专利名称：测量聚合酶活性的闪烁邻近测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚合酶的生物学测定，且更具体地涉及用于测量RNA和DNA聚合酶酶活性的闪烁邻近测定法。
背景技术：
丙型肝炎病毒是遍及世界的慢性肝病的主要原因(Boyer，N.等人 J.HepatoL. 2000 3298-112)。感染了HCV的患者有发展为肝硬化继之以肝细胞癌的风险，因此HCV是肝移植的主要指标。
HCV已被归为包括黄病毒属、瘟病毒属和包括丙型肝炎病毒的肝炎病毒属的黄病毒科成员(Rice，C.M.，FlaviviridaeThe viruses and theirreplication.InFields Virology，编辑B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa.，第30章，931-959，1996)。HCV是有包膜病毒，其含有约9.4kb的正义单链RNA基因组。所述病毒基因组由5’非翻译区(UTR)、编码约3011氨基酸的多蛋白前体的长开放阅读框和短的3’UTR组成。所述5’UTR是HCV基因组中最为高度保守的部分，且对于起始和控制多蛋白翻译非常重要。非结构蛋白质5即NS5B的羧基一半包含依赖RNA的RNA聚合酶。
目前存在有限数量的已被承认的疗法可用于HCV感染的治疗。治疗HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新的和现存的方法已被综述于以下文献中R.G.Gish，Sem.Liver.Dis.，1999 195；Di Besceglie，A.M.和Bacon，B.R.，Scientific American，1999年10月，80-85；G.Lake-Bakaar，Currentand Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease，Curr.Drug Targ Infect Dis.2003 3(3)247-253；P.Hoffman等人，Recent patentson experimental therapy for hepatitis C virus infection(1999-2002)，Exp.Opin.Ther. Patents 2003 13(11)1707-1723；M.P.Walker等人，PromisingCandidates for the treatment of chronic hepatitis G，Exp.Opin.investing.Drugs 2003 12(8)1269-1280；S.-L.Tan 等人，Hepatitis CTherapeuticsCurrent Status and Emerging Strategies，Nature Rev.DrugDiscov.2002 1867-881；J.Z.Wu和Z.Hong，Targeting NS5BRNA-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy，Curr.DrugTarg.-Infect.Dis.2003 3(3)207-219。
在体外，HCV NS5B的聚合酶活性依赖于RNA模板并需要RNA或DNA引物。已发展了多种测量HCV NS5B聚合酶活性的体外测定法。通常，标准反应混合物包括缓冲液、盐、二价阳离子、还原剂和核苷三磷酸以及RNA模板和引物。最通用的模板和引物是合成的同聚模板/引物，如聚腺苷单磷酸寡尿苷单磷酸(polyAoligo U；见例如，S.-E.Behrens等人，EMBO J.1996 15(1)12-22，V.Lohmann等人，J. Virol. 199771(11)8416-8428)。
然而，当使用杂聚序列(包括来自HCV基因组的序列)的RNA模板时，NS5B也能够以不依赖引物的方式起始体外RNA合成。这些序列包括位于HCV基因组5’非翻译区的内部核糖体进入位点(HCV IRES；Kieft等人，RNA 2001 7194-206)和3’非翻译区(HCV 3’-UTR；Pellerin等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.2002 295682-688)。在此处，模板的3’末端被用作引物，且延伸经由折返机制从发夹环进行，产生其中模板和产物共价连接的双链分子。
闪烁邻近测定法(SPA)使用某些电子发射器限定的光程长度(Hart等人，Molecular Immunology 1979 16265-267；Hart，美国专利No.4,271,139和No.4,382,074以及Bertoglio-Matte，美国专利No.4,568,649)。有代表性的SPA是由溶液中的分析物、接触电子时闪烁的塑料珠以及结合于珠子上且特异于溶液中的分析物的特异性结合配偶体(如抗体)组成。如果所述分析物掺入发射相对短光程长度电子的放射性标记(如氚)，则仅当塑料珠与分析物悬浮于溶液中，放射性分析物为结合配偶体特异性结合并因此定位于珠子表面附近时，所述塑料珠才闪烁。
