专利名称：通过lpl检测高脂血症易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测高脂血症易感性的试剂盒，通过检测脂 蛋白脂酶基因(lip叩rotein lipase, LPL)的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测个体对高脂血症的易感 性。
背景技术：
由于脂肪代谢或运转异常使血浆中一种或几种脂质高于正常称为高脂血症(hyperlipidemia)，可表现 为高胆固醇血症(hyperchoesterolemia)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)或两者兼有(混合型 高脂血症)。脂质不溶或微溶于水，必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，才能在血液循环中运转，因此， 高脂血症常为高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemia)的反映。由于逐渐认识到血浆中高密度脂蛋白降低也 是一种血脂代谢紊乱，因而称之为血脂异常(dyslipidemia)更为全面、准确。目前WHO将高脂蛋白血症分 为五火类，主要为根据血浆脂蛋白升高的程度不同进行的表型分类家族性高乳糜微粒血症(家族性高甘
油三酯血症)、家族性高胆固醇血症(家族性高p脂蛋白血症)、家族性异常e脂蛋白血症、高前e脂蛋白
血症、混和型高甘油三酯血症(混和型高脂血症)。
脂蛋白的蛋白部分是一种特殊蛋白，因与脂质结合担负在血浆运转脂类的功能，故称为载脂蛋白 (apoprotein)。载脂蛋白除了与脂质结合形成水溶性物质，成为转运脂类的载体以外，还有其它特殊功能， 尤其是参与酶活动的调节，以及参与脂蛋白与细胞膜受体的识别和结合反应。血浆中的脂蛋白呈微粒状， 核心主要为甘油三酯和胆固醇酯，外层由磷脂、胆固醇、载脂蛋白构成。水溶性酶可透过表层进入内层起 作用。脂蛋白的代谢有两条途径①外源性代谢途径是指饮食摄入的胆固醇和甘油三酯在小肠中合成CM 及其代谢过程；②内源性代谢途径是指由肝合成的VLDL转变为IDL和LDL，以及LDL被肝或其他器官代 谢的过程。其中乳糜微粒CM不能进入动脉壁内， 一般不致动脉粥样硬化，但易诱发胰腺炎。血浆极低密 度脂蛋白VLDL水平升高是冠心病的危险因素。低密度脂蛋白LDL容易进入动脉壁并被氧化修饰，是主要 的致动脉粥样硬化的因素。高密度脂蛋白HDL水平升高有利于外周组织移除胆固醇，防止动脉粥样硬化发 生。
高脂血症(高脂蛋白血症)临床上可分为两类①原发性，属遗传性脂代谢紊乱疾病；②继发性，常
见于控制不良的糖尿病、饮酒、甲状腺功能减退症、肾病综合症、透析、肾移植、胆道阻塞、口服避孕药 等。血脂异常与心血管病，尤其与冠心病的发生和发展密切相关，是代谢综合症的组成成分之一。
己知部分原发性高脂血症是由先天性基因缺陷所致,如LDL受体基因缺陷可引起家族性高胆固醇血症。 而常见继发性高脂血症病因有下列几种
1、 高胆固醇血症糖尿病、肾病综合症、甲状腺功能减退、Cushing综合症；
2、 高甘油三酯血症糖尿病(未控制)、肾病综合症、尿毒症(透析时)、肥胖症、雌激素治疗、糖原贮 积症(I型)、饮酒、系统性红斑狼疮、异常Y-球蛋白血症、痛风；
3、 高异常脂蛋白血症各种原因引起的肝内外胆道梗阻、胆汁淤积性肝胆病、包括肝内胆小管性肝炎、
胆汁性肝硬化。
我国人群血脂平均水平低于发达国家，但其升高幅度却很惊人。我国对不同地区9组人群，从20世 纪80年代初至90年代末的20年间进行了 3次可比性调査，结果表明血清总胆固醇(TC)〉5.20mmo1/ L(200mg/dl)，男性患病率由17%连续上升至33%，女性患病率由9%连续上升至32%。因此，积极检出、 预防和控制血脂异常成为经济发达地区心血管病预防工作的主要内容之一。
SNP(single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DM 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占
大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性和对环境因素、药物反应的差异。
LPL蛋白编码基因位于第8号染色体的8p22区段，基因全长28.0kb， mRNA全长3550bp，具有10个 外显子，编码的蛋白含有476个氨基酸，编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达。LPL 以同型二聚体蛋白的形式行使功能，其分子生物学的作用包括两部分， 一部分为甘油三脂的水解酶作用， 另一部分则是受体介导的脂蛋白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变在严重的情况下可以导致I型髙 脂蛋白血症，而较轻程度则引起体内脂蛋白代谢的紊乱。LPL基因上rs320位点(SEQ ID NO: 1所示序列 中118位)是位于第8号染色体8P22上的脂蛋白脂酶LPL第8号内含子的多态，由T到G的改变使原有 的HindIII酶切位点消失。国内外研究表明LPL的HindIII位点与血脂水平相关。大样本的中国人群的关 联分析(共3000多例)结果显示带有H-单倍型的个体具有更低的甘油三脂水平和更高的高密度脂蛋白胆 尚醇水平，可能是保护个体不受到血脂异常危害的单倍型。
国内外的大量的关联分析表明，LPL基因上rs320号SNP位点基因型为G时能够降低甘油三脂水平， 保护个体不受到血脂异常的危害。这个SNP位点的多态性可用于评估个体对高脂血症的易感性，目前已通 过中国科学院国家生物基因检测技术应用评估认证中心的认证。
发明内容
基于LPL基因上rs320号SNP位点的多态性可用于评估个体对高脂血症的易感性的基础上，本发明提 供一种检测高脂血症易感性的试剂盒。
该试剂盒包括检测LPL基因SEQ ID NO: 1中第118位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq 酶、dNTP混合液、MgCh溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第118位SNP位点而设计，能特异性扩增 出SEQ ID NO: 1中包含第118位SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够 轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物对。特异性引物对可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第118位SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检测出这个SNP位点高脂血症易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能 够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的Taqman探针。特异性荧光探针可用 常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这条探针，所有 可用于荧光定量PCR检测SEQ ID NO: 1中第118位SNP位点的探针均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括 lfil 10 X荧光定量PCR反应缓冲液， 0. lul 25raM dNTP混合液， 0.5nl 25mM MgCh溶液， 0. 02n 1 (5un i t s/p 1) Taq DNA聚合酶， 20nM特异性引物对(二条)各0.225nl， lO(xM特异性荧光探针O. 25^1， 去离子水5. 68^1。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用可检测高脂血症易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和炎光探针
