专利名称：Leydig细胞的分离方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织工程和细胞移植中的种子细胞，尤其涉及睾丸间质内细胞 的分离方法及其用途。
背景技术：
雄激素缺乏症在男性科、泌尿外科及整形外科等许多相关临床科室都很常 见。近年来，随着生活节奏加快、工作压力增加、肥胖和人口老龄化等问题的 出现，雄激素缺乏患者有逐年上升的趋势，并已成为世界范围内严重威胁男性 健康和生活质量的难治性疾病。目前临床上针对雄激素缺乏的治疗仍无长期稳 定的有效措施。较常用的方法是补充外源性睾酮治疗，但睾酮补充治疗需长期 应用，且无法达到人体有节律睾酮分泌的生理要求，最终常会引起高血压、水 钠潴留等一系列并发症。因此，如何有效地治疗这类疾病已成为越来越多研究 者关注的热点。
哺乳动物雄性激素主要由睾丸间质内莱迪希氏(Leydig)细胞和肾上腺髓质 网状带产生，其中由Leydig细胞产生的雄性激素占全部水平的95%，是体内雄 激素的最主要来源。因此，要从根本上治疗雄激素缺乏症，关键是如何有效恢 复体内Leydig细胞的数量和功能。已有诸多研究证实，Leydig细胞移植能显著 提高受体血雄激素水平。
Leydig细胞是存在于睾丸间质内的一种内分泌细胞，其主要功能是在下丘 脑一垂体促性腺激素轴的调解下分泌睾酮等雄性内分泌激素，因此，体外分离 纯化的Leydig细胞常被用于雄激素水平低下的细胞治疗研究。
许多研究证实，成熟的Leydig细胞为终末分化细胞，不具备有丝分裂能 力，其在体数量的维持主要依靠Leydig细胞的干细胞(stem Leydig cells,SLC) 及前体细胞(Progenitor Leydig cdls,PLC)。所以，分离和纯化后所得细胞内SLC 和PLC的存在将直接影响Leydig细胞数量和睾酮生成功能的维持。
目前获得高纯度Leydig细胞的经典方法是细胞淘洗及Percoll密度梯度离 心，其最突出的缺点是分离技术繁杂，操作步骤多，历时长。经过此两种分离
方式后，细胞损伤很大，获得率低，存活率低，难以扩增，且不能在体外维持 长久的睾酮生成功能，很难满足细胞治疗及组织工程化组织构建对细胞数量和
功能的双重要求。而且在这些操作过程中，会造成Leydig干细胞和前体细胞的 大量流失，导致Leydig细胞数量和功能无法长期维持。
因此，本领域迫切需要一种获得大量有功能的Leydig细胞的方法，以解 决细胞治疗研究和雄激素分泌组织构建技术发展的瓶颈问题。
发明内容
本发明旨在提供一种获得大量纯度高且含有干细胞和前体细胞的Leydig 细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供上述方法得到的Leydig细胞的用途。 本发明的再一个目的是提供一种由上述方法得到的Leydig细胞构建的移 植物。
在本发明的第一方面，提供了一种获得Leydig细胞的方法，它包括步骤-
a. 将用胶原酶消化的睾丸组织通过孔径为20-100拜的滤网过滤，得到睾丸 间质组织内细胞；
b. 将获得的睾丸间质组织内细胞在培养液中培养10分钟-4.5小时，取贴壁细 胞得到Leydig细胞。
在另一优选例中，步骤(a)前还包括步骤去除白膜和可见血管，用胶原酶 消化睾丸组织至结构松散而曲细精管基本连续的状态。
在另一优选例中，步骤a中所用的胶原酶浓度0.01-5%，其中所含的胶原酶消 化液与睾丸组织的体积(毫升)重量(克)比为1-5: 1。
在另一优选例中，所述的胶原酶选自I型胶原酶、II型胶原酶或复合胶原酶。
在另一优选例中，所述的胶原酶是复合胶原酶。
在另一优选例中，所述的复合胶原酶是NB4。
在另一优选例中，胶原酶消化睾丸组织的时间为3-30分钟。
在另一优选例中，用0.25。/。复合胶原酶NB4消化5分钟。