已发展和开发了用于多种分析目的的SPA。SPA已被用于放射性免疫测定、竞争性测定、酶动力学测定、配体/受体及抗原/抗体相互作用的研究以及细胞过程的研究(见Cook，Drug Discovery Today 1996 1287-294和Cook，美国专利No.5,665,562)。迄今为止，所述SPA全部依赖于特异性结合的相互作用，如抗体-抗原相互作用、配体-受体相互作用、与链霉抗生物素(蛋白)包被的珠子结合的生物素化试剂、目的物质螯合络合物的形成或依赖于结合配偶体的精确且特异性的结构互补性的其它相互作用。尽管这赋予SPA对目的分析物的高度特异性，但还需要额外的步骤准备试剂以及开发目的反应特异性的结合配偶体系统所需的时间和花费。这也限制其只能用于可以找到或开发特异性结合配偶体的系统。例如，对于抗原-抗体测定需要特异性抗体，对于配体-受体测定需要特异性受体，螯合配体必须与与其形成螯合络合物的离子的几何结构相匹配。如果没有用于检测物质的可用抗体或受体，则需要用结合对(如生物素-链霉抗生物素蛋白)成员特异性修饰分析物。
因此，为了使用标准SPA测定测量包括HCV NS5B聚合酶的任意聚合酶活性，合成的引物(如寡尿苷酸)必须用亲和标签分子(如生物素)修饰，使其能够与适当的同聚模板退火(在此情况下是聚腺苷酸)并且能够与用可以结合标签分子的分子(如链霉抗生物素蛋白)包被的SPA珠子反应。然而，发展可藉以在SPA测定中使用无引物或未经修饰引物的杂聚模板测量聚合酶酶活性的系统将是有用且有成本效益的。
发明内容
本发明是基于这一发现，即通过在酸性pH下将聚合酶产生的产物与SPA的支持结构(如珠子)相接触可以实行SPA测定以测量不用引物或使用未经修饰引物的聚合酶酶活性。通过消除对与亲和标签分子连接的修饰引物的需要(其本身是有成本效益的)，可以使用代表更精确条件的给定聚合酶的天然的核苷酸序列或其它杂聚序列作为模板实行SPA测定，以测量聚合酶活性。
因此，本发明提供了测定聚合酶活性的方法孵育反应混合物，其含有聚合酶、适当的模板以及多种适当地放射性标记的和非放射性标记的核苷三磷酸，以提供使用或不使用未修饰引物的标记的转录物；在从约2.0到约4.5的pH范围内将标记的转录物与SPA支持结构的悬浮液相接触；并测量与聚合酶酶活性相关的闪烁水平。在另一实施方案中，在调节聚合酶酶活性的化合物存在下孵育反应混合物。在优选的实施方案中，聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
考虑到本发明的下列详述连同所附的用来说明代表性实施方案的实施例，本发明的上述和其它优点及特征以及实现所述优点和特征的方式将会变得更加显而易见。
附图的简短说明
图1为NS5B聚合酶浓度的影响。实验在384孔板中实行，其中NS5B浓度范围从0到160nM。HCV IRES模板为0.26μg/孔，在含有40mMTris(pH8.0)、4mM乙酸镁和4mM DTT的缓冲液中存在1μM的CTP、GTP、ATP和1μCi3H-UTP。在30℃孵育2.5小时后用含有100mM乙酸钠(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白质A-PVT SPA珠子的溶液终止反应。
图2为已知的NS5B抑制剂的剂量应答曲线实验在384孔板中实行，NS5B的浓度为0.23μg/20μl。 HCV IRES模板为0.26μg/20μl，在含有40mM Tris(pH8.0)、4mM乙酸镁、4mM DTT和10％DMSO的缓冲液中存在1μM的CTP、GTP、ATP和1μCi3H-UTP。在30℃孵育2.5小时后用含有100mM乙酸钠(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白质A-PVT SPA珠子的溶液终止反应。
定义术语“聚合酶”指催化核苷酸聚合作用(即聚合酶活性)的酶。通常，聚合酶将起始在与多核苷酸模板序列退火的引物3’末端的合成，并将向模板链的5’末端进行。“RNA聚合酶”催化核糖核苷酸的聚合作用，而“DNA聚合酶”催化脱氧核糖核苷酸的聚合作用。“DNA聚合酶”可以包括利用RNA作为模板产生DNA链的“依赖RNA的DNA聚合酶”(如逆转录酶)，以及利用DNA作为模板产生DNA链的“依赖DNA的DNA聚合酶”。
术语“病毒聚合酶”指在病毒基因组中含有的催化核糖核苷酸或脱氧核苷酸的聚合作用并使病毒能够复制的聚合酶。
