专利名称：5′呈味核苷酸的生物合成方法
技术领域：
本发明涉及5′呈味核苷酸的制备方法，特别是涉及一种生物合成5′呈味核苷酸的方法。
背景技术：
上个世纪50年代，研究人员发现5’-肌苷酸(5’-IMP)和5’-鸟苷酸(5’-GMP)与谷氨酸钠(MSG)混合时产生协同效应(又称相乘作用)，可使食品鲜度提高数倍至数十倍。因此，以5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸为代表的呈味核苷酸的应用引起了国内外的广泛关注。如今，呈味核苷酸作为一种新型的添加剂，已广泛应用于医疗卫生、营养、食品和医药等领域。
自上世纪60年代日本率先进行呈味核苷酸的工业化生产以来，已有多种生产呈味核苷酸及其衍生物的方法。按生产工艺进行归纳，主要有三种化学合成法、RNA酶解法及微生物发酵法。这三种方法的生产工艺及其产品均有很大差别。
化学合成法主要是利用核苷进行磷酸酯化反应。常用的磷酸化试剂主要是磷酸或焦磷酸的活性衍生物。焦磷酸的活性衍生物可为焦磷酰氯或双-对-硝基苯焦磷酸等，而工业上广泛采用的是三氯氧化磷。要在核苷的5’位上导入磷酸基，需在磷酸化反应前，保护核苷上核糖的2’和3’位的羟基。磷酸化完成后，再脱去保护剂，得到5’-核苷酸。
由于化学合成法所用试剂较昂贵，致使生产成本偏高，且具有一定毒性，一般用于生产一些有特殊用途的核苷酸及其衍生物。
酶解法生产5’-核苷酸的历史最长、技术也最成熟。利用桔青霉发酵，得到5’-磷酸二酯酶与从酵母中提取的RNA进行反应，可生成四种5’-核苷酸的混合物，将混合物经离子交换树脂分离纯化，即可得到四种核苷酸的纯品。
通常采用固体发酵或深层发酵法制备5’-磷酸二酯酶。前者简便、成本低，但占地面积大，生产效率低，且产生的分生孢子易污染环境，后者成本偏高。利用5’-磷酸二酯酶酶解RNA后，需要将四种核苷酸混合物进行分离纯化，才能得到5’-肌苷酸的纯品。但要获得5’-IMP，则是将5’-AMP进行化学或酶转化，生产工艺复杂，成本偏高。
早期用酶法得到的与呈味无关的5’-CMP(5’-胞苷酸)、5’-UMP(5’-尿苷酸)，在当时无法利用，使得成本更高，因此，在谷氨酸发酵研究成功的基础上，日本开始了核酸类物质的发酵研究。
微生物发酵法又分一步法和二步法。一步法主要用于5’-肌苷酸和5’-黄苷酸的生产。二步法即直接由碳源发酵生产或先发酵生成核苷，再经化学磷酸化，获得了相应的核苷酸。
1961年，日本科学家利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)的腺嘌呤缺陷型生成了5’-肌苷酸、肌苷。随后又报道了高产肌苷的枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型菌株，并建立了肌苷的工业化生产(Konjo K，Imai K，et al.Annual Congress Agr.Chem.Soc.1963 Abstracts，P.40)。1968年，在深入研究腺嘌呤缺陷型的产氨短杆菌(B.Ammoniagenes)时，在培养基中加入锰离子，以观察对其生长的影响，结果筛选到了对锰离子不敏感的菌株，能够高产肌苷酸。上述研究结果表明，一步法生产菌株的选育比较复杂，产生的肌苷酸易于分解，而且解决或解除终产物反馈调节问题也比较复杂，这都极大地限制了一步法生产肌苷酸的工业应用；而二步法得到的中间产物，如肌苷、鸟苷等本身也是很重要的发酵产品，其调控相对容易，因此二步法生产工艺的关键问题在于中间产物发酵后，如何高效地转化成目标核苷酸。
1999年日本Asano等发现，Morganella morganii等许多肠杆菌的酸性磷酸酶具有选择性磷酸酶转移酶活性。该磷酸酶可利用焦磷酸和核苷酸为底物，特异性催化5’肌苷酸的生成，从而为酶法进行核苷的5’磷酸化提供了新方法。而且，在核苷磷酸化方面，由于酶催化具有反应条件温和、低成本、低毒性和特异性高等优点，展现了较大的发展潜力。然而迄今为止，有关酸性磷酸酶转移酶活性的酶学动力学、细胞催化、融合蛋白催化及酶相关催化过程的参数还没有被系统报道过。
通过以上分析可见，上述合成5’呈味核苷酸的方法各有不足，开发生产呈味剂的新方法是核苷酸发酵工业发展的重要方向之一。目前，我国发酵法生产肌苷和鸟苷已经实现工业化，以此为基础进一步开发生产5’-肌苷酸技术的关键是如何实现肌苷和鸟苷的特异性磷酸化。酶法转化因其具有简便高效和选择性强等优点，具有很大的发展潜力，而开发具有特异性催化合成5’呈味核苷酸潜力的菌株和工艺，是解决问题的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种产量较高、成本低廉的生物合成5′呈味核苷酸的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种生物合成5′呈味核苷酸的方法，是将含有酸性磷酸酶基因的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体作为催化剂添加到含底物焦磷酸和肌苷(Inosine)或鸟苷(Guanosine)的反应溶液中，在25-35℃，pH 4.0-8.4下反应，得到5’-肌苷酸(5’-IMP)或5’-鸟苷酸(5’-GMP)。
在上述5′呈味核苷酸的合成方法中，反应条件优选为30℃，pH 4.6。
为获得更高的合成效率，可将含有酸性磷酸酶基因的产气肠杆菌菌体细胞破碎后，用破碎细胞液进行上述催化反应，此时的反应条件优选为30℃，pH 7.6。
