一种巴曲酶及其制备方法与专用编码基因的制作方法

文档序号:430931
专利名称:一种巴曲酶及其制备方法与专用编码基因的制作方法
技术领域
本发明涉及一种巴曲酶及其制备方法与专用编码基因。
背景技术
1963年,Klobusitzi和Konig从美洲矛头蝮蛇(Bothrops atrox)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶,即巴曲酶。迄今为止,已得到三十多种类凝血酶的全部和部分氨基酸序列,它们的一级结构非常相似,这些凝血酶都能够酶切哺乳动物的血浆纤维蛋白原,使之转变为纤维蛋白,从而影响动物的出血-凝血过程。在这些蛇毒类凝血蛋白酶中,尤其对巴曲酶和安克洛(Ancrod)的物理、化学性质与临床应用,研究的较为清楚(Stocker K andBariow G.H.Methods Enzymol.1976,45214-223)。
巴曲酶的特异性作用底物是纤维蛋白原,与凝血酶不同的是,它只切割纤维蛋白原的A链,而不作用B链。当它水解血浆纤维蛋白原A链中的Arg16-GLy17位键时,能够释放出纤维蛋白肽A,从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白,接着这些纤维蛋白就能聚集成疏松的易于被纤维蛋白酶水解的血栓来封闭伤口,实现快速止血的功效。在使用较大剂量的时侯,巴曲酶有降低血中纤维蛋白原浓度,改善血液黏度和血液的流体力学特性,从而起到降纤酶的功效(Pirkle H and Stocker K.Thromb Haemost.1991,65444-450;MarshN.A.Blood Coagul Fibrinolysis.1994,5339-410)。基于这样一些生物化学特性,巴曲酶已经被成功地开发成止血药和降纤药。有高效止血功能的制剂(国外商品名Reptilase,中文译名“立止血”,另外还含有凝血因子X激活物);有降纤作用的制剂(国外商品名Defibrase,中文译名“降纤酶”)。在欧洲,巴曲酶正在替代人凝血酶作为止血药物。
目前在我国上市7种蛇毒毒液中分离纯化的类凝血酶制剂。临床使用历史最悠久的类凝血酶是巴曲酶和马来西亚红口蝮蛇(A.rhodostoma)蛇毒的安克洛。国内有五步蛇毒祛纤酶、东北白眉蝮蛇抗栓酶(清栓酶)、江浙蝮蛇抗栓酶和‘立止血’仿制品‘巴曲亭’(该药(保护期为2001.8.21-2007.8.21>也是从蛇毒中提取制备而成)等用于临床。但是从蛇的毒液中提取巴曲酶的生产成本太高。
巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链,但是巴曲酶分子中有12个半氨酸,形成六种分子内二硫键;还有糖基化修饰,其分子内有两个N-糖基化位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr227。成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白,理论计算出其分子量为25.5kD,等电点为7.39,国外从B.atrx.moojuni毒液中生物提取的巴曲酶的实际分子量为42kD,这种分子量的偏差是由于糖基化修饰缘故。此外,B.atrox的其它亚种以及其它种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白,不过其分子量从29kD到42kD不等,这也是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。虽然研究者对巴曲酶的性质有了比较多的了解,但是,对这种蛇毒成分的分子生物学研究一直进展缓慢。1991年,日本科学家Maeda等首次利用重组DNA技术得到了B.atrox moojenii类凝血酶的基因,并克隆到大肠杆菌中获得融合表达(MAEDA M,SATOH S,SUZUKI S,et al.J Biochem.1991,109632-637)。2002年,杨青等报道长白白眉蝮类凝血酶Gussruobin和大连蛇到蝮类凝血酶Gloshedobin在毕氏酵母中获得表达(杨青,胡学军,许小明,等.生物化学与生物物理学报.2002,34(1)6-10)。2004年,K.H.Chung等亦是采用毕氏酵母表达B.atrox.moojuni的巴曲酶,具有与天然巴曲酶相同的生物学活性,纯化后产量达到6.95μg/ml(Weon-Kyoo You,Kwang-Hoe Chung,et al.FEBS.2004,57167-73)。2004年,中国的黄秀东等(中国专利公告号为CN1534093)采用毕氏酵母表达B.atrox.moojuni的巴曲酶,纯化后产量达到20KU/ml。
采用基因工程的手段生产富含二硫键和糖基化修饰的蛋白一直都是一个技术难题,尤其是生产有多对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶类分子。这是因为二疏键配对错误率很高,在原核中得到的几乎全是包涵体。真核细胞表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)中能保证较高二硫键配对正确率。在真核生物中分泌蛋白的折叠和组装是在内质网(endoplasmicreticulum,ER)上完成的,在内质网上有许多分子伴侣(molecular chaperone)。分子伴侣的概念为在生物大分子的折叠(folding)、组装(assembly)、转运及降解等过程中起协助作用,参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立;参与细胞周期调控、抗衰老、凋亡调控等,但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子。如结合蛋白(Kar2p,binding protein,Bip),它能够识别内质网蛋白的信号序列(signal sequence);Bip蛋白还具有ATP酶活性,能够水解ATP提供其作用于蛋白质折叠所需的能量;蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)可辅助二硫键的正确配对。

发明内容
本发明的目的是提供一种巴曲酶及其制备方法与专用编码基因。
本发明所提供的制备巴曲酶的专用基因,具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2;2)序列表中序列2经替换1-3个碱基,编码相同功能蛋白的核苷酸序列;3)在1)所述序列的5′端连接IL-2信号肽基因序列得到的核苷酸序列。
4)在高严谨条件下可与1)、2)或3)所述序列的DNA序列杂交的核苷酸序列;所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液在65℃下洗膜。
所述IL-2信号肽基因的核苷酸序列为自GENBANK号为NM_000586的5′端第295-354位核苷酸。
所述编码基因具有下述的核苷酸序列之一
1)序列表中序列2;2)序列表中序列4;3)序列表中序列6;4)序列表中序列8。
本发明所提供的制备巴曲酶的方法,是将上述的编码基因通过真核表达载体导入酵母菌或哺乳动物细胞系中表达,获得巴曲酶蛋白。
所述方法中,所述酵母菌可为毕赤酵母,优选为毕赤酵母GS115/His-。
所述哺乳动物细胞系为CHO细胞系。
当所述编码基因导入酵母菌中时,所述真核表达载体为pPIC9;当所述编码基因导入哺乳动物细胞系中时,所述真核表达载体为pcDNA3.1。