术语“NS5B”指位于HCV病毒基因组3’末端附近的HCV基因组的部分，其特指被称之为“NS5B蛋白质”、“NS5B多肽”、“NS5B聚合酶”、或在本文中可互换使用的这些术语的组合的蛋白质的编码区域。NS5B在其天然状态下作为依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)起作用。编码NS5B蛋白质的核酸区域还可以被称之为“NS5B”基因。因此，视使用所述术语的上下文而定，术语“NS5B”可以指编码NS5B多肽的核酸、NS5B基因或NS5B多肽，或其任意部分。NS5B还可以指NS5B核酸序列或NS5B多肽的天然等位基因变体、突变体以及衍生物。所述NS5B核酸、NS5B基因或NS5B蛋白质指有功能的聚合酶或依然结合于正确模板的无功能的聚合酶。
“闪烁邻近测定法(SPA)”指产生在一定水平上可量化的光能的均质测定操作，该水平与测定介质中放射性标记产物的量相关。光能由被掺入到支持结构(珠子或其它可以用于测定方法的固体表面)之中或形成其一部分的闪烁体产生。尽管支持结构可以用捕获分子包被，捕获分子并非本发明的实施所必须的。在直接测定法中，在含有闪烁体支持结构的水性溶液中混合有含放射性标记产物的样品。使放射性标记的产物结合于含有闪烁体的支持结构。使用闪烁计数器可以常规地检测到闪烁体激活所产生的光发射。产生的光量与结合于支持结构表面的反应物的量直接地成比例。在SPA中使用的珠子可以是直径约5μm的微球，且可以制备自疏水聚合物如但不限于聚丙烯酰胺、丙烯酰胺、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚甲基苯乙烯，或制备自无机闪烁剂如硅酸钇。珠子的核心可以用减少珠子疏水性的聚羟基膜包被。在一个实施方案中，含有有机闪烁体如二苯基唑的SPA珠子制备自硅酸钇或聚甲基苯乙烯，并且可以从Amersham Biosciences(Piscataway，N.J.)商购。
“适当地放射性标记”分子的同位素指具有相对低能量的β发射的同位素，例如氚或碘-125俄歇电子。样品中仅结合于或邻近于含闪烁体支持结构的部分产生可以被计数的闪烁事件。未结合的放射性标记分子与闪烁体距离太远而不能产生闪烁，其β衰减能量散失在液体水性介质中。
如本文所用术语“亲和标签”指这样的配体(其连接于引物)，其对“受体”具有的强亲和力可以被用来从溶液中选取与配体连接的实体。这类配体的实例包括生物素或其衍生物、组氨酸多肽、直链淀粉的蔗糖部分或特异性抗体可识别的限定表位。这样的“亲和标签”优选地连接于溶液中的引物，并由连接于固体支持物的合适“受体”部分捕获。
本文所用术语“引物”指当被置于正确的环境中时能够作为依赖模板的核酸合成的起始子功能性地起作用的寡核苷酸，其可以为RNA或DNA；可以为单链或双链；可以来自生物系统，由限制性酶消化产生，或者是合成制备。当与合适的核酸模板、适当的核酸的核苷三磷酸前体、聚合酶、适当的辅因子以及适当的条件(如适当的温度和pH)同时存在时，引物可以通过聚合酶在其3’末端添加核苷酸而被延长(延伸)，或通过相似活性产生引物延长(延伸)的产物。可以取决于应用的特定条件和需要改变引物长度。例如，在本发明的方法中，核苷酸或寡核苷酸引物通常长度为1-24或更多的核苷酸。所述引物必须与期望的模板充分互补以引发期望的延伸产物的合成，即，引物能够与期望的模板链以这样的方式退火，从而足以保证引物的3’羟基部分与类似的酶合适地并置。引物序列并不需要呈现与期望模板的精确互补。例如，非互补的核苷酸序列可以被连接在另外的互补引物的5’端。备选地，只要引物序列与期望的模板链的序列充分互补，足以为延伸产物的合成功能性地提供引物-模板复合物，非互补的碱基就可以被散布在寡核苷酸引物序列中。
本文所用术语“未修饰的引物”指未修饰的或未连接“亲和标签”分子的引物。
术语“RNA合成”和“转录”可互换使用，并被定义为由RNA聚合酶进行的具体步骤识别并结合模板起始位点；通过掺入第一互补核苷酸引发合成；以及连续地加入互补核苷酸以延长新生RNA链。
术语“模板”指作为聚合酶底物之一的长度至少为50核苷酸的DNA，或优选地RNA的寡核苷酸。模板序列与聚合酶在转录期间产生的序列互补。对于聚合酶，“合适的”模板是能够作为给定聚合酶的底物的模板。术语“同聚模板”指整个序列由一种核苷酸组成的模板，如聚腺苷酸或聚鸟苷酸。术语“杂聚模板”指非“同聚”的且其序列由一种以上核苷酸组成的模板。
本发明提供通过使用闪烁邻近测定法(SPA)测定聚合酶活性的方法。SPA通过使放射性标记分子与支持结构闪烁体邻近以刺激光激发的方式运作。本发明的第一个实施方案中提供了测定聚合酶活性的方法，其包括步骤a)孵育反应混合物以产生使用或不使用未修饰引物的标记的转录物，所述反应混合物含有所述聚合酶、合适的模板以及多种适当地放射性标记和非放射性标记的核苷三磷酸；b)在从约2.0到约4.5的pH范围内将所述标记的转录物与闪烁邻近测定法(SPA)的支持结构接触；和c)测量闪烁水平，其中所述闪烁水平与所述聚合酶活性相关。