可用常规方法对产气肠杆菌菌体细胞进行破碎处理，如超声、化学破碎法或酶学破碎法等。所述破碎菌体的方法可为将菌体置于pH 7.2-8.4，0.1mM的Tris·HCl缓冲液中，在0℃冰水浴中超声50-150次，每次超声时间为2-4sec，间隔时间为2-4sec。
上述反应液中肌苷的浓度为5-40mg/mL，优选为10mg/mL；鸟苷的浓度为5-40mg/mL，优选为10mg/mL；焦磷酸的浓度为200-300mg/mL，优选为250mg/mL；产气肠杆菌菌体细胞的浓度为10-80mg/mL，优选为20mg/mL。
此外，为提高酶促反应效率，在上述反应液中还可添加浓度为0.1-0.4mg/mL的硫酸镁，以提供Mg2+。
所述含有酸性磷酸酶基因的产气肠杆菌可按照常规培养方法获得，如将产气肠杆菌接种于LB液体培养基中，在30-37℃，100-250rpm下培养。
本发明提供了一种生物合成呈味核苷酸(5′-IMP和5′-GMP)的方法。该方法是以焦磷酸和肌苷(或鸟苷)为底物，利用产气肠杆菌所具有的酸性磷酸酶活性将肌苷(或鸟苷)特异性催化生成5′-IMP(或5′-GMP)，反应原理见图1。本发明具有以下优点1)选用的菌株具有酸性磷酸酶活性高，生长速度快和环境适应性强的优点，在好氧及厌氧条件下均可生长，适于工业化生产；2)合成方法简单，目的产物的产量高，5′-肌苷酸的浓度可达6.21mg/mL、5′鸟苷酸的浓度可达6.0mg/mL；3)原料来源广泛，对设备要求低，生产成本低廉。
本发明将在5′呈味核苷酸的工业化生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明5’-肌苷酸合成方法的原理图。
图2为pH值对产气肠杆菌整细胞催化合成5′-肌苷酸影响的检测结果。
图3为最适pH值产气肠杆菌整细胞催化合成5′-肌苷酸随时间变化关系的检测结果。
图4为产气肠杆菌整细胞催化合成5′-肌苷酸时底物肌苷的转化率与目标产物5′-肌苷酸的转化率随时间变化关系的检测结果。
图5为用产气肠杆菌细胞破碎液进行催化5′-肌苷酸的生物合成时不同pH酶活力影响的检测结果。
图6为最适pH值时产气肠杆菌细胞破碎液催化合成5′-肌苷酸随时间变化关系的检测结果。
图7为产气肠杆菌细胞破碎液催化合成5′-肌苷酸时底物肌苷的转化率与目标产物5′-肌苷酸的转化率随时间变化关系的检测结果。
图8为产气肠杆菌内酸性磷酸转移酶的存在方式检测结果。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞催化5′-肌苷酸的生物合成及不同pH对整细胞催化合成5′-肌苷酸的影响1、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体的获得挑取产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)(购自日本东京大学应用微生物研究所(IAM)菌种库)的单菌落，将其接种于50mL盛有20mL LB液体培养基的小三角瓶中，在37℃、100rpm摇床培养12小时(过夜)作为种子液；再取1.5mL种子液，将其接种到盛有150mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，在37℃、180rpm下培养至OD600值为1.8时，12000rpm离心8min，弃上清，得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)菌体细胞。
2、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞催化5′-肌苷酸的生物合成时不同pH对整细胞催化合成5′-肌苷酸的影响向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液反应体系中添加步骤1获得的0.4g产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体细胞(相当20mg/mL)，然后在30℃及不同pH(4.0-5.6)下反应16h后，离心取上清，稀释一倍，用高压液相色谱法对合成的5′-肌苷酸进行定性、定量测定，以检测不同pH对产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞催化合成5′-肌苷酸的影响。检测结果如图2所示(纵坐标为5′-肌苷酸的浓度(mg/mL)，横坐标为pH值)，pH值为4.0-5.6时均能生成5′-肌苷酸，且在pH值约为4.8时，5′-肌苷酸的合成速率最快。
实施例2、用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞催化5′-肌苷酸的生物合成时5′-肌苷酸随时间的变化关系用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌菌体细胞，然后向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加实施例1步骤一获得的0.4g产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体细胞(相当20mg/mL)，然后在28℃、pH4.8下进行催化反应，每隔2小时取样，离心取上清，用高压液相色谱法对合成的5′-肌苷酸进行定性、定量测定，以检测产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes IAM1183)整细胞催化合成5′-肌苷酸随时间的变化关系。检测结果如图3所示(纵坐标为5′-肌苷酸的浓度(mg/mL)，横坐标为反应时间)，随着反应时间的延长，5′-肌苷酸的浓度近似呈线性增加，表明反应速度并无明显下降，即底物浓度相对过量，反应速度仍保持最大速度，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)的磷酸转移酶仍具有较高活力，酶活稳定。
