专利名称：一种分离牛骨髓间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离牛骨髓间充质干细胞的方法。
背景技术：
随着生命科学事业的高速发展，地方品种的改良工作越发变得简单化，使很多地方特色品种开始流失，不断有新的品种产生，所以，品种基因库的建立就显得十分重要。牛骨髓间充质干细胞是良种牛基因库的种子细胞之一，同时骨髓间充质干细胞具有一定的医学应用价值。骨髓间充干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)，最初是由Friedenstein发现的一类易于贴附于塑料培养板表面的细胞，后来的研究证实在不同的诱导条件下，具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力。Kopen等的研究发现，骨髓间充质干细胞注射到新生鼠的侧脑室后可分化为神经元和神经胶质细胞，并具有一定的迁移能力。这提示骨髓间充质干细胞可能具有更加广泛的分化潜能。如果能在体外定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，不仅有助于研究神经细胞的发育机理，而且对于治疗早老性痴呆和帕金森氏症等多种神经系统疾病都具有重要意义。
目前报道MSCs分离比较困难，经常受到造血祖细胞的污染。常用的MSCs分离与培养方法有1、密度梯度离心法根据MSCs与其它细胞的密度不同而采用Percoll分层液将其分离出来，但MSCs的获得率很低；2、贴壁筛选法根据MSC具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离，一般以4-12小时贴壁细胞为宜，虽然分离MSCs起初很均一，但克隆形成率低；3、流式细胞仪分选法根据MSCs细胞体积小，相对缺少颗粒的特性利用流式细胞仪对MSCs进行分选，但共聚焦激光对细胞的活性有毒害作用；4、免疫磁珠分选法可以根据MSCs表达的某些细胞表面标志进行富集或根据其表面负表达的抗原进行负分选，其效率和纯度较高，但针对MSCs特异性表面抗原费用昂贵、操作复杂、分选难度大。
目前鉴定MSCs主要依赖在培养诱导分化过程中MSCs所表现出来的干细胞特性及其分化后的成熟细胞表型特征来鉴定。MSCs存在不同形态和大小的细胞，大的增殖慢为成熟的MSCs，而小的增殖快为RS细胞，也有学者分离的人MSCs形态为均一的长梭形的成纤维细胞样细胞。Pittenger等(Pittenger M F，Mackay A M，Beck S C，et al.Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal StemCells[J].Science，1999，284143-147.)认为人MSCs是骨髓源性的成纤维样细胞，在一定的条件下分化为三个主要的细胞系骨分化，脂肪分化，软骨分化。鉴定MSCs不但要检验其干细胞特性同时要检验其是否可以分化为以上细胞系的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离牛骨髓间充质干细胞的方法。
本发明所提供的分离牛骨髓间充质干细胞的方法，是将牛骨髓单细胞悬液加入密度为1.082的Percoll细胞分离液中进行离心，取液面交界处的云雾状单个核细胞层，接种于塑料容器中进行培养，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。
牛骨髓单细胞悬液与密度为1.082的Percoll细胞分离液的体积比可为1∶1。
所述牛骨髓单细胞悬液为不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液。
所述离心条件为80g离心30min。
所述接种密度为1×105个细胞～1×107个细胞/cm2，优选为1×107个细胞/cm2。
本发明分离牛骨髓间充质干细胞的方法简单、经济实惠，可操作性强，可以有效提高牛骨髓间充质干细胞分离纯化效率(细胞纯度高达98％)；相对于流式细胞仪分选法对细胞的损伤较小，相对于免疫磁珠分选法更经济实用，相对于全骨髓法纯度更高；可降低牛骨髓间充质干细胞的纯化成本。本发明方法分离纯化的骨髓间充质干细胞，体外定向诱导分化为跨胚层的多种细胞，具有广泛的医学应用前景；可以作为种子资源保护的重要途径和手段，是建立良种基因库的种子细胞之一。
图1a为本发明方法分离筛选的高纯度MSCs集落(×200)图1b为形成集落的MSCs原代培养细胞的瑞士-姬姆萨复合染色照片(×200)图2a为第2代牛MSCs(×100)照片图2b为第10代的牛MSCs形成的集落融合形成水纹状(200×)图2c为第10代接近融合的牛MSCs生长旺盛期，胞浆饱满，多个核仁(×400)照片图2d为照片第15代的牛MSCs形成的集落染色照片(×200)