在本发明第一实施方案的一个实施方案中，聚合酶是HCV NS5B聚合酶。在此测定中，NS5B结合于使用或不使用引物的单链RNA模板并起始ds(双链)RNA的从头合成。所述模板可以是需要互补引物(如聚腺苷酸-寡尿苷酸)的同聚物，或需要或不需要互补引物的杂聚物。不需要引物的NS5B的RNA模板包括位于HCV基因组5’非翻译区的内部核糖体进入位点(HCV IRES)和3’非翻译区(HCV 3'-UTR)。放射性标记的UTP以及未标记的CTP、GTP和ATP经聚合酶-模板结合而被掺入双链螺旋。通过加入固定量的蛋白质-A-聚甲基苯乙烯(PVT)SPA珠子(在低pH中)(其与dsRNA偶联并阻止反应的进一步进行)检测产物(dsRNA)。珠子与掺入的放射性标记UTP的邻近导致光子发射，并由检测器捕获。没有信号(光子)表明经由酶/化合物阻断而缺少dsRNA形成。
本发明的第二个实施方案提供了测定聚合酶酶活性的方法，其包括步骤a)在一种或多种调节所述聚合酶活性的化合物存在下，孵育反应混合物以产生使用或不使用未修饰引物的标记的转录物，所述反应混合物包含所述聚合酶、合适的模板以及多种适当地放射性标记的和非放射性标记的核苷三磷酸；b)在从约2.0到约4.5的pH范围内将所述标记的转录物与闪烁邻近测定法(SPA)的支持结构接触；和c)测量闪烁水平，其中所述闪烁水平与所述聚合酶的活性相关。在本发明第二个实施方案的优选的实施方案中，所述聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
本发明的方法还可以用任意数目的RNA和DNA聚合酶实施，因为由聚合酶产生的标记的产物(即ds RNA或DNA)在酸性pH条件下能够与SPA支持结构如此邻近，从而闪烁水平与聚合酶的活性相关。本发明适用于来自原核和真核物种以及来自RNA和DNA病毒的RNA和DNA聚合酶。DNA聚合酶可以包括依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶，如人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-RT)。
给出下列制备和实施例使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。其不应理解为本发明范围的限制，而是仅作为对本发明的举例说明和代表。
实施例1HCV NS5B RNA聚合酶测定N末端组氨酸标签标记的HCV聚合酶来自HCV BK菌株，基因型1b(NS5B570n-BK)，其相对于全长HCV聚合酶在C末端含有21个氨基酸的缺失，并且纯化自大肠杆菌(E.coli)菌株M15。在Taq启动子表达盒下游含有HCV BK菌株氨基酸残基2421-2999的编码序列(Genbank登录号M58335)的构建体被插入质粒构建体中。用所述质粒构建体转化大肠杆菌，接种菌落，并于37℃在补充了100μg/mL氨苄青霉素的10LTerrific培养液(Tartoff和Hobbs)中过夜生长。当光密度达到1.5至3.5OD600之间时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，并将培养物在22℃继续孵育16到18小时。使用三步法(包括随后在Ni-NTA、SP-琼脂糖HP和Superdex 75树脂上柱层析)纯化NS5B570n-BK至同质。
将多种浓度的NS5B聚合酶加入384孔板，并与浓度为0.26μg/孔的377核苷酸的HCV IRES模板序列(SEQ ID NO1)(模板序列含有来自GenBank登录号AF356827的HCV 5’非翻译区的21-371核苷酸残基)、溶于含有40mM Tris(pH8.0)、4mM乙酸镁和4mM DTT的缓冲液中的1μM CTP、GTP、ATP和1μCi3H-UTP(Amersham TRK412，1mCi/ml)共孵育。在有些情况下，还加入10μM浓度的测试化合物。在30℃孵育3小时后，每孔加入含有100mM乙酸钠溶液(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白A-PVT SPA珠子的溶液。样品在室温放置12小时。从SPA珠子含有的闪烁体发射的光量在Topcount plate reader(Perkin-Elmer)上被转换为每分钟计数(CPM)。图1显示了在NS5B聚合酶的不同浓度下的测定结果。图2显示了几个已知的NS5B聚合酶抑制剂的剂量应答曲线形式的测定结果。