在另一优选例中，所述的过滤网孔为25-50拜。
在另一优选例中，所述的过滤网孔为30-40nm。
在另一优选例中，所述的过滤网孔为33pm。
在另一优选例中:
在另一优选例中: 在另一优选例中: 在另一优选例中: 在另一优选例中: 在另一优选例中:
连续性。
在另一优选例中:
羊、猪、牛、人。
步骤b中贴壁培养时间为0.5-3小时。 步骤b中贴壁培养时间为2小时。 步骤b的培养液中含血清0-10%。 所述的培养液中含血清0-1%，更佳地0%。 步骤a中的睾丸组织取自哺乳动物。
步骤a中的睾丸组织应保持睾丸形态的完整和曲细精管的 步骤a中的睾丸组织取自小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、
在本发明的第二方面，提供了一种由上述方法得到的Leydig细胞，所得到的 细胞中含有0.1-20。/。Leydig干细胞(stemLeydig cells, SLC)及前体细胞(Progenitor Leydig cells, PLC )。
在本发明的第三方面，提供了由上述方法获得的Leydig细胞的用途，它包括:
(i) 所述的Leydig细胞用作构建组织工程化雄激素分泌组织的种子细胞；
(ii) 所述的Leydig细胞用作体内细胞移植，包括全身皮下、肌肉组织内、腹腔 内、肾包膜内、睾丸鞘膜腔内、睾丸原位皮下、腹股沟、静脉内及微包囊包裹后上 述部位移植。
(iii) 所述的Leydig细胞也可用于有关Leydig细胞的细胞生物学、发育生物学、 免疫学、毒理学及药理学等研究与应用。
在本发明的第四方面，提供了一种Leydig细胞悬液，它包括(l)细胞培养液;
和(2) Leydig细胞，所述的Leydig细胞中含有0.1-20%Leydig干细胞(SIX)及
其前体细胞(PLC)。
在另一优选例中，所述的细胞培养液中含血清0-10%。 在另一优选例中，所述的培养液中含血清0-1%，更佳地0%。
在本发明的第五方面，提供了一种组织工程化雄激素分泌组织移植物，它 包括(a)生物可降解材料；和(b)接种于所述生物可降解材料的由上述方法获 得的Leydig细胞。
据此，本发明提供了一种获得大量有功能的Leydig细胞的方法，并由此提 供了大量有功能的Leydig细胞及其应用。
图1显示了差速贴壁法获得的Leydig细胞纯度鉴定的结果。其中， A表示差速贴壁2小时间质Leydig细胞；
B表示酶消化收集差速贴壁2小时间质Leydig细胞，3|3-HSD特异性酶-底物反应结果，阳性细胞呈蓝色；
C表示流式细胞仪检测结果，即3p-HSD阳性细胞百分比，细胞纯度可达 到95%;
D表示空白对照的流式细胞仪检测结果。
图2显示了差速贴壁法获得的原代Leydig细胞免疫学鉴定的结果。其中， A表示3p-HSD特异性酶-底物反应结果，阳性细胞胞浆内可见蓝紫色着色； B表示3P-HSD免疫细胞化学反应结果，阳性细胞胞浆内见棕色颗粒； C表示3P-HSD免疫细胞化学反应结果，激光共聚焦见阳性细胞胞浆内 FITC荧光；
D表示免疫细胞化学激光共聚焦阴性对照细胞结果，呈阴性反应。 图3显示了原代Leydig细胞形态及拉网现象。其中， A表示2小时差速贴壁细胞培养24小时完全铺展；
B为A图局部放大，可见梭形(+)和多边形(A)两种形态铺展细胞，其中有 胞核中心折光性较强的明细胞(A)和折光性较差的暗细胞(A);
C表示在低密度培养状态下，Leydig细胞间成相互联结的"拉网"现象； D为C图局部放大，可见明细胞核中央的强折光现象(A)和细胞间的"拉网" 联结现象；
E表示Leydig细胞HE染色结果，可见多边形铺展细胞的形态和边界轮廓；
F表示3p-HSD特异性酶-底物反应可见梭形(+)和多边形细胞(A)均呈阳性 反应，可见双核细胞(t);
