专利名称：一种固态发酵生产阿魏酸酯酶的方法
技术领域：
本发明属于发酵工业技术领域，特别涉及一种固态发酵生产阿魏酸酯酶的方法。
背景技术：
阿魏酸是一种芳香族有机酸，广泛存在于植物细胞壁中，是很多中草药如阿 魏、当归等的有效成分之一。现已广泛应用于医药、食品、化妆品等各行业。但 是阿魏酸在植物细胞壁中含量相对较低，且大多以单体或者聚体的形式结合在木 质素和多糖之间，使细胞壁的结构更加复杂致密，增加了纤维素酶水解的难度。 其提取工艺多为采用化学方法，产生大量有机试剂废水，同时成本相对较高。
阿魏酸酯酶是近年来才分离纯化出来的一种羧酸酯酶，它是一种胞外酶。阿 魏酸酯酶的来源比较广泛，目前发现的产酶微生物主要有黑曲霉(A m'g^)、链
霉菌(如5frej^ow少ces mw/m'"fo)、梭菌(如C7oWnWwm //jeA7woce//wm)、杆菌(如 5ac/〃M ^p)、孚L酸杆菌(7a"oZwc///0、假单胞菌(女口 i^ewt/oAwo"osy/wz-escem1 )等。 它可以将阿魏酸甲酯、多糖阿魏酸酯等中的阿魏酸游离出来。当阿魏酸酯酶作用 于细胞壁时，可以将其中的阿魏酸单体或者聚体释放出来。且阿魏酸酯酶与其它 细胞壁多糖水解酶之间存在协同作用，当酯酶与植物细胞壁的降解酶同时作用 时，将大大提高细胞壁的降解率。同时研究了将木聚糖酶、阿魏酸酯酶及纤维素 酶同时作用于燕麦麸，还原糖的含量最高提高了近30%。但研究中均用纯化酶， 成本高。
目前阿魏酸酯酶的生产方式以液态发酵为主，得到的阿魏酸酯酶的活性相对 较低，且废水等造成很大的污染。
因此本发明旨在研究一种用汽爆秸秆固态发酵生产阿魏酸酯酶的方法，以克 服阿魏酸酯酶活性低的缺点，同时有效利用木质纤维素资源，实现其生物量的全 利用。
发明内容
本发明旨在研究一种用汽爆秸秆固态发酵生产阿魏酸酯酶的方法。
本发明的技术方案如下以汽爆植物秸秆为主要发酵培养基原料，以实验室 筛选得到的高产阿魏酸酯酶的黑曲霉为菌种，用固态发酵生产方式生产阿魏酸酯
酶。所生产的阿魏酸酯酶酶活较高，最高达到450mU/g。
本发明生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于该方法为向75-100% (质量百 分比)汽爆处理的植物秸秆和0-25% (质量百分比)麸皮中，加入水制成发酵培 养基，固液比l: 1-10，调pH值在3.0-11.0后灭菌，接入黑曲霉液体种子发酵 3-4d，发酵产物用水浸提2h后，离心除去固形物，上清液为阿魏酸酯酶液。
本发明中所用的灭菌方式为常规灭菌。
本发明中所述的汽爆处理是将秸秆粗切至3-15cm，按l: 1 (重量比)加入 水，混匀后装入汽爆罐，于0.9-1.7MPa的蒸汽压力下维压4-12min后，瞬间减 压释放即得汽爆料；所述的秸秆是指稻草、麦草或者玉米秸秆。
本发明所用菌种为实验室筛选得到的高产阿魏酸酯酶的黑曲霉，发酵基质为 汽爆植物秸秆，所得到的阿魏酸酯酶酶活高，产率高，增大了酶法提取阿魏酸的 可行性。
本发明中阿魏酸酯酶酶活的测定中底物为去淀粉麦麸(DSWB)，按照 Johnson, K.G.的方法来制备。酶活测定方法为取稀释一定倍数的酶液lml，用 pH6.0拧檬酸缓冲液补充至lOrnl， 50'C水浴保温5min后，加入DSWS0.5g,反 应20min，沸水浴3min终止反应。酶解液过滤、离心，取上清液稀释适当倍数 后紫外测定阿魏酸的含量。
酶活力单位的定义在测定条件下每分钟产生lpmol阿魏酸所需要的酶量为 一个酶活力单位。
本发明有以下优点
1. 本发明采用的蒸汽爆破处理技术，使秸秆中的半纤维素和木质素部分降解， 原料中糖含量较高，不仅为菌种生产提供的丰富、易利用的碳源，同时可作 为膨松剂，因此，利用汽爆处理的植物秸秆作为发酵底物使菌体长势旺盛， 同时产酶酶活较高。
2. 该菌种适应性强，在固液比1: 1-1: 10、 pH3.0-11.0之间均能生长良好，且
产酶酵活较高。有利于廉价原料的利用、降低生产成本。
3. 所生产的阿魏酸酯酶经过进一步浓縮、分离纯化，得到不同剂型的阿魏酸酯 酶制剂，可用作木质纤维原料的纤维素酶解助剂、反刍动物粗纤维饲料的处 理，可以大大提高原料的利用率。
图l.不同基质固态发酵生产阿魏酸酯酶时间曲线
图2.初始pH值对固态发酵产酶的影响
图3.液固比对固态发酵产阿魏酸酯酶的影响 隱汽爆稻草《汽爆麦草 A汽爆玉米秸秆
具体实施例方式
实施例l:汽爆麦草固态发酵生产阿魏酸酯酶
1. 汽爆麦草
将切至10-15cm长的麦草150g加水150ml，搅拌均匀，装入汽爆罐中，通 入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.6MPa，维压4min，打开 放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2. 发酵用培养基的制备及灭菌
在4g汽爆麦草中加入lg麸皮，加水至固液比l: 4，搅拌均匀，自然pH值， 于灭菌锅中，12rC维持30min。
3. 接种
