专利名称：胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有脂肪酶活性的全细胞催化剂及其制备方法。
背景技术：
在生物柴油的生产中，脂肪酶作为催化剂的规模化生产的最大障碍是脂肪酶的生产成本高，难于实现大规模工业化生产和应用。产生脂肪酶的生物全细胞作为催化剂(简称全细胞催化剂)，既将产脂肪酶的微生物菌株进行发酵培养后，收集菌体经过简单处理后代替脂肪酶，参加合成单脂肪酸甲酯的反应。全细胞催化剂省去了脂肪酶的分离、提取、纯化和固定化等复杂工序，是克服目前脂肪酶生产、应用成本高的有效途径之一。
关于产脂肪酶的生物全细胞催化剂的报道很少，而且处于研究阶段。目前在国外仅见来自日本科学家的报道。第一个报道是Matsumoto等利用细胞内大量表达米根霉脂肪酶的酿酒酵母，采用冻融或风干等处理后参加反应，但酵母细胞不能回收再利用。第2个报道是将米根霉细胞固定在聚氨酯泡沫颗粒中，用戊二醛交联处理后参加反应，可以反复使用6次。最近Matsumoto等又用胞外分泌脂肪酶的酵母进行了试验。他们构建了一个新的酵母细胞表面，作为FS蛋白或FL蛋白的细胞壁锚定区，酵母表达的重组脂肪酶蛋白能与FS或FL蛋白融合，融合蛋白分布在新构建的细胞表面。用这种细胞作为全细胞催化剂取得成功，但也无重复使用的报道。国内仅见清华大学的曾静等用霉菌干燥和冷冻后直接参加反应实践，但未见重复使用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制作工序简单、成本低、可反复使用的胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂，其特征在于它主要由酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙和pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料制备而成，各原料所占总重量的百分比为酵母菌体0.7-1.2、 硅藻土2.1-3.6、海藻酸钠2.0-2.3、 二氯化钙0.5-0.8、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液 92.1-94.7；其中酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3，各原料所占总重量百分比之和为100。
各原料所占总重量的最佳百分比为酵母菌体1.0、 硅藻土3.0、海藻酸钠2.0、 二氯化钙0.56、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液 93.44。
上述胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，其特征在于它包括如下步骤1).原料的选取按各原料所占总重量的百分比为酵母菌体0.7-1.2、硅藻土2.1-3.6、海藻酸钠2.0-2.3、二氯化钙0.5-0.8、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液92.1-94.7，其中酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3，各原料所占总重量百分比之和为100，选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙和pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；2).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；3).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土(第一次固定化载体，按酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3加入硅藻土)，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；4).菌体的第二次固定化将海藻酸钠(第2次固定化载体)配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成14.5-15.5％的溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。成型的细胞内分泌型酵母全细胞为颗粒状，颗粒直径约为1mm。
所述的酵母菌体的制备1).菌种和培养基的选取(1)菌种通过稀释平板法将油厂废油置入分离用培养基中进行分离培养，分离用培养基为马铃薯蔗糖培养基，得产生胞内分泌型脂肪酶的酵母(Candidalipolytica解脂假丝酵母)(分离方法见《农业微生物实验技术》第69-72页，中国农业出版社，1996年5月，第1版)；其中马铃薯蔗糖培养基为将200g马铃薯切成小块并熬成汁，将马铃薯汁与20g蔗糖溶于1L水中，并加入20g琼脂，121℃高温灭菌15min，得马铃薯蔗糖培养基；(2)发酵用培养基大豆油29.0g/L，蔗糖1.0g/L，蛋白胨70.0g/L，NaNO31.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌20分钟；2).发酵培养无菌容器中装入占体积1/3的发酵用培养基，接种产生胞内分泌型脂肪酶的酵母菌种；置28℃，150r/min，培养72小时，得发酵后的液体；3).收集菌体将发酵后的液体4700r/min离心10分钟，收集菌体，得酵母菌体。
本发明采用2种不同性质的载体和二次固定法将酵母菌体固定后，成功代替脂肪酶作为生物柴油生产用催化剂，并且可以多次反复使用。其制备方法简单，成品易回收，便于多次使用，降低了生产成本。
本发明的有益效果是1.制作简单本发明制作工序简单，不需要复杂设备；将供试菌株进行发酵培养后，收集菌体进行干燥、固定和冻融既成，截留在细胞内的脂肪酶相当于被固定。
2.降低成本以全细胞生物催化剂的形式利用脂肪酶，既省去了脂肪酶的分离提取、纯化和固定等工序，也避免在此过程中的酶损失，也节省了大量设备投资、运行费用，在工业化生产中具有更高的成本效率。
3.技术先进细胞内分泌脂肪酶的酵母全细胞代替脂肪酶用于转酯催化剂，虽然已经有成功报道，但未见有酵母全细胞的固定化制作技术和多次使用的报道；本发明采用大分子载体和2次固定法，固定后的酵母细胞容易收集而且具有脂肪酶活性。