图3为第12代牛骨髓间充质干细胞的多细胞集落(100×)照片图4为第12代牛骨髓间充质干细胞经吉姆萨染色鉴定的MSCs为单核细胞(100×)照片图5为牛骨髓MSCs的生长曲线图6为P3、P7和P12代细胞贴壁率图7a-图7e为骨髓间充质干细胞经4h定向诱导分化获得的各类神经细胞(×400)照片图8为骨髓间充质干细胞经24h定向诱导分化的神经细胞(×400)图9为牛MSCs诱导分化为脂肪细胞第5h(×400)照片图10为脂肪细胞融合形成的小脂肪滴第48h(×400)照片图11为脂肪细胞融合形成的大脂肪滴第60h(×400)照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、牛骨髓间充质干细胞的分离1、骨髓间充质干细胞的分离及其原代(第一代)培养无菌条件下分离出牛(2～6月龄)股骨骨髓，使用带有4号针头的5ml注射器冲出骨髓，置于消毒的大培养皿中，将骨髓液依次经7号和4号针头轻轻吹打，过200目滤网，制成单细胞悬液。将单细胞悬液用不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS-)冲洗3次，重新悬浮后将细胞悬液以1∶1的体积比轻轻加入4℃预冷的密度为1.082的Percoll细胞分离液(购自美国Sigma公司，配方Percoll原液25.65mL+1.5moL/L NaCl溶液24.35mL)的试管中，80g离心30min取中间(液面交界处)的云雾状单个核细胞层，以PBS清洗2次准备接种。
将细胞悬液以1×107个细胞/cm2的密度接种于装有完全培养基的直径为35mm的塑料培养皿。每个培养皿加1.5ml完全培养基，置于37℃，体积分数为5％的CO2，饱和湿度条件下培养。在接种后48小时和72小时分别连续2次全量更换培养基，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。以后每2d～3d半量换液1次。在完全培养基中培养11至13天，获得骨髓间充质干细胞的原代培养物。其中，采用的完全培养基为L-DMEM+25％(体积百分含量)马血清+10％(体积百分含量)条件培养液+1％(质量百分含量)L-谷氨酰胺+1μmol/L的氢化可的松。其中，条件培养液按照如下方法配制无菌分离犊牛股骨骨髓5ml，加入10mL含有20％(体积百分含量)的胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺的L-DMEM培养液培养2d～3d，收集培养液，离心取上清液制成条件培养液。
上述细胞的形态学观察结果表明，刚接种时，骨髓细胞悬液中的细胞呈圆形，大小不一，不能辨认细胞核，接种后第1天至第3天，可见形态相对均一的折光性较强纺锤形细胞，以及少量的成纤维细胞样的细胞，以后细胞逐渐增多，接种后第4天至第5天细胞进入对数生长期，细胞生长较快；接种后第11天至第13天细胞生长进入平台期，细胞数量扩增减慢，并开始出现融合，而且细胞逐渐出现多种形态，成纤维细胞样的细胞开始增加，可见少量大而扁平的细胞。牛骨髓间充质干细胞极易发生分化，接种密度低更不利于其生长，所以原代培养细胞密度适中(1×107个细胞/cm2)，接种后第3天至第4天形成典型集落，集落的细胞在50-100个左右(图1a)，同时可见一些微克隆。对形成集落的原代培养细胞进行瑞士-姬姆萨复合染色，光镜观察，细胞形态呈梭形状，胞核着粉红色，胞浆不着色，未见纤维丝等结构，各代之间形态较一致，细胞核有1-2个核仁，呈圆形(图1b)。
2、牛骨髓间充质干细胞的传代培养接种后第11天至第13天，原代(第一代)培养细胞生长融合后，用0.25％(质量百分含量)胰蛋白酶和0.1mmol/L的EDTA消化(消化前预热消化液，PBS冲洗细胞3次，以去除死细胞)，在倒置显微镜下观察，大约1min，当细胞突起回缩，细胞之间间隙增大，细胞接近圆形时，轻轻吹打平皿底壁，制成细胞悬液。80g离心6min弃上清液后，1∶2传代(由一个35mm平皿牛骨髓间充质干细胞经消化离心洗涤后，传代接种到2个35mm塑料平皿)，置于体积分数为5％的CO2饱和湿度，37℃培养箱中进行第二代细胞的培养，培养5-7天后，再按照上述方法进行传代、培养第三代细胞，第三代细胞培养3-4天后，再按照上述方法进行传代、培养第四代细胞。第四代细胞培养3-4天后，再按照上述方法进行传代、培养直至第十五代细胞。第十二代细胞以后，细胞形态逐渐变得不均一，细胞突起增多，大量多角形细胞出现，并且增殖能力逐渐减弱，4-6天才可达到完全融合。其中，所用的传代培养基为L-DMEM培养液+120mL/L FBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素。
