专利名称：岩藻糖苷酶活性的测定方法及岩藻糖苷酶诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域内对岩藻糖苷酶活性的检测，尤其涉及利用酶比色法及酶(偶)联法测定岩藻糖苷酶活性的方法，以及由此制得的岩藻糖苷酶诊断试剂盒，属于岩藻糖苷酶活性分析检测技术领域。
背景技术：
1980年法国学者Deugnier等研究发现，原发性肝癌患者血清岩藻糖苷酶升高，并被众多的研究所证实。故有人提出岩藻糖苷酶可作为原发性肝癌的肿瘤标志物，与甲胎蛋白联合或参照应用大大提高了诊疗价值。近年来研究发现，岩藻糖苷酶对某些疾病的发生、发展均具有重要意义。
血清岩藻糖苷酶测定主要有荧光法和比色法。比色法以4-硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷或4-硝基苯α-L-岩藻糖苷为底物显色，在一定程度上被应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定岩藻糖苷酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的岩藻糖苷酶诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种利用酶比色法及酶(偶)联法测定岩藻糖苷酶活性的方法，采用以下步骤进行首先，将待测样品与含有岩藻糖苷、岩藻糖脱氢酶、双偶氮盐、黄递酶和辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应
然后，将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测还原型双偶氮盐在主波长410～366nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小。
上述测定岩藻糖苷酶活性的方法中，所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
实现本发明岩藻糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂5～100g/ml，岩藻糖脱氢酶 200～500000U/L，黄递酶200～500000U/L，岩藻糖苷 2～30mmol/L，辅酶 0.5～9.0mmol/L，双偶氮盐 0.2～2mmol/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分辅酶、岩藻糖苷、双偶氮盐等，可以放在试剂II；试剂II中的岩藻糖脱氢酶、黄递酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将试剂配成如下三试剂
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的双偶氮盐可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的岩藻糖脱氢酶、黄递酶、岩藻糖苷也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定岩藻糖苷酶活性的方法，其辅酶为氧化型辅酶，是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
双偶氮盐可以是下列底物中之任何一种Neotetrazolium Chloride NT2，2′，5，5′-Tetraphenyl-3，3′-[p-diphenylene]ditetrazolium chloridep-Iodonitrotetrazolium Violet INT2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazolium chlorideTetranitro-Blue tetrazolium TNBT2，2′，5，5′-Tetra-p-nitrophenyl-3，3′-[3，3′-dimethoxy-4，4′-diphenylene]ditetrazoliumchlorideThiocarbamyl Nitro Blue Tetrazolium TC-NBT2，2′-Di[p-nitrophenyl]-5，5′-di[p-thiocarbamyl-phenyl]-3，3′-[3，3′-dimethoxy-4，4′-biphenyle ne]-ditetrazolium chlorideTriphenyltetrazolium Chloride TTC2，3，5-Triphenyltetrazolium chlorideTetrazolium Hydroxide XTT2，3-bis-(2-methoxy4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilideTetrazolium Violet TV2，5-Diphenyl-3-[-naphtthyl]-tetrazolium chlorideThiazolyl Blue MTT3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H tetrazolium bromideTetrazolium BlueBT3，3′-[3，3′-Dimethoxy(1，1′-biphenyl)-4，4′-diyl]-bis[2，5-diphenyl-2H-tetrazolium]dichloride)Nitro Blue Tetrazolium NBT2，2′-Di-p-nitrophenyl-5，5′-diphenyl-3，3′-[3，3′-dimethoxy-4，4′-diphenylene]-ditetrazolium chlorideMTS tetrazolium MTS(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxyphenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium，inner salt)
Water-Soluble Tetrazolium WST-1 WST-12-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumWater-Soluble Tetrazolium WST-3 WST-32-(4-Iodophenyl)-3-(2，4-dinitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumWater-Soluble Tetrazolium WST-8 WST-82-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2HtetrazoliumNitrotetrazolium Violet NTV3 alpha-naphthyl-2-phenyl-5-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazolium chlorideCyanoditolyl Tetrazolium ChlorideCTC5-cyano-2，3-ditoyl tetrazolium chloride此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，岩藻糖脱氢酶 8000U/L，黄递酶20000U/L，岩藻糖苷 5mmol/L，辅酶 3mmol/L，