实施例3、用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞进行5′肌苷酸的生物合成及底物转化率与目标产物转化率随时间的变化关系用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体细胞，然后向含8mg/mL肌苷，300mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.4mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加实施例1步骤一获得的0.4g产气肠杆菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)细胞(相当20mg/mL)，然后在30℃、pH4.8下进行催化反应，每隔2小时取样，离心取上清，用高压液相色谱法对合成的5′-肌苷酸及底物浓度进行定性、定量测定。以检测底物肌苷的转化率与目标产物5′-肌苷酸的转化率随时间的变化关系。检测结果如图4所示(纵坐标为转化率(％)，横坐标为反应时间)，肌苷转化率随时间的变化关系较为平缓，随反应时间的变化不大，表明肌苷对于细胞膜的渗透性较强，能够较容易地进入细胞；而5′-肌苷酸的生成随时间变化较为明显，且近似线性，这与5′-肌苷酸的渗透性较差有关，合成的5′-肌苷酸需逐步释放到胞外。
实施例4、检测用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)细胞破碎液催化5′-肌苷酸的生物合成时不同pH对游离磷酸转移酶活力的影响用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后用超声法破碎菌体细胞，方法为将菌体置于pH 7.6，0.1mM的Tris·HCl缓冲液中，在0℃冰水浴中超声99次，每次超声时间为3sec，间隔时间为3sec。再向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerrogenes IAM1183)菌体破碎液，然后在30℃及不同pH(5.2-8.4)下反应10min后，用0.15mL浓盐酸终止反应。用高压液相色谱法对合成的5′-肌苷酸进行定性、定量测定。酶活性检测结果如图5所示(纵坐标为游离的磷酸转移酶活力(U)，MES表示醋酸钠缓冲溶液pH5.2-6.8，Tris·HCl表示pH7.2-8.4横坐标为pH值)，在pH为7.6时，游离的磷酸转移酶活力最高，且具有最大的催化反应速度，为最佳反应的pH值，同时也说明pH值对游离磷酸转移酶的活力影响比用产气肠杆菌整细胞进行催化合成时更为明显。
实施例5、在最佳pH 7.6下用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎细胞液催化生物合成5′-肌苷酸随时间的变化关系。
与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后用与实施例4相同的方法破碎细胞，再向含15mg/mL肌苷，250mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加40mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体破碎液，然后在30℃、pH 7.6条件下进行催化反应，每隔2小时取样，加入0.15mL浓盐酸终止反应。在20℃、8000rmp下离心20min，将上清液稀释1倍，用高压液相色谱法对合成的5′-肌苷酸进行定性、定量测定；以检测产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎细胞催化合成5′-肌苷酸随时间的变化关系。检测结果如图6所示(纵坐标为5′-肌苷酸的浓度(mg/mL)，横坐标为反应时间)，破碎细胞催化能力较强，反应10分钟可将加入肌苷总量的38.4％转化为5′-肌苷酸，当5′-肌苷酸浓度达到5.8mg/mL时，反应速度明显下降，说明酶活受到产物的抑制。
实施例6、在最佳pH7.6下用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎细胞液进行5′-肌苷酸的生物合成及底物转化率与目标产物转化率随时间的变化关系用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后用与实施例4相同的方法破碎菌体细胞，再向含10mg/mL肌苷，250mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.1mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加15mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体破碎液，然后在30℃、pH7.6下进行催化反应，每隔2小时，用0.15mL浓盐酸终止反应。用高压液相色谱法对合成的5′-肌苷酸及底物浓度进行定性、定量测定，以检测底物肌苷的转化率与目标产物5′-肌苷酸的转化率随时间的变化关系。检测结果如图7所示(纵坐标为转化率(％)，横坐标为反应时间)，在初始较短的时间内，反应可以很快地进行，在10min内，5′-肌苷酸的浓度可以达到5.85mg/mL，而在此后5′-肌苷酸的浓度随反应时间的变化并不明显，到达16h后，5′-肌苷酸的浓度可达6.21mg/mL。