将已灭菌的培养基取出，于超净台上接入筛选得到的黑曲霉液体种子5ml， 搅拌均匀。于3(TC培养箱中静置培养3天得到发酵产物。
4. 酶液的制备
发酵产物加100ml蒸馏水，于摇床上28。C、 160rpm下震荡2h。离心除去固 形物，上清液为阿魏酸酯酶酶液。
测定该酶液酶活在148.13-245.12mU/g。
实施例2:汽爆稻草固态发酵产阿魏酸酯酶
1. 汽爆稻草
将切至10-15cm长的稻草150g加水150ml，搅拌均匀，装入汽爆罐中，通 入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.6MPa，维压4min，打开 放料阀，瞬间减压释放即得汽爆稻草。
2. 发酵用培养基的制备及灭菌
在4g汽爆稻草中加入lg麸皮，加水至固液比l: 4，搅拌均匀，自然pH值， 于灭菌锅中，12rC维持30min。
3. 接种
将已灭菌的培养基取出，于超净台上接入筛选得到的黑曲霉液体种子5ml， 搅拌均匀，于3(TC培养箱中静置培养3天得到发酵产物。
4. 酶液的制备
发酵产物加100ml蒸馏水，于摇床上28'C、 160rpm下震荡2h。离心除去固 形物，上清液为阿魏酸酯酶酶液。
测定阿魏酸酯酶酶液酶活在151.82-273.18mU/g。
实施例3:汽爆玉米秸秆固态发酵产阿魏酸酯酶
1. 汽爆玉米秸秆
将切至3-5cm长的玉米秸秆150g加水150ml，将拌均匀，装入汽爆罐中， 通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.6MPa，维压4min，打 开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆玉米秸秆。
2. 发酵用培养基的制备及灭菌
在4g汽爆玉米秸秆中加入lg麸皮，加水至固液比l: 4,搅拌均匀，自然 pH值，于灭菌锅中，12rC维持30min。
3. 接种
将已灭菌的培养基取出，于超净台上接入筛选得到的黑曲霉液体种子5ml， 搅拌均匀，于3(TC培养箱中静置培养3天得到发酵产物。
4. 酶液的制备
发酵产物加100ml蒸馏水，于摇床上28i:、 160rpm下震荡2h。离心除去固 形物，上清液为阿魏酸酯酶酶液。
测定阿魏酸酯酶酶液酶活在113.89-216.76mU/g。
实施例4:汽爆稻草不同温度固态发酵产阿魏酸酯酶
1. 汽爆稻草
将切至10-15cm长的稻草150g加水150ml，将拌均匀，装入汽爆罐中，通 入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.6MPa,维压4min，打开 放料阀，瞬间减压释放即得汽爆稻草。
2. 发酵用培养基的制备及灭菌
在4g汽爆稻草中加入lg麸皮，加入水溶液，固液比l: 4，搅拌均匀，自 然pH值，于灭菌锅中，12rC维持30min。
3. 接种
将己灭菌的培养基取出，于超净台上接入筛选得到的黑曲霉液体种子5ml， 搅拌均匀。分别与26'C、 28°C、 30°C、 32'C下培养3天得到发酵产物。
4. 酶液的制备
发酵产物加100ml蒸馏水，于摇床上28。C、 160rpm下震荡2h。离心除去固 形物，上清液为阿魏酸酯酶酶液。
测定阿魏酸酯酶酶液酶活在258.41-333.31mU/g。
权利要求
1.一种生产阿魏酸酯酶的方法，该方法为向75-100％(质量百分比)汽爆处理的植物秸秆和0-25％(质量百分比)麸皮中，加入自来水制成发酵培养基，固液比1∶1-1∶10，调pH值在3.0-11.0后灭菌，接入黑曲霉液体种子发酵3-4d，发酵产物用水浸提，离心除去固形物，上清液为阿魏酸酯酶酶液。
2. 根据权利要求1所述的生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于汽爆处理是指在 汽爆罐中装入粗切的植物秸秆，与0.9-1.7MPa的蒸汽压力下对原料处理4- 12min，瞬间减压释放。
3. 根据权利要求1、2所述的生产阿魏酸酯酶的方法中，其特征在于所述的植物 秸秆包括玉米秸秆、麦草或稻草。
4. 根据权利要求1所述的生产阿魏酸酯酶的方法中，其特征在于所述的发酵用 菌种为黑曲霉。
5. 根据权利要求l所述的生产阿魏酸酯酶的方法中，其特征在于所说的黑曲霉 液体种子的接入量为相对固体料重的7-15%。
全文摘要
本发明属于发酵工业技术领域，特别涉及生产阿魏酸酯酶的方法。该方法为向75-100％(质量百分比)汽爆处理的植物秸秆和0-25％(质量百分比)麸皮中，加水制成发酵培养基，固液比1∶1-10，调pH值在3.0-11.0后灭菌，接入液体种子发酵3-4d，发酵产物用水浸提，上清液为阿魏酸酯酶酶液。本发明所用发酵基质资源丰富、价格低廉，发酵方式简单，得到的阿魏酸酯酶活性高。
文档编号C12N9/18GK101200712SQ200610165049
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月12日 优先权日2006年12月12日
发明者王洪川, 陈洪章 申请人:中国科学院过程工程研究所