双偶氮盐0.5mmol/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测410～366nm波长处吸光度的变化，得以测定岩藻糖苷酶活性的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的岩藻糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行岩藻糖苷酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明利用酶比色法技术及酶(偶)联法技术测定岩藻糖苷酶活性，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中岩藻糖苷酶活性的大小；(6)本发明提供的液态岩藻糖苷酶诊断试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种岩藻糖苷酶活性的测定方法及岩藻糖苷酶诊断试剂盒，运用岩藻糖苷酶酶促反应连续监测法，岩藻糖苷酶酶解岩藻糖苷释放岩藻糖，通过岩藻糖脱氢酶的作用产生还原型辅酶，为了增加反应灵敏度，还原型辅酶在黄递酶作用下还原双偶氮盐发生显色反应，这个反应的灵敏度可以比直接测量还原型辅酶在340nm波长的变化增加2.5～7倍。将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测还原型双偶氮盐在主波长410～366nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小测定结果。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制岩藻糖苷酶诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，岩藻糖脱氢酶 8000U/L，黄递酶 20000U/L，岩藻糖苷 5mmol/L，NADP+3mmol/L，双偶氮盐(INT)0.5mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长495nm，测试副波长660nm，被测岩藻糖苷酶样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长495nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制岩藻糖苷酶诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 2mol/L，NAD+5mmol/L，双偶氮盐(NBT)1mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％v/v，岩藻糖脱氢酶 6000U/L，黄递酶 16000U/L，岩藻糖苷 8mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长546nm，测试副波长700nm，被测岩藻糖苷酶样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制岩藻糖苷酶诊断试剂盒
试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 2mol/L，thio-NAD+3mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，乙二醇 80g/ml，双偶氮盐(XXT)0.5mmol/L；试剂III——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 50％v/v，岩藻糖脱氢酶 8000U/L，黄递酶 20000U/L，岩藻糖苷 5mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定岩藻糖苷酶活性时，在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长546nm，测试副波长700nm，被测岩藻糖苷酶样品与试剂I、试剂II、试剂III的体积比例为4∶40∶5∶5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.岩藻糖苷酶活性的测定方法，包括以下步骤①将待测样品与含有岩藻糖苷、岩藻糖脱氢酶、双偶氮盐、黄递酶和辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测还原型双偶氮盐在主波长410～366nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小。
2.根据权利要求1所述的岩藻糖苷酶活性的测定方法，其特征在于双偶氮盐是下列底物中的任何一种，NT(Neotetrazolium Chloride)，INT(p-Iodonitrotetrazolium Violet)，TNBT(Tetranitro-Blue tetrazolium)，TC-NBT(Thiocarbamyl Nitro Blue Tetrazolium)，TTC(Triphenyltetrazolium Chloride)，XTT(Tetrazolium Hydroxide)，TV(Tetrazolium Violet)，MTT(Thiazolyl Blue)，BT(Tetrazolium Blue)，NBT(Nitro Blue Tetrazolium)，MTS(tetrazolium)，WST-1(Water-Soluble Tetrazolium WST-1)，WST-3(Water-Soluble Tetrazolium WST-3)，WST-8(Water-Soluble Tetrazolium WST-8)，NTV(Nitrotetrazolium Violet)，CTC(Cyanoditolyl Tetrazolium Chloride)。
3.岩藻糖苷酶诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，岩藻糖脱氢酶 200～500000U/L，黄递酶200～500000U/L，岩藻糖苷 2～30mmol/L，辅酶 0.5～9.0mmol/L，双偶氮盐 0.2～2mmol/L。
4.根据权利要求3所述的岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述辅酶为氧化型辅酶，是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
6.权利要求3～5中任意一种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
7.权利要求3～5中任意一种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种岩藻糖苷酶活性的测定方法及岩藻糖苷酶诊断试剂盒，运用岩藻糖苷酶酶促反应连续监测法，岩藻糖苷酶酶解岩藻糖苷释放岩藻糖，通过岩藻糖脱氢酶的作用产生还原型辅酶，为了增加反应灵敏度，还原型辅酶在黄递酶作用下还原双偶氮盐发生显色反应，从而检测还原型双偶氮盐在主波长410～366nm吸光度上升的速度，进而可以测算岩藻糖苷酶活性的大小。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过可见光分析仪或半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/26GK1975384SQ20061016123
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司