实施例7、检测产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)内酸性磷酸转移酶的存在方式用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后用与实施例4相同的方法破碎细胞，然后在20℃、8000rmp下离心20min，分离上清液和沉淀，再将破碎菌体的上清液和沉淀，以及未进行离心分离的破碎菌体和含全菌体的培养菌液分别作为催化物加到含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中在30℃、pH 7.6条件下进行催化反应，以无催化物的反应体系为阴性对照，用高压液相色谱法测定产物的5′-肌苷酸的浓度。检测结果如图8所示(纵坐标为5′-肌苷酸的浓度(mg/mL)，横坐标为反应时间)，产气肠杆菌细胞破碎液上清的催化能力远大于破碎沉淀物的催化能力，说明产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)的酸性磷酸转移酶处于细胞内，并且具有可溶性强的特点。
实施例8、利用产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)整细胞合成5′-鸟苷酸用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后向含10mg/mL鸟苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes 1AM1183)全菌体，然后在30℃、pH4.8下进行催化反应，并每隔2小时取样，用高压液相色谱法对合成的5′-鸟苷酸进行定性、定量测定。结果随着反应时间的延长，5′-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，表明本发明所选用的菌株具有较高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鸟苷酸的生物合成中。
实施例9、利用产气肠杆菌破碎细胞合成5′-鸟苷酸用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后用与实施例4相同的方法破碎细胞，再向含12mg/mL鸟苷，280mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.3mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加50mg/mL产气肠杆菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)细胞破碎液，然后在32℃、pH 8.0下进行催化反应，每隔2小时用高压液相色谱法对合成的5′-鸟苷酸浓度进行定性、定量测定。结果且随着反应时间的延长，5′-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，表明本发明所选用的菌株具有较高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鸟苷酸的生物合成中。
实施例10、利用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞合成5′-鸟苷酸用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后向含10mg/mL鸟苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后在30℃、pH4.8下进行催化反应，并每隔2小时取样，用高压液相色谱法对合成的5′-鸟苷酸进行定性、定量测定。结果随着反应时间的延长，5′-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，到达16h后，5′-鸟苷酸的浓度可达5.9mg/mL，表明本发明所选用的菌株具有较高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鸟苷酸的生物合成中。
实施例11、利用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞合成5′-鸟苷酸用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后向含5mg/mL鸟苷和200mg/mL Na4P2O7·10H2O的溶液中添加10mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后在25℃、pH7.6下进行催化反应，并每隔2小时取样，用高压液相色谱法对合成的5′-鸟苷酸进行定性、定量测定。结果随着反应时间的延长，5′-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，5′-鸟苷酸的浓度可达5.5mg/mL，表明本发明所选用的菌株具有较高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鸟苷酸的生物合成中。