所述编码基因导入酵母菌发酵表达所用发酵培养基含有山梨醇和大豆蛋白胨。所述编码基因导入酵母菌发酵表达的方法优选为在30℃,pH5.0,在基础培养基终发酵20小时后,按0.8ml/min加入5%甘油100ml,饥饿30分钟,再加入3g大豆蛋白胨,调pH至6.9,按0.2ml/min加入含0.2%体积山梨醇的甲醇诱导培养90小时;所述基础培养基为40g/L甘油,18g/L K2SO4,15g/L MgSO4.7H2O,4.13g/L KOH,0.9g/L CaSO4.2H2O,13.3mL/L H3PO4。
所述方法还包括将表达获得的巴曲酶蛋白进行纯化。其中,酵母表达巴曲酶的纯化方法为将发酵上清液加入2M硫酸铵盐等预处理后,先经过疏水层析介质(STREAMLINETMPhenyl),再经过阳离子交换介质(SP SepharoseTMFF)和肝素琼脂糖凝胶FF介质(HeparinSepharose FF),最后再进行一步凝胶过滤层析(SephacrylS-100)就可以制备出巴曲酶纯品。
上述的方法制备的巴曲酶蛋白也是本发明的保护范围。
所述巴曲酶蛋白的核苷酸序列是1)序列表中序列1;2)序列1的氨基端第59位Ala突变为Arg的氨基酸序列(序列表中序列5);3)序列1的氨基端第128位Thr突变为Arg的氨基酸序列(序列表中序列7);4)序列1的氨基端连接IL-2信号肽的氨基酸序列(序列表中序列3);所述IL-2信号肽的氨基酸序列为自GENBANK号为NP_000577的氨基端第1-20位氨基酸序列。
本发明选择酵母和CHO细胞都喜好的遗传密码子,人工合成了巴曲酶全长基因序列,将该基因分别插入到Pichia pastoris的分泌型表达载体pPIC9类载体和CHO细胞的表达载体pcDNA3.1中进行分泌表达,成功地表达出了生物学活性高的巴曲酶蛋白。通过优化发酵过程中的一系列条件,如加入一定量的山梨醇(有利于酵母产生更多的基础蛋白包括分子伴侣,糖基化酶等)和大豆蛋白胨(可以延缓分泌蛋白的降解),纯化后产量达到每毫升发酵液10μg/ml或14巴曲酶单位(14BU/ml),比活性为1400BU/mg。这一产量超过了其它已发表和报道的表达水平,适合规模化生产。
本发明的方法利用上述制备巴曲酶的专用基因,由酵母、CHO细胞产生的糖基化的巴曲酶、突变的巴曲酶,它们具有使含抗凝剂的动物血浆凝结的特性;所说的抗凝剂包括肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、水蛭肽和水蛭素等;本发明的方法生产的巴曲酶的氨基酸序列(SEQ-1)与Bothrops atrox moojeni毒液中巴曲酶(Batroxobin)氨基酸序列相同或者突变了几个氨基酸,但其分子的糖基化修饰具有酵母或哺乳动物细胞的特点,且这类修饰是其生物活性所必须的;并且用本发明的方法在酵母中表达该巴曲酶,可以利用酵母的α-信号肽,其中信号肽序列与巴曲酶蛋白之间插入了KEX2蛋白酶识别序列,可以使表达的蛋白经KEX2蛋白酶切后具有与自然的巴曲酶同样的N端。
本发明的方法制备的巴曲酶和突变的巴曲酶可作为一种止血药的主要成分,也可以直接作为降纤维药之用。


图1为巴曲酶基因表达载体pPIC9-BG0的构建图2为巴曲酶突变体基因(图中均用BGm表示BGm1、BGm2、BGm3、BGm4)表达载体pPIC9-BGm1、pPIC9-BGm2、pPIC9-BGm3、pPIC9-BGm4(图中均用pPIC9-BGm表示)的构建流程3为pPIC9-BG0转化GS115后菌落PCR鉴定结果图4为BG0表达的巴曲酶蛋白的不同发酵时间(0-90小时)的SDS-PAGE电泳图谱图5为BG0表达的巴曲酶蛋白的疏水层析介质分析图谱(STREAMLINETMPhenyl)图6为BG0表达的巴曲酶蛋白的阳离子交换介质分析图谱(SP SepharoseTMFast Flow)图7为BG0表达的巴曲酶蛋白的肝素琼脂糖凝胶FF介质(Heparin Sepharose FF)分析图谱图8为BG0表达的巴曲酶蛋白的凝胶过滤层析图谱(SephacrylS-100)图9为BG0在酵母中表达的巴曲酶蛋白的SDS-PAGE电泳图10为BG0表达的巴曲酶蛋白的分子量质谱11为CH0表达的巴曲酶蛋白的SDS-PAGE电泳图12为巴曲酶(2 NIH Units/kg)对小鼠出血时间的影响具体实施方式
下述实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1、重组巴曲酶基因BG0的合成及其表达巴曲酶的效果检测1、重组巴曲酶基因BG0的获得及表达载体的构建
1)重组巴曲酶基因BG0的获得根据Genebank中公开的巴曲酶(GENBANK Accession Number为X12747)的氨基酸序列资料,选择酵母和CHO细胞都能较喜好的遗传密码子,人工合成了重组巴曲酶全长基因序列(具有序列表中序列2的核苷酸序列)。为使目的基因能插入pPIC9载体,在巴曲酶基因(Batroxobin Gene,BG)(GENBANK Accession Number为X12747自5′端第1-693位核苷酸)的5′-端添加限制酶XhoI的切点,3′-端添加TAA终止密码以及EcoRI切点,另在XhoI切点与巴曲酶蛋白N-端第一个氨基酸Val密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAA AGA,这就确保目的蛋白在分泌到发酵上清液中时能够顺利地切除a-信号肽序列,使工程菌表达的巴曲酶具有同蛇毒中提取的该蛋白一样的N-端氨基酸序列。设计重组巴曲酶全长基因的核苷序列与Genebank Accession Number为X12747和黄秀东等合成的巴曲酶基因核苷酸序列(中国专利公告号为CN1534093)分别有18.9%和15.9%的差异。
基因的拼接过程采用递归式PCR(Recursive PCR)方法,具体方法为将整个基因分成相临重叠的12个片段进行合成,具体如下T15′-CTCGAGAAAAGAGTCATTGGAGGTGATGAATGTGACATCAACGAACACCCTTTCCTTGCCTTCATGTACTACTCTCCACG-3′;T25′-CAGTGTGCAGCGGTCAGGACCCATTCCTGGTTGATCAAAGTCATACCACAGAAGTAACGTGGAGAGTAGTACATGAAGGC-3′;T35′-CCTGACCGCTGCACACTGTAACAGAAGATTTATGCGTATCCACCTTGGTAAGCACGCCGGATCTGTCG-3′;T45′-CTTATTAGGACAAATGAACTTCTCCTTTGGGTATCTAACGACCTCATCGTAGTTGGCGACAGATCCGGCGTGC-3′;T55′-GGAGAAGTTCATTTGTCCTAATAAGAAGAAAAACGTCATTACCGACAAGGACATTATGTTGATCAGACTGGACAGACCTG-3′;T65′-CAACACTTGGAGGGTTGGAAGGCAAAGAGAGAGGAGCGATGTGTTCGGAGTTTTTGACAGGTCTGTCCAGTCTGATCAAC-3′;T75′-CCAACCCTCCAAGTGTTGGTTCCGTTTGCCGTATTATGGGATGGGGAGCAATCACAACTTCTGAAGACACTTACCCAG-3′;T85′-GTAAGCCTCACGACAGACAGTATTGTTGAACAGGTTAATGTTAGCACAGTGAGGGACATCTGGGTAAGTGTCTTCAGAAG-3′;T95′-GTCTGTCGTGAGGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACCTTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGTATCGATACATGTGG-3′;T105′-CCCCAAGACAAGATTCCCTGGAATTGTCCATTACAGATCAGTGGTCCACCAGAGTCACCACCACATGTATCGATACCTCC-3′;T115′-GGGAATCTTGTCTTGGGGAAGTGATCCATGTGCCGAACCACGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAGGTCTTTGATTACCTTC-3′;
T125′-GAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTGTTTCCAGCAATGATAGACTGAATCCATGGAAGGTAATCAAAGACCTTGG-3′。
以上述合成的12个片段T1-T12为模板,以5′端引物P15′-CAGCTCGAGAAAAGAGTCATTGGAG-3′;3′端引物P25′-CAGGAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTG-3′为引物进行PCR扩增。PCR反应体系12段模板(7.5uM)各0.1μL,P1(15uM)和P2(15uM)各1μL,dNTP(各2.5mM)5μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL,10×KOD buffer 5μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL。PCR反应程序94℃30s,51℃30s,72℃ 1min,25循环。最终获得PCR产物经测序表明,该片段具有序列序列表中序列2的核苷酸序列,将其命名为BG0。自序列表中序列2的第13-705位核苷酸为巴曲酶编码序列,编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列;自序列表中序列2的第1-12位核苷酸为KEX2蛋白酶识别序列的编码序列。
2)在酵母中表达BG0的重组载体pPIC9-BG0的构建(构建流程图如图1所示)将最终PCR产物BG0回收,经XhoI和EcoRI双酶切,再1%琼脂糖凝胶回收BG0片段,插入到pPIC9载体(购自Invetrogen公司)的XhoI和EcoRI酶识别位点之间,获得的重组质粒用LA(LB+100μg/ml Amp+)平板培养,挑选LA(LB+100μg/ml Amp+)平板上的单克隆,LA培养基液体培养,提取质粒,XhoI和EcoRI双酶切筛选含有BG0的克隆,用α-factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′测序引物分别从BG0的5′端和3′端进行测序检测,将检测表明含有BG0的pPIC9重组载体命名为pPIC9-BG0。pPIC9-BG0中含有表达载体pPIC9可以用来转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-。用质粒提取试剂盒大量制备上述表达质粒载体pPIC9-BG0,供转化酵母之需。
2、BG0利用宿主菌GS115/His-生产巴曲酶即其活性检测1)含有pPIC9-BG0重组菌的获得将pPIC9-BG0用Bgl II线性化,转化Pichia pastoris宿主菌GS115/His-,涂布组氨酸营养缺陷型培养基MD(1.34%YNB,4×10-5生物素,1%葡萄糖,2g/100mL琼脂)平板上得到重组GS115。用枪尖挑取少许在MD平板上生长出的酵母菌落,进行菌落PCR验证,以5′AOX1引物5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′;3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物。PCR反应体系重组GS115菌落为模板,5′AOX1(15uM)和3′AOX1(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,rTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10*rTaq buffer 2μL,ddH2O 15μL。PCR反应程序94℃30s,55℃30s,72℃1分钟,25循环。在重组过程中,如果pPIC9-BG0是插入到野生型GS115自身甲醇氧化酶基因5′AOX1或3′AOX1中,会形成Mut+(甲醇利用正常型),如果pPIC9-BG0是替代野生型GS115自身甲醇氧化酶基因,会形成Muts(甲醇利用慢型),所以,2200bp条带为野生型GS115自身甲醇氧化酶基因的PCR产物,750bp条带为BG0的PCR产物,即Mut+有两条带2200和750bp,Muts有一条带750bp,Mut+和Muts均是含有pPIC9-BG0的阳性克隆。共筛选了50个含有pPIC9-BG0的阳性克隆。部分鉴定结果如图3所示,图3中泳道1,3和4为Mut+(甲醇利用正常型)的菌落PCR结果泳道2和5为Muts(甲醇利用慢型)的菌落PCR结果,泳道GS115为未经转化的GS115/His-菌落PCR结果,泳道BG0为pPIC9-BG0的PCR结果,泳道marker为分子量标准。
2)巴曲酶的发酵生产巴曲酶的活性测定是利用巴曲酶能酶切纤维蛋白原,使含柠檬酸钠的人血浆凝结这一方法来进行的。具体方法为将上述PCR验证含有pPIC9-BG0的阳性克隆菌落分别接入装有3mL BMG(1L中含有100mM磷酸钾pH 6.0,1.34%YNB,4×10-5生物素,1%甘油)培养液的试管中,30℃培养24小时,用0.5%甲醇诱导48小时,发酵至OD600=25,参照从蛇毒中提取的巴曲酶的测活方法,用加入了柠檬酸钠的人标准血浆对发酵上清液中表达出的酶活性(表达量)进行测定。巴曲酶活性(表达量)是,37℃下,将100μl发酵至OD600=25酵母的发酵上清液加入到300μl含柠檬酸钠的人标准血浆中,混匀后,凝结所需的时间。50个含有pPIC9-BG0的克隆,巴曲酶活性(表达量)为10mins-30mins。
毕赤酵母可以在简单培养基中生长良好和表达有生物活性的重组巴曲酶。但在简单培养基中分泌的重组蛋白易发生降解,使产物的得率降低。实验中,在酵母基础培养基的基础上分别选取大豆蛋白胨和山梨醇进行了对比研究。具体方法为分别将上述筛出的巴曲酶表达量为10mins含有pPIC9-BG0的菌种(表型为Muts)上罐发酵,分别接种到3个装有200mLBMG培养基的1L摇瓶中增殖作为种子液,再转接至装有3L基础培养基(40g/L甘油,18g/LK2SO4,15g/L MgSO4.7H2O,4.13g/L KOH,0.9g/L CaSO4.2H2O,13.3mL/L H3PO4)的5L发酵罐中,在30℃,pH 5.0发酵,发酵20小时后,按0.8ml/min加入5%甘油100ml,饥饿30分钟,在其中两个发酵罐中,再加入3g大豆蛋白胨,其中一罐不加大豆蛋白胨,调pH至6.9,再在其中一个加入大豆蛋白胨的发酵罐按0.2ml/min加入甲醇(含0.2%体积山梨醇),其他两个发酵罐按0.2ml/min加入甲醇,诱导培养发酵,发酵每隔12小时取发酵上清液,用加入了柠檬酸钠的人标准血浆对发酵上清液中表达出的酶活性(表达量)进行测定。巴曲酶活性(表达量)是,37℃下,将100μl发酵上清液加入到300μl含柠檬酸钠的人标准血浆中,混匀后,凝结所需的时间。计算人血浆凝结速率(1/凝结所需时间),实验的结果如图4中A所示,结果表明,基础培养基中加入山梨醇和大豆蛋白胨发酵的蛋白人血浆凝结速率最高,表明,加入山梨醇有利于酵母产生更多的基础蛋白包括分子伴侣,糖基化酶等,促进了巴曲酶的组装和正确折叠,同时大豆蛋白胨延缓了巴曲酶的降解。图4中A中1为基础培养基,2为在基础培养基中加入大豆蛋白胨,3为在基础培养基中加入山梨醇和大豆蛋白胨。