G表示透射电镜下Leydig细胞表面分布微绒毛(A)，细胞核(N)形状不规则， 胞质内富含线粒体(+)，滑面内质网发达(A)，可见脂滴。
图4显示了传代Leydig细胞的拉网现象。其中，A表示第一代Leydig细胞倒置相差显微镜下见拉网现象，可见两种形态 Leydig细胞(xl00);
B表示第一代Leydig细胞拉网现象(x200);
C表示第二代Leydig细胞倒置相差显微镜下见拉网现象更明显，细胞形态 以梭形Leydig细胞为主(x40);
D表示第二代Leydig细胞拉网现象明显(x200);
E表示扫描电镜下Leydig细胞群间的拉网现象(x2500);
F表示扫描电镜下Leydig细胞拉网现象(x6000)。
图5显示了成熟Leydig细胞的老化现象。其中，
A表示原代Leydig细胞无血清培养7天，细胞形态良好，无肉眼可见细胞 凋亡现象(xlOO);
B、 C表示原代Leydig细胞以含5%胎牛血清培养液培养7天，细胞几乎 全部死亡，培养液上清内可见凋亡细胞(B: xlOO;C: x200);
D表示培养上清内凋亡细胞透射电镜观察结果，可见核固縮、细胞质崩解 现象。
图6显示了分离所得Leydig细胞群内含有一定比例的SLC和PLC。其中， A表示了所得Leydig细胞群内部分细胞表达干细胞和前体细胞特异性蛋 白ABCG2 (箭头所示)。
图7显示了原代及传代细胞在HCG刺激前后的睾酮分泌水平。 图8显示了滤网孔径对所得Leydig细胞纯度的影响。其中，
A、 C表示400目滤网过滤所得细胞贴壁培养24小时结果，见细胞生长良
好，形态以梭形和多边形伸展为主(A: x4; C: ><100);
B、 D表示150目滤网过滤所得细胞贴壁培养24小时结果，见细胞生长良
好，形态以梭形和多边形伸展为主，细胞密度分别较A和C为低(A: x4; C: x腦)。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入地研究，意外地发现用胶原酶消化后的睾丸组织分
散完全；再通过孔径为20-100)am的过滤网过滤，可以去除其它细胞的干扰，保 留较多数量的体积较小的Leydig细胞；并通过差速贴壁时间的选择，确定了最 佳贴壁终止时间，从而收集到大量纯度高、功能良好的Leydig细胞。 本发明提供的获得Leydig细胞的方法，首先应获取睾丸组织。所述的睾丸 组织可取自啮齿类动物或哺乳动物。具体地，包括(但不限于)小鼠、大鼠、兔、 猴、狗、猫、羊、猪、牛、人等。所需的睾丸组织已将外层的白膜和较大的血 管剥离，且应保持睾丸形态的完整和曲细精管的连续性。
然后将所获得的睾丸组织进行消化，可以使用本领域熟知的方法进行消
化。所使用的胶原酶选自(但不限于)i型胶原酶、n型胶原酶、IV型胶原
酶等，或其组合。 一种优选的方法是使用复合胶原酶，可含有I型胶原酶、II 型胶原酶、中性蛋白酶、clostripain、胰蛋白酶。
更优选购自德国Serva公司的NB4，它含有I型胶原酶和II型胶原酶。本 发明消化睾丸组织所使用的酶消化液量与组织量选用l-5:l(体积重量比)，优选 1-3:1，更优选3:1。
睾丸组织在去除白膜和肉眼可见血管后，基本组成成分包括间质和曲细 精管，间质内主要细胞组成为各分化阶段的Leydig细胞及少量的巨噬细胞、淋 巴细胞和白细胞等；曲细精管的主要细胞组成为各级生精细胞、支持细胞和管 周膜成肌样细胞。所有这些细胞中只有各分化阶段的Leydig细胞及支持细胞、 管周肌样细胞具有较强的贴壁生长能力。各级生精细胞的贴壁生存必须依赖于 支持细胞的存在。要提高各分化阶段的Leydig细胞的获得率并尽量减少曲细精 管细胞的混杂，所需的消化时间与消化酶的浓度有关， 一般是消化至睾丸组织 形状刚好消失，曲细精管间组织松散，但曲细精管连续而无明显断裂时，终止 消化。酶浓度选自0.01-5(w/v)%，优选0.1-0.3%，更优选0.25%。消化时间相 应地选自3-30分钟，优选4-8分钟，更优选5分钟。使用本领域熟知的方法终 止消化，如(但不限于)加入等量或过量的培养液或磷酸缓冲液(PBS)终止消化。