传代细胞的形态学观察结果表明，牛MSCs原代细胞一经传代小圆形细胞均不见，第二代细胞主要为梭形、多角形(图2a)，呈现很多集落样细胞并融合成片，但是细胞间存在接触抑制，传代培养的细胞呈集落生长并融合成片，第二代牛MSCs形成的集落染色为单核，细胞呈梭形圆形和三角形，传至第10代的牛MSCs细胞集落融合形成水纹状(图2b)。原代培养接种密度适宜，虽然只见少数50-100个细胞组合的小集落，传代培养中可见大量集落形成并融合成片，第10代的细胞纯度高达98％，第10代细胞培养17天后发生融合的牛MSCs细胞成长旺盛，胞浆饱满，多个核仁(图2c)，第15代的牛MSCs细胞形成的集落染色结果如图2d。
细胞传到第12代以后，培养4-6天后，形成多细胞集落(图3)，第12代牛骨髓间充质干细胞经吉姆萨染色鉴定为单核细胞(图4)，纯度达98％。
3、牛骨髓MSCs生长曲线的绘制取原代以及对数生长期的P2(第二代)、P5(第五代)和P9(第九代)代MSCs，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为4×103cells/cm2，接种于4个24孔板中，每孔400μL。置38.5℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中孵育。每72h换液一次，每过24h分别取4孔细胞消化，用细胞计数板计数细胞数量，每孔重复3次，取平均值，以细胞生长时间为横坐标，以细胞数(×200cells/cm2)为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
根据细胞计数绘制出的生长曲线(图5)表明，接种后的原代细胞，1-5天为生长静止期，此期主要为细胞适应体外环境，贴壁增长阶段，增殖较慢；7-11天为对数增长期，此期细胞生长活跃，增殖较快；此后细胞由于接触紧密，相互间存在抑制作用，增长逐渐减慢，进入平台期，此时应及时传代。传代后可见，细胞静止期为1-2天、对数生长期为4-7天，之后进入平台期，均明显缩短。
4、牛骨髓MSCs贴壁率的测定制备P3(第三代)、P7(第七代)和P12代(第十二代)单细胞悬液，以4×103cells/cm2的浓度分别接种于3个24孔板中，每孔400μL，于38.5℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度条件下培养。每过1h分别取出每个培养板的三孔细胞，吸去培养液，用PBS冲洗三次，以充分除去未贴壁细胞。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液室温下消化(1-2min)贴壁细胞并计数，取平均值，按下式计算每个时间点的贴壁率。
分别取各代细胞贴壁率的平均值，以贴壁时间(h)为横坐标，以贴壁率(％)为纵坐标，绘制各代细胞贴壁率曲线。
绘制的细胞贴壁率曲线(图6)表明，在接种1h后各代MSCs均有少量贴壁，倒置相差显微镜下观察发现细胞形态发生变化，逐渐向梭形细胞形态改变，表现出贴壁迹象。12h后P3和P7代细胞接近全部贴壁，P12代也有80％的细胞贴壁，24h后P12代细胞全部贴壁。此时可以全量换液除去未贴壁的杂细胞以及在消化离心过程中死去的MSCs，保持培养皿细胞的干净，利于整个MSCs的稳定生长。
5、骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞取纯化率达90％以上的接近融合的P3和P11代MSCs消化，调整细胞浓度，以4×103cells/cm2分别接种于预先置有盖玻片的两个六孔板中，分为两组(预诱导组和诱导组)，待细胞生长至70-80％融合时弃去培养液，用PBS-冲洗三遍。预诱导组和诱导组中分别加入含3mmol/L的β-巯基乙醇(β-ME)的L-DMEM(含120mL/LFBS)预诱导24小时。预诱导24h后，试验组再加入含5mmol/L的β-巯基乙醇的L-DMEM(无FBS)进行正式诱导。开始正式诱导后的第10h加入神经细胞培养基(L-DMEM培养液+120mL/LFBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素)。每隔0.5h在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。