将上述筛出的巴曲酶表达量为10mins含有pPIC9-BG0的菌种(表型为Muts)上罐发酵,接种到装有200mL BMG培养基的1L摇瓶中增殖作为种子液,再转接至装有3L基础培养基(40g/L甘油,18g/L K2SO4,15g/L MgSO4.7H2O,4.13g/L KOH,0.9g/L CaSO4.2H2O,13.3mL/LH3PO4)的5L发酵罐中,在30℃,pH 5.0发酵,发酵20小时后,按0.8ml/min加入5%甘油100ml,饥饿30分钟,再加入3g大豆蛋白胨,调pH至6.9,按0.2ml/min加入甲醇(含0.2%体积山梨醇)诱导培养90小时,此时发酵液的浓度为OD600=360,按照上述方法测得巴曲酶的表达量(酶活性)为30secs(图4中B,箭头示条带)。
3)发酵获得巴曲酶的纯化及其活性鉴定将上述发酵至浓度为OD600=360发酵液的发酵上清液加入2M硫酸铵预处理后,先经过预先用10mM PBS(pH6.0)和2M硫酸铵平衡过的装有疏水层析介质(STREAMLINETMPhenyl,Amersham Biosciences,货号17-5121-02)的层析柱,用含2M硫酸铵的50mM PBS(pH 6.0)梯度洗脱,收集活性峰,分析图谱如图5所示,图5中“-”标记为活性峰;将收集液进行SDS-PAGE电泳,结果如图9中泳道1所所示;将上述收集峰,再经过用10mM PBS(pH6.0)平衡过的装有阳离子交换介质(SPSepharoseTMFast Flow,Amersham Pharmacia Biotech AB,货号17-0729-01)的层析柱,用含0-0.5M氯化钠的10mM PBS(pH 6.0)梯度洗脱,收集活性峰,分析图谱如图6所示,图6中“-”标记为活性峰;将收集液进行SDS-PAGE电泳,结果如图9中泳道2所示;将上述阳离子交换介质收集峰,再经过用10mM Tris-HCl(pH7.4)平衡过的装有肝素琼脂糖凝胶FF(Heparin Sepharose FF,北京卓冠科技有限公司,货号CS-A13-01)的层析柱,用含0-0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH 6.0)梯度洗脱,收集活性峰,分析图谱如图7所示,图7中“-”标记为活性峰;将收集液进行SDS-PAGE电泳,结果如图9中泳道3所示;将上述肝素琼脂糖凝胶FF收集峰,再进行一步用凝胶过滤层析(SephacrylS-100,Pharmacia LKB Biotech AB,货号17-0612-01),然后用含0.15M NaCl的10mMTris-HCl(pH7.4)洗脱收集活性峰得到纯化的巴曲酶溶液,分析图谱如图8所示,图8中“-”标记为活性峰,结果表明该利用BG0生产巴曲酶的产量为10mg/L发酵液(OD600=360),即10mg/1013cfu。
用柠檬酸钠的人标准血浆进行巴曲酶活性检测,具体方法为37℃下,将100μl的发酵上清液加入到300μl含柠檬酸钠的人标准血浆中,混匀后,观察凝结所需的时间与相同条件下人凝血酶标准品相比较。一个巴曲酶单位(BU)相当于0.17 NIH凝血酶单位(NIHUnit,1 NIH凝血酶单位定义为在28±1.0℃条件下,15±0.5秒内凝结1ml人标准纤维蛋白原溶液的凝血酶量)。
结果表明,以人标准血浆为底物,巴曲酶活性为每毫升发酵液14巴曲酶单位(14BU/ml),上述纯化后的巴曲酶的比活性为1400BU/mg。
用牛纤维蛋白原进行巴曲酶活性检测,具体方法为37℃下,将100μl的发酵上清液加入到300μl 0.4%牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4,含0.15M NaCl)中,混匀后,观察凝结所需的时间与相同条件下人凝血酶标准品凝结时间相比较。一个巴曲酶单位相当于0.17 NIH凝血酶单位(NIH Unit,1 NIH凝血酶单位定义为在28±1.0℃条件下,15±0.5秒内凝结1ml人标准纤维蛋白原溶液的凝血酶量)。结果表明,以牛纤维蛋白原为底物巴曲酶的比活性为1800BU/mg(表1)将纯化的巴曲酶溶液进行SDS-PAGE电泳,结果如图9中泳道4所示。
将纯化的重组巴曲酶经去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs)水解后,进行SDS-PAGE电泳,结果如图9中泳道5所示。
上述图9中泳道M为蛋白低分子量标准;泳道1为STREAMLINETMPhenyl活性峰;泳道2为SP SepharoseTMFF活性峰;泳道3为Heparin Sepharose FF活性峰;泳道4为SephacrylS-100活性峰(纯化的巴曲酶蛋白);泳道5为去糖基化的巴曲酶蛋白。
甲醇酵母表达系统在表达的外源蛋白时,只要蛋白分子一级结构中有N-糖基化的可能位点,一般都会有N-型糖基化现象。巴曲酶氨基酸序列资料计算出该蛋白的分子量为25.5KD,上述纯化出的巴曲酶,SDS-PAGE电泳(图9)得出的表观分子量在30-33KD之间,巴曲酶蛋白的分子量质谱图如图10所示,表明BG0生产巴曲酶的平均分子量为30.55KD。如图9所示,巴曲酶经去糖基化酶PNGase F水解后蛋白的分子量约25.5KD,说明本发明BG0生产的巴曲酶具有糖基化现象。
对BG0生产巴曲酶蛋白测序,前五个氨基酸的序列为VIDGG,表明分泌表达的巴曲酶蛋白与预期的结果相一致。
3、巴曲酶蛋白的小鼠出血时间检测试验鼠为雄性小鼠(20-25g,每个处理10只),分别尾静脉注射上述纯化后的毕赤酵母表达的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.4μg蛋白/kg体重)或天然巴曲酶蛋白(2 NIHUnits/kg,8.8μg蛋白/kg体重)或按照5ml/kg体重的剂量注射10mmol/L PBS(pH 7.4)(对照),60分钟后,距尾尖2-3mm处横切,固定后浸入37℃生理盐水中1.5cm,记录出血时间。结果表明注射上述纯化后的毕赤酵母表达的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.4μg蛋白/kg体重)或天然巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.8μg蛋白/kg体重)或对照处理小鼠出血时间分别约为55秒、60秒、90秒;结果如图13中的1、2、3所示,结果表明,巴曲酶蛋白缩短了小鼠的出血时间,促进止血,其止血效果与天然的巴曲酶蛋白相当。图13中,1∶5ml/kg体重10mmol/L PBS(pH 7.4)(对照);2天然巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.8μg蛋白/kg体重);3酵母表达的巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg,8.4μg蛋白/kg体重)。
实施例2、含IL-2信号肽基因的巴曲酶基因(IBG0)的合成及其表达巴曲酶的效果检测。