可以使用本领域熟知的方法，对消化后获得的细胞进行筛选， 一种优选的 方法是通过滤网去除不需要的细胞。滤网孔径为20-100pm，优选30-40,，更 优选33阿。
对于筛选后的细胞，利用本领域熟知的方法进行接种、培养。接种密度 l-3xl04/cm2，优选1.5-2.5xl04/cm2，更优选2x 104/cm2。可以使用本领域熟知的 培养液进行培养，如(但不限于)DMEM，优选DMEM/HAM，S F-12 (1: 1)培 养液。培养液中添加的血清含量为0-5(v/v)%，优选0-1%，更优选不含血清。
可以使用本领域熟知的方法收集贴壁细胞得到Leydig细胞。本发明优选差
速贴壁法获得高度纯化的Leydig细胞。尽管Leydig细胞与其它贴壁细胞的贴 壁时间差异很大，但如果终止差速贴壁时间选择不当仍会影响Leydig细胞的得 率和纯度。终止时间过早，可能会有部分Leydig细胞未完成贴壁或贴壁不牢固， 会降低细胞得率；而终止时间过长，由于细胞的沉淀、堆积很难清洗去除其它 混杂细胞，从而降低细胞纯度。并且，由于Leydig细胞的增殖能力明显低于其 它贴壁细胞，少量混杂细胞的存在都可能会对Leydig细胞纯度造成很大影响。 如果澈底清洗去除这些非特异吸附的混杂细胞，势必会造成刚贴壁Leydig细胞 的部分流失及细胞损伤，从而降低细胞纯度和活力。本发明通过差速贴壁时间 的选择，确定较佳的贴壁培养时间，以获得数量充足、功能良好的Leydig细胞。
差速贴壁时间的选择方法如下将培养细胞分为几组，接种后，按组别分 别培养不同的时间，如5分钟-72小时，然后分别收集未贴壁的悬浮细胞和培 养液，转移至各组相应的新的培养皿内培养，经24小时后去除未贴壁细胞和 培养液。而同时各组原培养皿贴壁细胞加培养液继续培养。转移后培养的细胞, 如果24小时内无再贴壁，而原培养盘内Leydig细胞种群贴壁完全、细胞生长 形态均一性最好的那个时间组，则被确定为最佳差速贴壁时间，此贴壁细胞即 为本发明的目的细胞，继续培养或直接消化用于后续试验。
本发明确定接种后1-4.5小时Leydig细胞贴壁完全时终止差速贴壁，更佳 地为2小时。
后续细胞培养液可使用本领域熟知的培养液，如(但不限于)DMEM,或含 5IU/ml促絨毛性腺激素(HCG)的DMEM/HAM，S F-12(l:l)，其中优选无血清、 无HCG的DMEM/HAM，S F-12(1:1)。
本发明建立的获得Leydig细胞的分离方法，尽量保留了睾丸组织内存在的 各分化级别Leydig细胞(SLC、 PLC、幼稚型Leydig细胞)，为后续的雄激素分 泌组织构建研究提供了数量充足、功能良好的种子细胞。其中所含的SLC和 PLC为0.1-20%,优选3-20%，更优选5-20%(不同种属、不同年龄、及不同发 育阶段的睾丸组织获得的干细胞和前体细胞比例有一定差异)。
本发明提供的Leydig细胞可用于(i)构建组织工程化雄激素分泌组织的
种子细胞；(ii)用作体内细胞移植，包括全身皮下、肌肉组织内、腹腔内、肾 包膜内、睾丸鞘膜腔内、睾丸原位皮下、腹股沟、静脉内及微包囊包裹后上诉部位移植。(m)也可用于细胞生物学、发育生物学、免疫学、生理学、病理
学、毒理学及药理学等研究与应用。
所述的细胞生物学研究及应用涉及Leydig细胞形态学、增殖规律、亚细 胞结构、细胞内信号传导、培养及扩增的方法和技术等；所述的发育生物学 研究及应用涉及Leydig细胞的分化发育、发育微环境、衰老及凋亡等；所述 的免疫学研究及应用涉及细胞表面分子结构、免疫调节及免疫耐受等；所述 的毒理学及药理学研究及应用涉及药物、激素或因子等对Leydig细胞产生的 作用或影响等。