实施例2HIV-1逆转录酶测定来自HIV-1茵株的重组逆转录酶(RNA指导的DNA聚合酶)可以在大肠杆菌中表达并如Mizrahi等人，Arch.Biochem.Biophys.1989273347-358所述纯化。逆转录酶被加入微滴定板并与预先和2.5μg/mloligo(dT)16引物退火的5μg/ml poly(rA)模板、溶于含有40mM Tris(pH8.0)、4mM乙酸镁和4mM DTT的缓冲液中的1μM dATP、dCTP、dGTP和1μCi[甲基-1’2’-3H] dTTP(Amersham TRK-576)混合。在37℃反应30分钟。孵育后，每孔加入含有100mM乙酸钠溶液(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白A-PVT SPA珠子的溶液，且样品处理和闪烁检测如实施例1所述。
实施例3大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow)测定可以使用无引物的带有游离3’羟基末端的双链DNA(如由Dnase I消化产生)或者有特异性或随机引物的单链DNA作为模板，用实施例2所述方法测定商购的(如Invitrogen Cat.No.18012-021)大肠杆菌DNA聚合酶I大(Klenow)片段的聚合酶活性。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司<120>测量聚合酶活性的闪烁邻近测定法<130>23540<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>377<212>RNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)<400>1guuugguuuu cuuugagguu uaggaaucgu gcucauggug cacggucuac gagaccuccc 60ggggcacucg caagcacccu aucaggcagu accacaaggc cuuucgcgac ccaacacuac 120ucggcuagua gucucgcggg ggcacgccca aaucuccagg cauugagcgg guugauccaa 180gaaaggaccc ggucguccug gcaauuccgg uguacucacc gguuccgcag accaccaugg 240cucucccggg aggggggguc ccggaggcua cacgacacuc auacuaacgc cauggcuaga 300cgcuuucugc gugaagacag uaguuccuca caggggagug aucuauggug gagugucauu 360uuuaaucaaa aauuggc37权利要求
1.测定聚合酶活性的方法，其包括步骤a)孵育反应混合物以产生使用或不使用未修饰引物的标记的转录物，所述反应混合物含有所述聚合酶、合适的模板以及多种适当地放射性标记和非放射性标记的核苷三磷酸；b)在从约2.0到约4.5的pH范围内将所述标记的转录物与闪烁邻近测定法(SPA)的支持结构接触；和c)测量闪烁水平，其中所述闪烁水平与所述聚合酶的活性相关。
2.权利要求1的方法，其中所述聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
3.权利要求1或2的方法，其中所述合适的模板是杂聚模板。
4.权利要求3的方法，其中所述杂聚模板从由HCV IRES和HCV3’-UTR组成的组中选择。
5.权利要求1或2的方法，其中所述合适的模板是同聚模板。
6.测定聚合酶活性的方法，其包括步骤a)在一种或多种调节所述聚合酶活性的化合物存在下，孵育反应混合物以产生使用或不使用未修饰引物的标记的转录物，所述反应混合物包含所述聚合酶、合适的模板以及多种适当地放射性标记的和非放射性标记的核苷三磷酸；b)在从约2.0到约4.5的pH范围内将所述标记的转录物与闪烁邻近测定法(SPA)的支持结构接触；和c)测量闪烁水平，其中所述闪烁水平与所述聚合酶活性相关。
7.权利要求6的方法，其中所述聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
8.权利要求6或7的方法，其中所述合适的模板是杂聚模板。
9.权利要求8的方法，其中所述杂聚模板从由HCV IRES和HCV3’-UTR组成的组中选择。
10.权利要求6或7的方法，其中所述合适的模板是同聚模板。
全文摘要
本发明通过使用不需要亲和标签修饰的引物的闪烁邻近测定法(SPA)提供了测定聚合酶活性的方法。可以使用任意数目的RNA和DNA聚合酶实施本发明的方法。
文档编号C12Q1/70GK1979141SQ200610164548
公开日2007年6月13日 申请日期2006年12月5日 优先权日2005年12月9日
发明者甘清芬 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司