1、含IL-2信号肽基因的巴曲酶基因(IBG0)的合成、测序以及表达载体的构建利用剪接重叠延伸PCR(SOE-PCR)将巴曲酶基因BG0为模板(序列表中序列2)与IL-2信号肽基因(自GENBANK号为NM_000586的5′端第295-354位核苷酸序列)进行连接,具体方法为以IL-2信号肽基因(自GENBANK号为NM_000586的5′端第295-354位核苷酸序列)为模板,用IL25引物5′-CTGGATCCACGATGTATAGGATGCAACTGCTG-3′和IL23引物5′-AGCGCTGTTGGTGACCAG-3′为引物进行PCR,PCR反应体系IL-2信号肽基因(7.5uM)0.1μL,IL25引物(15uM)和IL23引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10*KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL;PCR反应程序94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 1min,25循环;结果得到70bp的片段;以pPIC9-BG0为模板,以ILB引物5′-CTGGTCACCAACAGCGCTGTCATTGGAGGTGATGAATG-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR反应体系和PCR反应程序如上所述;结果得到800bp的片段。以上述IL25引物和IL23引物以及ILB引物和3′AOX1引物扩增得到的两个片段为模板,以IL25引物和3′AOX1引物为引物进行PCR,将IL-2信号肽基因与重组巴曲酶基因进行连接,得到带有IL-2信号肽的重组巴曲酶基因(IBGO),经测序表明,该片段具有序列表中序列4的核苷酸序列,编码序列表中序列3的氨基酸残基序列。序列表中序列4的第1-60位核苷酸编码IL-2信号肽序列,即序列表中序列3的第1-20位氨基酸残基序列,将IBGO经BamHI和EcoRI双酶切,再1%琼脂糖凝胶回收符合800bp的DNA片段,插入到pcDNA3.1载体的多克隆位点BamHI和EcoRI酶切位点之间,然后,用T7引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′和BGH引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′测序引物分别从BG基因的5′-端和3′-端进行测序鉴定,将经测序表明含有IBGO的重组载体命名为pcDNA3.1-IBGO。
2、含IL-2信号肽的巴曲酶基因(IBG0)在CHO细胞中的表达用LiofectamineTM2000的方法转化CHO细胞,将质粒pcDNA3.1-IBG0和LiofectamineTM2000在无血清DMEM培养基[每升1袋DMEM培养粉(4500mg葡萄糖,4.0mM L-谷氨酰胺,110mg丙酮酸钠),2.0g碳酸氢钠,青霉素和链霉素各100mg]中进行混合,并在室温中孵育20分钟;将混合物加入到已经铺好细胞的24孔板中,轻柔混匀,并置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养24小时后,将细胞的培养基更换成含10%DF(Defined FBS,特级胎牛血清)的DMEM培养基继续培养48小时;换用含750mg/L G418的含10%DF的DMEM培养基进行加压筛选,每2天换液一次,加压筛选14天。有限稀释法挑取单克隆。待加压后正常生长的细胞铺满24孔板时,其密度约106/孔,将其进行消化悬浮后分别用生长培养基分别稀释至10、20个细胞/ml,200μl/孔接种于96孔培养板,置37℃培养。10天后,即可见单细胞克隆生长,逐孔进行目的蛋白的检测。共筛选了96个可表达巴曲酶的克隆,表达量从90mins到180mins不等。
将上述表达量为90mins的单细胞克隆在无蛋白、无血清DMEM培养基[每升1袋DMEM培养粉(4500mg葡萄糖,4.0mM L-谷氨酰胺,110mg丙酮酸钠),2.0g碳酸氢钠,青霉素和链霉素各100mg]中扩大培养至1010细胞/L培养基,将培养上清液稀释1倍,按照实施例1的方法经过用10mM Tris-HCl(pH8.4)平衡过的肝素琼脂糖凝胶FF(HeparinSepharose FF,北京卓冠科技有限公司,货号CS-A13-01)的层析柱,用含0-0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH8.4)梯度洗脱,收集活性峰进行SDS-PAGE电泳,结果如图12中泳道1所示;将上述肝素琼脂糖凝胶FF收集峰,再经过用10mM Tris-HCl(pH8.4)平衡过的装有阴离子交换介质(Q SepharoseTMFast Flow,Pharmacia LKB Biotech AB,货号17-0510-01)的层析柱,用含0-0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH8.4)梯度洗脱,收集活性峰进行SDS-PAGE电泳,结果如图12中泳道2所示;
将上述阴离子交换介质收集峰,再进行一步用凝胶过滤层析(SephacrylS-100,Pharmacia LKB Biotech AB,货号17-0612-01),然后用含0.15M NaCl的10mMTris-HCl(pH7.4)洗脱,收集活性峰进行SDS-PAGE电泳(即纯化的巴曲酶溶液),结果如图12中泳道3所示。用柠檬酸钠的人标准血浆进行巴曲酶活性检测,具体方法为37℃下,将100μl的培养液上清液加入到300μl含柠檬酸钠的人标准血浆中,混匀后,观察凝结所需的时间。用牛纤维蛋白原进行巴曲酶活性检测,具体方法为37℃下,将100μl的培养液上清液加入到300μl 0.4%牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4,含0.15M NaCl)中,混匀后,观察凝结所需的时间与相同条件下人凝血酶标准品凝0结时间相比较。一个巴曲酶单位相当于0.17 NIH凝血酶单位(NIH Unit,1 NIH凝血酶单位定义为在28±1.0℃条件下,15±0.5秒内凝结1ml标准纤维蛋白原溶液的凝血酶量)。结果表明该利用CHO生产巴曲酶的产量为0.1mg/L培养液,即1010细胞/L培养液,其比活力检测结果如表1所示,表明CHO生产巴曲酶仍具有很高的比活力。
将纯化的CHO表达的重组巴曲酶经去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs)水解后,进行SDS-PAGE电泳,结果如图12中泳道4所示。
上述图12中泳道M为蛋白低分子量标准;泳道1为肝素琼脂糖凝胶FF活性峰;泳道2为Q SepharoseTMFast Flow活性峰;泳道3为SephacrylS-100活性峰(即纯化的巴曲酶蛋白);泳道4为去糖基化的巴曲酶蛋白。
CHO细胞表达系统在表达的外源蛋白时,只要蛋白分子一级结构中有N-糖基化的可能位点,一般都会有N-型糖基化现象。巴曲酶氨基酸序列资料计算出该蛋白的分子量为25.5KD,上述纯化出的巴曲酶,SDS-PAGE电泳(图12)得出的表观分子量在32-35KD之间。如图12所示,巴曲酶经去糖基化酶PNGase F水解后蛋白的分子量约25.5KD,说明本发明CHO细胞生产的巴曲酶具有糖基化现象。