本发明提供了一种组织工程化雄激素分泌组织移植物，它是Leydig细胞与
生物可降解材料的复合体。
可用于本发明的组织工程化组织构建的材料是医学上可接受的生物可降
解材料，包括(但并不限于)
(a) 可降解性合成高分子材料，例如聚a-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙 酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯 (polycarbonate),聚乙二醇、聚环氧乙垸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；
(b) 天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan， GAGs)、壳聚糖(chitosan)、 甲壳素(chitin)、海藻酸盐、 藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；
(c) 上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合 材料。
本发明还提供一种产品，所述的产品中包括(l)细胞培养液；和(2) Leydig 细胞，所述的Leydig细胞中含有0.1-20% SLC及PLC。
可以使用常规的细胞培养液，例如(但不限于)DMEM、 MEM、 Ham'sF-12 MEM、 M-199等，其中优选DEME/HAM，S F-12 (1: 1),更优选不含血清的 DEME/HAM，SF-12 (1: 1)。
本发明的主要优点在于: 1、 能获得较多量的高纯度的Leydig细胞；
2、 保留了睾丸间质内Leydig干细胞和前体细胞，具有良好的功能，可作 为种子细胞及其它多种用途；
3、 分离Leydig细胞的方法简便、快速，细胞损伤小。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所 有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l
Leydig细胞的获得、培养及检測
1. 获取睾丸组织
雄性Wister大鼠，出生30-45天，体重100-200克，购自中国科学院上海 实验动物中心。
2.5%戊巴比妥麻醉，双侧腹股沟管内侧斜切口，切开睾丸鞘膜，仔细分离 睾丸与附睾之间的连接，结扎血管后完整获取睾丸，无菌称取每只睾丸的湿重， 即置无菌冰浴不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)内。反复多次冲洗获得完整的 睾丸，冰上剥离睾丸外层的白膜和较大的血管，尽量保持睾丸形态的完整和曲 细精管的连续性。去除白膜和肉眼可见的较大血管后，湿重为1.74±0.811克。
2. 获取睾丸间质组织内细胞
去除白膜的睾丸组织主要由曲细精管和其间的结缔组织构成，0.25%胶原 酶NB4(购自Serva,德国)与组织量按3: 1比例(体积重量比)，37°C、 100次/分 震荡消化至睾丸组织形状刚好消失，曲细精管间组织松散，但曲细精管连续而 无明显断裂时，加入两倍于消化悬液体积的培养液或PBS终止消化，以 a>=33pm(400目)不锈钢滤网过滤，滤液经1500转/分钟离心5分钟，所得沉淀
按照每克睾丸组织所得细胞接种20cn^的密度进行接种。
3. 细胞培养