结果表明牛MSCs在含β-ME的DMEM(含120mL/L FBS)预诱导液中处理24h后，部分细胞形态发生改变，细胞开始有少量突起长出，细胞变长，细胞质变得致密，正式诱导1h后细胞形态变化更加明显，大多数细胞原来宽大扁平的胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，细胞突起开始变长，正式诱导第4h梭形细胞回缩，变圆变亮；大而扁平的细胞胞质也向核收缩，变为不规则形和圆形，小部分细胞开始脱壁死亡。整个诱导过程中细胞质呈分叶状，并有少数细胞开始大量分泌细胞基质，逐渐变为星状向周围发散(图7a-7e)。正式诱导第6h后大多数细胞均转变为类似于神经细胞的形态，突起伸出轴突，并在轴突末端出现一级和二级分支，类似树突。倒置显微镜下可见简单的双极细胞，也有复杂的多极细胞拉网，有生长锥形成，还有胶质样细胞。正式诱导后的第10h加入神经细胞培养基(L-DMEM培养液+120mL/LFBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素)。随着神经元分化成熟，神经元不再增殖，数量不再增加。正式诱导24h后，大部分细胞分化出具有典型神经元表型的细胞(图8)细胞胞体呈椭圆形、三角形或不规则形，折光性强，细胞长出较长的突起，呈双极或多极形，可见核及核仁，且细胞数无明显增加。在神经分化过程中，细胞在形态上也发生类似于巨噬细胞自嗜现象的变化细胞核与胞质的比例增大，胞质收缩并部分丢弃，突起形成后又大部分瓦解变性；少部分突起保留并逐渐延长，有生长锥形成。少数分化细胞开始脱落，即停止诱导分化，在不换液的情况下细胞可继续存活3-4d。
6、骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞Peister认为骨髓间充质干细胞是骨髓源性的成纤维细胞样细胞，并且在一定条件下可以分化为中胚层的脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。
取第12代的牛骨髓MSCs按1.0×104/cm2密度做爬片，共做10个细胞爬片，细胞生长80-90％融合时直接做诱导。诱导液为L-DMEM+25％(体积百分含量)胎牛血清+1％(质量百分含量)L-谷氨酰胺，在前三周的培养结束以后，继续使用马血清培养(是在L-DMEM+25％(体积百分含量)马血清+1％(质量百分含量)L-谷氨酰胺的培养基中培养)，由于马血清中具有较高的脂质和糖皮质激素含量，而使骨髓间充质干细胞中出现大量脂质聚集，进一步形成脂滴，从而使骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞(图9-11)。可能是因为Erk活化程度与脂肪细胞分化呈反比，Erk磷酸化后，控制脂肪分化的转录因子-过氧化物酶激活受体γ(PPAR-γ)活性下降。ERK信号通路还调节骨髓MSCs向脂肪组织转化、阻断ERK信号通路、促进PPAR-γ表达增加，导致向脂肪细胞分化。虽然对ERK2的下游底物不清楚，但是可以肯定，其在调节MSCs分化为脂肪中起作用。
权利要求
1.一种分离牛骨髓间充质干细胞的方法，是将牛骨髓单细胞悬液加入密度为1.082的Percoll细胞分离液中进行离心，取液面交界处的云雾状单个核细胞层，接种于塑料容器中进行培养，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述牛骨髓单细胞悬液与密度为1.082的Percoll细胞分离液的体积比为1∶1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述牛骨髓单细胞悬液为不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述离心条件为80g离心30min。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述接种密度为1×105个细胞～1×107个细胞/cm2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述接种密度为1×107个细胞/cm2。
全文摘要
本发明公开了一种分离牛骨髓间充质干细胞的方法。该分离牛骨髓间充质干细胞的方法，是将牛骨髓单细胞悬液加入密度为1.082的Percoll细胞分离液中进行离心，取液面交界处的云雾状单个核细胞层，接种于塑料容器中进行培养，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。该分离牛骨髓间充质干细胞的方法简单、经济实惠，可操作性强，可以有效提高牛骨髓间充质干细胞分离纯化效率(细胞纯度高达98％)。本发明方法分离纯化的骨髓间充质干细胞，体外定向诱导分化为跨胚层的多种细胞，具有广泛的医学应用前景；可以作为种子资源保护的重要途径和手段，是建立良种基因库的种子细胞之一。
文档编号C12N5/06GK1908161SQ20061011264
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月28日 优先权日2006年8月28日
发明者董雅娟, 封纪武, 董方圆, 赵兴, 柏学进 申请人:莱阳农学院