3、CHO(pcDNA3.1-IBG0)表达的巴曲酶蛋白的小鼠出血时间检测试验鼠为雄性小鼠(体重20-25g,每个实验处理组10只),分别尾静脉注射上述纯化后的CHO表达的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.4μg蛋白/kg体重)或5ml/kg体重10mmol/LPBS(pH 7.4)(对照),60分钟后,距尾尖2-3mm处横切,固定后浸入37℃生理盐水中1.5cm,记录出血时间。结果表明注射上述纯化后的CHO表达的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.4μg蛋白/kg体重)或5ml/kg体重10mmol/L PBS(pH 7.4)(对照)小鼠出血时间分别约为51秒、90秒;结果如图13中1、4所示,结果表明,CHO表达的巴曲酶蛋白缩短了小鼠的出血时间,促进止血,其止血效果与酵母表达的巴曲酶蛋白以及天然的巴曲酶蛋白相当。图13中,1注射5ml/kg体重10mmol/L PBS(pH 7.4)(对照),4注射上述纯化后的CHO表达的巴曲酶蛋白。
实施例3、对BG0基因表达的巴曲酶蛋白的糖基化研究1、巴曲酶糖基化位点突变基因(BGm1,BGm2)的获得以及表达载体的构建(图2)采用定点突变技术对BG0基因分别进行突变将Asn(自序列1的氨基端第146位)突变为Gln(糖基化的motif是Asn-X-Thr),即将自序列表中序列2的5′端第448-450位核苷酸(AAC)突变为CAA;具体方法为以pPIC9-BG0为模板,用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M13引物5′-TTGGAACAGGTTAATGTTAGCACAG-3′(突变密码子)为引物进行PCR扩增,PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),a-Factor引物(各2.5mM)和M13引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10*KODbuffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL。PCR反应程序94℃ 30s,53℃30s,72℃1min,25循环;结果得到470bp的片段。用M15引物5′-CTGTGCTAACCTGTTCCAAAATACTGTCTGTCGTGAGG-3′(突变密码子)和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),M15引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O35μL。PCR反应程序94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 1min,25循环;结果得到340bp的片段。将上述得到的两个片段回收后,作为模板,以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR的程序为PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL。PCR反应程序94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 1min,25循环;结果得到800bp的片段,经测序表明,该片段具有将序列表中序列2的5′端第448-450位核苷酸(AAC)突变为CAA的核苷酸序列(即序列9),将其命名为BGm1。
将BGml片段用XhoI和EcoRI双酶切,插入到pPIC9载体的XhoI和EcoRI酶切位点之间,构建成含有BGml的pPIC9重组载体,将该重组载体命名为pPIC9-BGml。
将Asn(自序列1的氨基端第225位)突变为Gln,即将自序列表中序列2的5′端第685-687位核苷酸(AAC)突变为CAA;具体方法为以pPIC9-BG0为模板,用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M23引物5′-GGAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTGTTTCCAGCAATG-3′(突变密码子)为引物进行PCR,PCR的程序为PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),a-Factor引物(15uM)和M23引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL。PCR反应程序94℃30s,53℃30s,72℃1min,25循环;结果得到730bp的片段,经测序表明,该片段具有将序列表中序列2的5′端第685-687位核苷酸(AAC)突变为CAA的核苷酸序列(即序列10),将其命名为BGm2。
将上述PCR获得的BGm2片段经XhoI和EcoRI双酶切,插入到pPIC9载体的XhoI和EcoRI酶切位点之间,构建成含有BGm2的pPIC9重组载体,将鉴定正确的重组载体命名为pPIC9-BGm2。
将pPIC9-BGm1和pPIC9-BGm2用Bgl II线性化,按照实施例1步骤2所述的方法,转化毕赤酵母GS115/His-宿主菌,分别得到含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2重组菌,在30℃,MD平板培养2-3天,PCR鉴定(以PCR 5′AOX1引物和3′AOX1引物进行PCR扩增,反应体系25ul体系,少量重组GS115菌落为模板,5′AOX1引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,rTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10×rTaq buffer 2μL,ddH2O 15μL。PCR反应程序94℃30s,55℃30s,72℃1min,25循环。);鉴定阳性克隆,将PCR鉴定表明含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2的重组菌按照实施例的方法用1BMG培养和甲醇诱导,发酵表达突变去除了一个糖基化位点的巴曲酶,发酵96小时,OD600=360,将发酵上清液纯化,进行活性检测,检测方法同实施例1的步骤2。
结果表明含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2重组菌发酵得到的巴曲酶的表达量分别达到10mg/L发酵液(OD600=360),即10mg/1013cfu,比活性分别为500BU/mg,170BU/mg(表1);BG0在酵母GS115表达的巴曲酶分子量为30.55KD,总糖含量16.5%,比活约为1400BU/mg;从腹蛇属蛇毒液中提取的天然巴曲酶的分子量为34.9 KD,总糖含量27%,比活约为1350BU/mg,这表明不同生物的糖基化巴曲酶对其比活的影响不大。
说明突变去除任意一个BG0表达的巴曲酶蛋白中糖基化位点,巴曲酶的酶活力大大降低;说明BG0表达的巴曲酶蛋白中的这二个糖基化位点的存在及其糖基化对维持酶的活力是极其重要的。