接种后，37°C、 5%C02、 95%02和100%湿度的条件下，用无血清的 DMEM/HAM'S F-12(l:l)培养液培养2小时，分别收集未贴壁的悬浮细胞和培 养液，转移至各组相应的新的培养皿内，收集贴壁完全、细胞生长形态均一的 细胞，此贴壁细胞即为本发明的目的细胞-Leydig细胞，继续培养或直接消化用 于后续培养。
后续细胞培养液根据实验需要为无血清DMEM/HAM，S F-12(l:l)或含 5IU/ml HCG的DMEM/HAM,S F-12(l:l)。 4.检测
将上述获得的Leydig细胞进行如下检测 a丄eydig细胞纯度鉴定
(1) 3P-HSD特异性酶学反应经差速贴壁获得的目的细胞，以0.25%胰蛋 白酶-0.02%EDTA消化，消化后细胞悬液内加入NAD(2mg/ml)(购自 Sigma-Aldrich，美国)、雄甾垸(0.2mg/ml)(购自Sigma-Aldrich，美国)和溴氮蓝 (0.2mg/ml)(NBT)(购自Sigma-Aldrich，美国)反应液，蓝紫色着色细胞即为阳性 Leydig细胞。
(2) 3P-HSD免疫细胞化学流式细胞仪(Beckman Coulter, USA)检测鉴定收 集待测细胞，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，l%Triton-BSA进行细胞膜穿孔， 标记兔抗人3P-HSD特异性多克隆抗体(1: 100， Santa Cruz，美国)及FITC标 记的羊抗兔IgG(l: 100， DAKO，美国)，流式细胞仪进行3p-HSD阳性鉴定及 检测阳性细胞百分比。
见图1。
结果表明，每克睾丸湿重可获得1.5士0.86(xl0"个Leydig细胞，3|3-HSD特 异性酶学染色鉴定Leydig细胞纯度为92.1±2.01(%)，流式细胞学检测3p-HSD 阳性细胞为95.2±3.70(%)。
b.原代及传代后Leydig细胞鉴定
(1) 3p-HSD特异性酶学反应方法同Leydig细胞纯度鉴定。
(2) 3P-HSD免疫细胞化学鉴定原代及传代细胞4%多聚甲醛固定10分钟， PBS冲洗，正常羊血清封闭非特异性反应位点，滴加兔抗人3(3-HSD特异性多 克隆抗体，4"C过夜，PBS冲洗，滴加羊抗兔IgG第二抗体，37。C反应30分钟， DAB显色，苏木素核衬染。
(3) 3P-HSD免疫细胞化学激光共聚焦(购自Zeiss,德国)鉴定免疫反应同
前，第二抗体以FITC标记羊抗兔IgG反应后进行激光共聚焦检测。 见图2。 结果表明，
(1) 3P-HSD特异性酶学反应原代及传代细胞在伸展状态下均可见细胞浆 内蓝紫色阳性反应；
(2) 3P-HSD免疫细胞化学鉴定可见细胞浆内DAB棕色颗粒阳性反应；
(3) 3卩-HSD免疫细胞化学激光共聚焦鉴定可见细胞桨内绿色FITC荧光。 由以上三种方法鉴定证实，经此方法获得的主要细胞为Leydig细胞。 c丄eydig细胞形态学观察原代及传代Leydig细胞在倒置荧光显微镜及电
镜下观察细胞形态，生长特性。 见图3、 4。
结果表明，本发明获得的Leydig细胞群内的Leydig细胞，再贴壁完全铺 展后以两种形态为主多角形和长梭形，可见少量双核细胞。在低倍相差显微 镜下观察，有一类Leydig细胞完全铺展后细胞核中央折光性较高，而核膜及周 围胞质折光性较低，形成明显的视觉反差，即明细胞。另一类细胞核折光性差， 为暗细胞。Leydig细胞群在低密度接种时可见"拉网现象"，在第二代细胞中这 种拉网现象尤其明显。
d. 本发明获得的Leydig细胞中存在各分化级别Leydig细胞(SLC、PLC、ILC 和MLC)。
见图6。
结果表明，分离所得Leydig细胞群内含有一定比例的SLC和PLC，形态 学上成熟Leydig细胞(MLC)呈多角形铺展，幼稚型Leydig细胞(ILC)呈双 极或单极性梭形伸展。其中，部分细胞ABCG2表达阳性，证实为SLC和PLC 细胞。