4.多次使用采用2次固定法制作的酵母全细胞催化剂使用后的回收率比其它方法的回收率高10％；在油脂-甲醇反应系统中至少使用6次活性无明显下降。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，它包括如下步骤1).菌种和培养基的选取(1)菌种通过稀释平板法将油厂废油置入分离用培养基中进行分离培养，分离用培养基为马铃薯蔗糖培养基，得产生胞内分泌型脂肪酶的酵母(Candidalipolytica解脂假丝酵母)(分离方法见《农业微生物实验技术》第69-72页，中国农业出版社，1996年5月，第1版)；其中马铃薯蔗糖培养基为将200g马铃薯切成小块并熬成汁，将马铃薯汁与20g蔗糖溶于1L水中，并加入20g琼脂，121℃高温灭菌15min，得马铃薯蔗糖培养基；(2)发酵用培养基大豆油29.0g/L，蔗糖1.0g/L，蛋白胨70.0g/L，NaNO31.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌20分钟；2).发酵培养无菌容器中装入占体积1/3的发酵用培养基，接种产生胞内分泌型脂肪酶的酵母菌种；置28℃，150r/min，培养72小时，得发酵后的液体；3).收集菌体将发酵后的液体4700r/min离心10分钟，收集菌体，得酵母菌体；4).原料的选取各原料所占总重量的百分比为酵母菌体1.0、硅藻土3.0、海藻酸钠2.0、二氯化钙0.56、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液93.44选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；5).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；6).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土(第一次固定化载体，按酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3加入硅藻土)，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；7).菌体的第二次固定化将海藻酸钠(第二次固定化载体)配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成15％的溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。成型的细胞内分泌型酵母全细胞为颗粒状，颗粒直径约为1mm。
实施例2胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，它包括如下步骤1).菌种和培养基的选取(1)菌种通过稀释平板法将油厂废油置入分离用培养基中进行分离培养，分离用培养基为马铃薯蔗糖培养基，得产生胞内分泌型脂肪酶的酵母(Candidalipolytica解脂假丝酵母)(分离方法见《农业微生物实验技术》第69-72页，中国农业出版社，1996年5月，第1版)；其中马铃薯蔗糖培养基为将200g马铃薯切成小块并熬成汁，将马铃薯汁与20g蔗糖溶于1L水中，并加入20g琼脂，121℃高温灭菌15min，得马铃薯蔗糖培养基；(2)发酵用培养基大豆油29.0g/L，蔗糖1.0g/L，蛋白胨70.0g/L，NaNO31.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌20分钟；2).发酵培养无菌容器中装入占体积1/3的发酵用培养基，接种产生胞内分泌型脂肪酶的酵母菌种；置28℃，150r/min，培养72小时，得发酵后的液体；3).收集菌体将发酵后的液体4700r/min离心10分钟，收集菌体，得酵母菌体；4).原料的选取各原料所占总重量的百分比为酵母菌体0.7、硅藻土2.1、海藻酸钠2.0、二氯化钙0.5、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液94.7选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；5).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；6).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土(第一次固定化载体，按酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3加入硅藻土)，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；7).菌体的第二次固定化将海藻酸钠(第二次固定化载体)配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成15％的溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。成型的细胞内分泌型酵母全细胞为颗粒状，颗粒直径约为1mm。
实施例3胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，它包括如下步骤1).菌种和培养基的选取(1)菌种通过稀释平板法将油厂废油置入分离用培养基中进行分离培养，分离用培养基为马铃薯蔗糖培养基，得产生胞内分泌型脂肪酶的酵母(Candidalipolytica解脂假丝酵母)(分离方法见《农业微生物实验技术》第69-72页，中国农业出版社，1996年5月，第1版)；其中马铃薯蔗糖培养基为将200g马铃薯切成小块并熬成汁，将马铃薯汁与20g蔗糖溶于1L水中，并加入20g琼脂，121℃高温灭菌15min，得马铃薯蔗糖培养基；(2)发酵用培养基大豆油29.0g/L，蔗糖1.0g/L，蛋白胨70.0g/L，NaNO31.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌20分钟；2).发酵培养无菌容器中装入占体积1/3的发酵用培养基，接种产生胞内分泌型脂肪酶的酵母菌种；置28℃，150r/min，培养72小时，得发酵后的液体；3).收集菌体将发酵后的液体4700r/min离心10分钟，收集菌体，得酵母菌体；4).原料的选取各原料所占总重量的百分比为酵母菌体1.2、硅藻土3.6、海藻酸钠2.3、二氯化钙0.8、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液92.1选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；5).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；6).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土(第一次固定化载体，按酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3加入硅藻土)，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；7).菌体的第二次固定化将海藻酸钠(第二次固定化载体)配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成15％的溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。成型的细胞内分泌型酵母全细胞为颗粒状，颗粒直径约为1mm。
