弱的物质；洗涤后加入底物在一定条件下反应，测定生成产物的荧光强度，计算样品的抑制率。本方法可用于中药提取物样品的筛选，可以减少样品中表面活性物质、非特异性物质等造成的假阳性结果，提高筛选命中率。
文档编号C12Q1/25GK101131389SQ20061011169
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者于军平, 余琴芳, 芳 冯, 周天浩, 廖玉华, 柴婴蕾, 殷秀飞, 汪家权, 洪孟学, 柳 胡, 莲 薛, 赵民军 申请人:浙江养生堂天然药物研究所有限公司