e. 雄激素分泌功能检测收集原代及传代细胞HCG刺激组和无刺激组培养 液上清，经Access全自动免疫分析系统(微粒子发光原理)(购自Beckman Coulter,US A)测定其中的睾酮生成水平。
见图7。
结果表明，原代细胞具有很强的睾酮生成功能，在HCG剌激下，睾酮生 成能力明显提高；传代后细胞仍具有一定时期的睾酮生成功能，但对HCG的 刺激反应性明显降低。
实施例2
差速貼壁时间选择
按实施例1的方式获取睾丸组织及睾丸间质组织内细胞，过滤后接种培养。 将培养细胞分为如下四组(l)l小时组；(2)2小时组；(3)3小时组和(4)24 小时组。
具体操作如下在接种后，按组别分别培养1， 2， 3和24小时后，分别 收集未贴壁的悬浮细胞和培养液，转移至各组相应的新的培养皿内，以含5% 血清的DMEM/HAM'S F-12(l:l)培养液培养，经24小时后去除未贴壁细胞和培 养液。而同时各组原培养皿贴壁细胞加无血清DMEM/HAM'S F-12(l:l)培养液
继续培养。
转移后培养的细胞，如果24小时内无再贴壁，而原培养盘内Leydig细胞 种群贴壁完全、细胞生长形态均一性最好的那个时间组，则被确定为最佳差速 贴壁时间，此贴壁细胞即为本发明的目的细胞。
结果表明，33pm不锈钢滤网过滤后所得细胞大小不一，其中有部分细胞 贴壁和伸展迅速。1小时组原培养皿内贴壁细胞相对最少，2小时组、3小时组 和24小时祖中的原培养皿内细胞数量基本一致，没有肉眼可见差别，3小时组 和24小时祖中的原培养皿内贴壁细胞数量、形态和组成基本一致，但较2小 时组原培养皿内贴壁细胞形态相对混杂。为保证睾丸间质内Leydig细胞种群内 各类细胞尽可能多的存留，并减少冲洗和换液次数过多对细胞造成的不良影 响，确定差速贴壁2小时为最佳贴壁时间。
实施例3
Leydig细胞条件培养液优化
按实施例1的方式获取睾丸组织及睾丸间质组织内细胞，过滤后接种培养。 将进行细胞原代培养的DMEM/HAM，SF-12(1:1)培养液分为如下四组(l)无血 清组；(2)加入1%胎牛血清组；(3)加入5%胎牛血清组；和(4)加入10%胎牛血 清组。然后倒置荧光显微镜及电镜下观察细胞形态，生长特性。
见图5。
结果表明，在无血清DMEM/HAM，SF-12(1:1)培养液条件下培养，原代细 胞可维持良好的细胞生长形态达7天以上，含1%胎牛血清的DMEM/HAM，S
F-12(l:l)培养液能够加快早期Leydig细胞的铺展和生长速度，3天后即出现显 著的细胞老化和部分凋亡现象，5%和10%血清浓度使Leydig细胞老化加速， 并且这种血清促使Leydig细胞老化的现象与血清浓度成明显的正相关性，5% 血清能够使几乎全部的Leydig细胞在培养7天内全部死亡。
实施例4
细胞过滤条件选择
按实施例1的方式获取睾丸组织及睾丸间质组织内细胞，过滤网孔隙分为 如下3组(l)lOOiim组；(2)73pm组；(3)33pm组；所得细胞以相同密度分别 接种培养。
见图8。
结果表明，3组细胞在单位面积下细胞数量33pm组大于73pm组和100pm 组，73pm和100)im组无肉眼可辨差异；细胞形态的均一性最好者为33pm组， 73nm组和100pm组在形态学上无肉眼可辨差异。
实施例5
Leydig细胞-生物材料复合物的制备
将实施例1获得的Leydig细胞悬液离心(1500r/min)，倾去上清，将细胞沉 淀接种于生物材料PGA/PLA支架上，浓度为2xl(^个细胞/ml，制成Leydig 细胞-PGA/PLA复合物，移植于去势动物体内(皮下、腹腔内、肾包膜内、睾 丸鞘膜腔内、睾丸原位皮下、腹股沟等处)。
实施例6