实施例4胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，它包括如下步骤1).原料的选取各原料所占总重量的百分比为酵母菌体1.0、硅藻土3.0、海藻酸钠2.0、二氯化钙0.56、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液93.44选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；酵母菌体采用现有的酵母菌体；2).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；3).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土(第一次固定化载体，按酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3加入硅藻土)，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；4).菌体的第二次固定化将海藻酸钠(第二次固定化载体)配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成14.5-15.5％的溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。成型的细胞内分泌型酵母全细胞为颗粒状，颗粒直径约为1mm。
实施例5胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，它包括如下步骤1).原料的选取各原料所占总重量的百分比为酵母菌体0.7、硅藻土2.1、海藻酸钠2.0、二氯化钙0.8、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液94.4选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；酵母菌体采用现有的酵母菌体；酵母菌体采用现有的酵母菌体；2).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；3).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土(第一次固定化载体，按酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3加入硅藻土)，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；4).菌体的第二次固定化将海藻酸钠(第二次固定化载体)配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成14.5-15.5％的溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。成型的细胞内分泌型酵母全细胞为颗粒状，颗粒直径约为1mm。
权利要求
1.胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂，其特征在于它主要由酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙和pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料制备而成，各原料所占总重量的百分比为酵母菌体 0.7-1.2、硅藻土2.1-3.6、海藻酸钠 2.0-2.3、二氯化钙 0.5-0.8、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液 92.1-94.7；其中酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3，各原料所占总重量百分比之和为100。
2.根据权利要求1所述的胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂，其特征在于各原料所占总重量的百分比为酵母菌体 1.0、硅藻土3.0、海藻酸钠 2.0、二氯化钙 0.56、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液93.44。
3.如权利要求1所述的胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，其特征在于它包括如下步骤1).原料的选取按各原料所占总重量的百分比为酵母菌体0.7-1.2、硅藻土2.1-3.6、海藻酸钠2.0-2.3、二氯化钙0.5-0.8、pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液92.1-94.7，其中酵母菌体与硅藻土的重量比＝1∶3，各原料所占总重量百分比之和为100，选取酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙和pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液原料，备用；2).酵母菌体用pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤两次，pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的重量用量为酵母菌体的两倍，冷冻干燥；3).菌体的第一次固定化冷冻干燥所得的菌体加入硅藻土，在容器中打散菌体并与硅藻土混匀；加入酵母菌体重量两倍的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，在25℃条件下搅拌1小时后，离心收集固体，将所收集到的固体用丙酮洗涤2次，使载体颗粒分散，再次冷冻干燥，得第一次固定化全细胞；4).菌体的第二次固定化将海藻酸钠配成水溶液A，另用剩余的pH值为7.7的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制第一次固定化的全细胞成溶液B，合并两溶液，充分搅拌，最终的海藻酸钠浓度为2％，得混合溶液；用注射器将该混合溶液逐滴加入到0.05mol/L无菌的Ca2Cl溶液中，固化1小时后取出，离心收集固体，用蒸馏水洗2次，以除去固定颗粒化表面多余的Ca2Cl，真空干燥即得产品。
4.根据权利要求3所述的胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂的制备方法，其特征在于所述的酵母菌体的制备1).菌种和培养基的选取(1)菌种通过稀释平板法将油厂废油置入分离用培养基中进行分离培养，分离用培养基为马铃薯蔗糖培养基，得产生胞内分泌型脂肪酶的酵母——Candida lipolytica解脂假丝酵母；其中马铃薯蔗糖培养基为将200g马铃薯切成小块并熬成汁，将马铃薯汁与20g蔗糖溶于1L水中，并加入20g琼脂，121℃高温灭菌15min，得马铃薯蔗糖培养基；(2)发酵用培养基大豆油29.0g/L，蔗糖1.0g/L，蛋白胨70.0g/L，NaNO31.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌20分钟；2).发酵培养无菌容器中装入占体积1/3的发酵用培养基，接种产生胞内分泌型脂肪酶的酵母菌种；置28℃，150r/min，培养72小时，得发酵后的液体；3).收集菌体将发酵后的液体4700r/min离心10分钟，收集菌体，得酵母菌体。
全文摘要
本发明涉及一种具有脂肪酶活性的全细胞催化剂及其制备方法。胞内分泌脂肪酶型全细胞催化剂，其特征在于它主要由酵母菌体、硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙和pH值为7.7的Na
文档编号C12N11/00GK1944629SQ20061012485
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者江木兰, 胡小加, 晏立英, 张银波 申请人:中国农业科学院油料作物研究所