实施例12、利用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整细胞合成5′-鸟苷酸用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后向含40mg/mL鸟苷，300mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.4mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加80mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes I4M1183)全菌体，然后在35℃、pH8.4下进行催化反应，并每隔2小时取样，用高压液相色谱法对合成的5′-鸟苷酸进行定性、定量测定。结果随着反应时间的延长，5′-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，5′-鸟苷酸的浓度可达5.9mg/mL，表明本发明所选用的菌株具有较高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鸟苷酸的生物合成中。
实施例13、利用产气肠杆菌破碎细胞合成5′-鸟苷酸用与实施例1相同的方法得到产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌体，然后用超声法破碎菌体细胞，方法为将菌体置于pH 8.4，0.1mM的Tris·HCl缓冲液中，在0℃冰水浴中超声150次，每次超声时间为5sec，间隔时间为2sec。再向含12mg/mL鸟苷，280mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.1mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加50mg/mL产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)细胞破碎液，然后在30℃、pH 7.6下进行催化反应，每隔2小时用高压液相色谱法对合成的5′-鸟苷酸浓度进行定性、定量测定。结果且随着反应时间的延长，5′-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，5′-鸟苷酸的浓度可达6.0mg/mL，表明本发明所选用的菌株具有较高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鸟苷酸的生物合成中。
权利要求
1.一种生物合成5′呈味核苷酸的方法，是将含有酸性磷酸酶基因的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体添加到含底物焦磷酸和肌苷或鸟苷的反应溶液中，在25-35℃，pH4.0-8.4下反应，得到5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于向反应溶液中添加浓度为0.1-0.4mg/mL的硫酸镁。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应条件为30℃，pH4.6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于破碎含有酸性磷酸酶基因的产气肠杆菌菌体细胞，再用细胞破碎液进行反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述破碎菌体的方法为将菌体置于pH7.2-8.4，0.1mM的Tris·HCl缓冲液中，在0℃冰水浴中超声50-150次，每次超声时间为2-4sec，间隔时间为2-4sec。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述反应条件为30℃，pH7.6。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于所述肌苷的浓度为5-40mg/mL，鸟苷的浓度为5-40mg/mL，焦磷酸的浓度为200-300mg/mL，产气肠杆菌菌体的添加量为10-80mg/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述肌苷的浓度为10mg/mL，鸟苷的浓度为10mg/mL，焦磷酸的浓度为250mg/mL，产气肠杆菌菌体的添加量为20mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种5′呈味核苷酸的生物合成方法。该方法是将含有酸性磷酸酶基因的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌体添加到含底物焦磷酸和肌苷或鸟苷的反应溶液中，在25－35℃，pH 4.0－8.4下反应，得到5’－肌苷酸或5’－鸟苷酸。本发明具有以下优点1)选用的菌株具有酸性磷酸酶活性高，生长速度快和环境适应性强的优点，在好氧及厌氧条件下均可生长，适于工业化生产；2)生产方法简单，目的产物的产量高；3)原料来源广泛，对设备要求低，生产成本低廉。本发明将在5′呈味核苷酸的工业化生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12R1/01GK1974780SQ20061016527
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者邢新会, 赵洪新, 杨成, 卢元, 张翀, 王立言 申请人:清华大学