将实施例1获得的Leydig细胞悬液离心(1500r/min)，倾去上清(l)将细 胞沉淀直接注射入雄激素水平低下的同种异体动物体内；(2)将细胞进行微包 囊包裹后体内注射。注射方式可包括静脉注射、皮下注射、肌肉内注射、腹腔 内注射、肾包囊内、睾丸原位皮下、腹股沟皮下等多种途径，进行细胞移植， 改善同种异体动物的雄激素水平。微包囊材料可采用目前公认和常用的包裹 生物材料(但并不限于)，包括琼脂糖-聚苯乙烯磺酸(琼脂糖-PSSA)、 藻酸盐、藻酸盐-聚L-赖氨酸、藻酸盐-聚赖氨酸-聚哌嗪-硫酸鱼精蛋白-肝素、
糖胺聚糖和脱乙酰壳多糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)、聚亚甲基《o-胍 (PMCG)等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任 何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相 同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.一种获得Leydig细胞的方法，其特征在于，它包括步骤a.将用胶原酶消化的睾丸组织通过孔径为20-100μm的滤网过滤，得到睾丸间质组织内细胞；b.将获得的睾丸间质组织内细胞在培养液中培养10分钟-4.5小时，取贴壁细胞得到Leydig细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所用胶原酶浓度为0.01-5%， 其中所含的胶原酶消化液与睾丸组织的体积(毫升)重量(克)比为1-5: 1。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶选自I型胶原酶、II 型胶原酶或复合胶原酶。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的过滤网孔为25-50pm。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中贴壁培养时间为0.5-3小时。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b的培养液中含血清0-10。/。。
7. —种如权利要求l所述的方法得到的Leydig细胞，其特征在于，所得到的 细胞中含有0.1-20。/。Leydig干细胞及前体细胞。
8. 根据权利要求1所述的方法得到的Leydig细胞的用途，其特征在于，它包括(i) 所述的Leydig细胞用作构建组织工程化雄激素分泌组织的种子细胞；(ii) 所述的Leydig细胞用作体内细胞移植，包括全身皮下、肌肉组织内、腹腔 内、肾包膜内、睾丸鞘膜腔内、睾丸原位皮下、腹股沟、静脉内及微包囊包裹后上 述部位移植；(iii) 所述的Leydig细胞也可用于有关Leydig细胞的细胞生物学、发育生物学、 免疫学、毒理学及药理学等研究与应用。
9. 一种Leydig细胞悬液，其特征在于，它包括(l)细胞培养液；和(2) Leydig 细胞，所述的Leydig细胞中含有0.1-20%Leydig干细胞及其前体细胞。
10. —种组织工程化雄激素分泌组织移植物，其特征在于，它包括(a)生 物可降解材料；和(b)接种于所述生物可降解材料的如权利要求7所述的Leydig 细胞。
全文摘要
本发明公开了一种获得Leydig细胞的方法及其用途。本发明公开的方法快速、简便，并能获得大量纯度高、功能良好的Leydig细胞，用作构建组织工程化雄激素分泌组织的种子细胞及其它用途。
文档编号C12N5/08GK101191124SQ200610118538
公开日2008年6月4日 申请日期2006年11月21日 优先权日2006年11月21日
发明者周广东, 王晓云, 新 邢 申请人:中国人民解放军第二军医大学