实施例4、氨基酸突变对活性的影响1、Ala(自序列1的氨基端第59位)突变为Arg的巴曲酶及其编码基因的获得将Ala(自序列1的氨基端第59位)突变为Arg,即将自序列表中序列2的5′端第187-189位核苷酸(GCC)突变为CGA;具体方法为以pPIC9-BG0为模板,用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M33引物5′-TCGGACAGATCCGGCGTGCTTAC-3′(突变密码子)为引物进行PCR,PCR的程序为PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL,a-Factor引物和M33引物各0.5μL,dNTP 2μL,KOD DNA Polymerase 0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO42μL,ddH2O 35μL;PCR反应程序94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 1min,25循环;结果得到210bp的片段;用M35引物5′-GCACGCCGGATCTGTCCGAAACTACGATGAGGTCGTTAG-3′(突变密码子)和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR的程序为PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase 0.1μL(5U/μL),10×KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL;PCR反应程序94℃ 30s,53℃ 30s,72℃1min,25循环;结果得到690bp的片段。将上述PCR获得的两个片段回收后作为模板,以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR反应体系和PCR反应程序如上所述;结果得到800bp的片段,经过测序检测,检测表明该片段具有将自序列表中序列2的5′端第187-189位核苷酸(GCC)突变为CGA的核苷酸序列(即序列表中序列6),将片段命名为BGm3。BGm3编码具有序列表中序列5的氨基酸残基序列。
将BGm3经XhoI和EcoRI双酶切,插入到pPIC9载体的XhoI和EcoRI酶识别位点中,构建成含有BGm3的pPIC9重组载体,将鉴定正确的重组载体命名为pPIC9-BGm3。
2、Thr(自序列1的氨基端第128位)突变为Arg的巴曲酶及其编码基因的获得将Thr(自序列1的氨基端第128位)突变为Arg,即将自序列表中序列2的5′端第394-396位核苷酸(ACT)突变为CGA,具体方法为以pPIC9-BG0为模板,用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M43引物5′-TCGTGTGATTGCTCCCCATCC-3′(突变密码子)为引物进行PCR,PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),a-Factor引物(15uM)和M43(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL;PCR反应程序94℃30s,53℃30s,72℃ 1min,25循环;结果得到420bp的片段,用M45引物5′-ATGGGGAGCAATCACACGATCTGAAGACACTTACCCAG-3′(突变密码子)和3′AOX 1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL,M45和3′AOX1引物各0.5μL,dNTP 2μL,KOD DNA Polymerase 0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO42μL,ddH2O 35μL;PCR反应程序94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 1min,25循环;结果得到380bp的片段。将上述PCR获得的两个片段回收后作为模板,以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′为引物进行PCR,PCR反应体系pPIC9-BG0质粒0.1μL(0.04ug),a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL,dNTP(各2.5mM)2μL,KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL,10×KOD buffer 2μL,MgSO4(25mM)2μL,ddH2O 35μL;PCR反应程序94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 1min,25循环;结果得到800bp的片段,经过测序检测,检测表明该片段具有将自序列表中序列2的5′端第394-396位核苷酸(ACT)突变为CGA的核苷酸序列(即序列表中序列8),将片段命名为BGm4。BGm4编码具有序列表中序列7的氨基酸残基序列。
将BGm4经XhoI和EcoRI双酶切,插入到pPIC9载体的XhoI和EcoRI酶识别位点中,构建成含有BGm4的pPIC9重组载体,将鉴定正确的重组载体命名为pPIC9-BGm4。
3、BGm3和BGm4在毕赤酵母中的表达按照实施例1所述的方法,将pPIC9-BGm3或pPIC9-BGm4转化GS115/His-,然后进行PCR鉴定,将鉴定正确的阳性克隆进行发酵至OD600=360,并按照实施例1所述方法检测活性并纯化。用柠檬酸钠的人标准血浆进行巴曲酶活性检测,具体方法为37℃下,将100μl的发酵上清液加入到300μl含柠檬酸钠的人标准血浆中,混匀后,观察凝结所需的时间与相同条件下人凝血酶标准品凝结时间相比较。一个巴曲酶单位相当于0.17 NIH凝血酶单位(NIH Unit,1 NIH凝血酶单位定义为在28±1.0℃条件下,15±0.5秒内凝结1ml标准纤维蛋白原溶液的凝血酶量)。用牛纤维蛋白原进行巴曲酶活性检测,具体方法为37℃下,将100μl的发酵上清液加入到300μl 0.4%牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4,含0.15M NaCl)中,混匀后,观察凝结所需的时间与相同条件下人凝血酶标准品凝结时间相比较。一个巴曲酶单位相当于0.17 NIH凝血酶单位(NIH Unit,1 NIH凝血酶单位定义为在28±1.0℃条件下,15±0.5秒内凝结1ml人标准纤维蛋白原溶液的凝血酶量)。结果表明其中的BGm4基因表达的将自序列1的氨基端第128位T突变成R巴曲酶的表达量为达到10mg/L发酵液(OD600=360),即10mg/1013cfu,比活性为1050BU/mg;另一株的BGm3表达的将自序列1的氨基端第59位A突变成R巴曲酶的表达量为10mg/L发酵液(OD600=360),比活性为1330BU/mg。用牛纤维蛋白原为底物检测其活性和表达量37℃下,将100μl加入到300μl 0.4%牛纤维蛋白原(pH7.4,含0.9%NaCl)中,混匀后,记录凝结时间,结果表明BGm3表达的将自序列1的氨基端第59位A突变成R的巴曲酶改变了巴曲酶蛋白的底物特异性,对牛纤维蛋白原的活性高于BG0表达的巴曲酶,对人血浆的活性低于BG0表达的巴曲酶(表1)。
表1.巴曲酶突变体与BG0表达的巴曲酶比活力对比