有义引物5' - AGGGTGAGATTCCMGATM -3' (SEQ ID NO: 2) Tm值为56°C
反义引物5' - CMGCAAATGACTMAGAGM -3'(SEQ ID NO: 3) Tm值为56'C 荧光探针5' - CGCTATAGGATTTMAGCTTTTATA -3' (SEQ ID NO: 4) Tm值为64°C 炎光定量PCR反应体系为总体积10nl，包含浓度为20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. lul 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCl2溶液、0. 02pl (5units/>l) Taq DNA聚合酶、 20nM的有义引物和反义引物各0.225^1、 1(HiM的荧光探针0.25nl，去离子水5.68nl。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95°C、 10分钟，进行60个循环的 95°C、 30秒，60'C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。 步骤3: SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针最终的荧光信号明显高于正 常对照，说明被检测DNA的LPL基因上rs320号SNP位点基因型携带有T型，为高脂血症易感型。
实施例2.指导人们主动预防高脂血症的服务
目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取
对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问巻调査表。依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的LPL基因上rs320号SNP位点同时进行荧光定量PCR检 测，确定这个SNP位点的基因型。
步骤3:指导人们主动预防高脂血症
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告。基因检 测报告详细说明了被检测者高脂血症易感程度的高低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检测 者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调查结果，评估被检测者高脂血症遗传易感的相 对风险。同时制定出针对于被检测者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建 议等，并为被检测者普及预防高脂血症的健康知识。 序歹U表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>通过LPL检测高脂血症易感性的试剂盒
<歸4
<210> 1 <211〉 300 <212>醒 <213〉人属，
人禾中(Homo sapiens, human)
<400> 1
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gttattgtta atttaaaaaa 180
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〈210〉 2
〈211〉 20
<212> DNA <213〉人工序列
<220>
<223>引物
<400> 2
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<220>
<223>引物
〈 3
casgca肪tg ax;t833gaga 3
21
<210〉 4 <211> 25 〈212> DNA <213〉人:l:序列
<220>
<223>探针 <400〉 4
cgctatagga tttaaagctt ttata 2权利要求
1.一种检测高脂血症易感性的试剂盒，包括检测LPL基因SEQ ID NO1中第118位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: 1中第118 位SNP位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ ID NO: 1中第118位SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第 118位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这个SNP位点高脂血症易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO: 2和3所 示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO: 4所示 序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lμl 10X荧光定量PCR反 应缓冲液，0. lμl 25mMdNTP混合液，0. 5μ1 25mM MgCl2溶液，0.02μ1 (5units/μl) Taq DNA聚合酶，20μM 特异性引物对(二条)各0.225μl， 10μM特异性荧光探针0.25μl，去离子水5.68μl。本试剂盒供一人份 检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃ 。
全文摘要
本发明公开了一种检测高脂血症易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测LPL基因SEQ ID NO1中第118位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测分析个体的LPL基因上的SNP位点基因携带型来预测个体对高脂血症的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101173310SQ200610117930
公开日2008年5月7日 申请日期2006年11月3日 优先权日2006年11月3日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司