4、BGm3和BGm4表达的巴曲酶蛋白的小鼠出血时间检测试验鼠为雄性小鼠(20-25g,n=10),分别尾静脉注射上述纯化后的毕赤酵母表达的BGm3巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg,8.8μg蛋白/kg体重)或BGm4巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg,11.2μg蛋白/kg体重)或5ml/kg体重10mmol/L PBS(pH 7.4)(对照),60分钟后,距尾尖2-3mm处横切,固定后浸入37℃生理盐水中1.5cm,记录出血时间。结果表明注射上述纯化后的毕赤酵母表达的BGm3巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg,8.8μg蛋白/kg体重)或BGm4巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg,11.2μg蛋白/kg体重)或5ml/kg体重10mmol/L PBS(pH 7.4) (对照)小鼠出血时间分别约为53秒、57秒、90秒;具体结果如图13中1、5、6所示。图13中,1注射5ml/kg体重10mmol/L PBS(pH 7.4)(对照);5.酵母表达的BG3巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,11.2μg蛋白/kg体重);6.酵母表达的BG4巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg,8.8μg蛋白/kg体重)。
序列表<160>10<210>1<211>231<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn20 25 30Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg35 40 45Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val50 55 60Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn65 70 75 80Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val85 90 95Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro100 105 110Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr115 120 125Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu130 135 140Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys145 150 155 160Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly
165 170 175Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu180 185 190Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr195 200 205Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly210 215 220Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro225 230<210>2<211>714<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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1.一种制备巴曲酶的专用基因,具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2;2)序列表中序列2经替换1-3个碱基,编码相同功能蛋白的核苷酸序列;3)在1)所述序列的5′端连接IL-2信号肽基因序列得到的核苷酸序列。4)在高严谨条件下可与1)、2)或3)所述序列的DNA序列杂交的核苷酸序列;
2.根据权利要求1所述的基因,其特征在于所述IL-2信号肽基因的核苷酸序列为自GENBANK号为NM_000586的5′端第295-354位核苷酸。
3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于所述编码基因具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2;2)序列表中序列43)序列表中序列6;4)序列表中序列8。
4.一种制备巴曲酶的方法,是将权利要求1-3任一所述的编码基因通过真核表达载体导入酵母菌或哺乳动物细胞系中表达,获得巴曲酶蛋白。
5.根据权利要求5所述的方法,其特征在于所述酵母菌为毕赤酵母,优选为毕赤酵母GS115/His-。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于所述哺乳动物细胞系为CHO细胞系。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于当所述编码基因导入酵母菌中时,所述真核表达载体为pPIC9;当所述编码基因导入哺乳动物细胞系中时,所述真核表达载体为pcDNA3.1。
8.根据权利要求4-7任一所述的方法,其特征在于所述方法还包括将表达获得的巴曲酶蛋白进行纯化。
9.权利要求4-8任一所述的方法制备的巴曲酶蛋白。
10.根据权利要求9所述的巴曲酶蛋白,其特征在于所述巴曲酶蛋白的氨基酸残基序列是1)序列表中序列1;2)序列1的氨基端第59位Ala突变为Arg的氨基酸序列;3)序列1的氨基端第128位Thr突变为Arg的氨基酸序列;4)序列1的氨基端连接IL-2信号肽的氨基酸序列;所述IL-2信号肽的氨基酸序列为自GENBANK号为NP_000577的氨基端第1-20位氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种巴曲酶及其制备方法与专用编码基因。该巴曲酶的编码基因,具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2;2)序列表中序列2经突变1-3个核苷酸;3)在1)所述序列的5′端连接IL-2信号肽基因序列得到的核苷酸序列。该制备巴曲酶的方法,是将权利要求1-3任一所述的编码基因通过真核表达载体导入酵母菌或哺乳动物细胞系中表达,获得巴曲酶蛋白。本发明的方法,成功地表达出了生物活性高的巴曲酶蛋白,纯化后酵母菌产量达到每毫升发酵液10μg/ml或14巴曲酶单位(14BU/ml),比活性为1400BU/mg。这一产量超过了其它已发表和报道的表达水平,适合规模化生产。
文档编号C12N1/19GK1986813SQ20061016534
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月18日 优先权日2006年12月18日
发明者李招发, 于学玲, 黄金路, 方宏清, 陈惠鹏 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
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