专利名称：使用属于嗜甲基菌属的细菌产生芳香族l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业，并具体涉及使用属于嗜甲基菌属(Methylophilus)的细菌产生芳香族L-氨基酸、特别是L-苯丙氨酸的方法，其中所述细菌已被修饰以增强编码涉及芳香族L-氨基酸流出(efflux)的蛋白质的基因的表达。
背景技术：
使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)等等的微生物通过发酵，来工业化生产L-氨基酸，例如L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。为了改善生产率，已使用了从天然分离的菌株或其人工突变体。已经公开了各种技术以通过使用重组DNA技术通过增强L-谷氨酸生物合成酶的活性来增加L-谷氨酸生产能力。
通过培育例如以上提到的那些微生物和改进生产方法，已经显著地增加了L-氨基酸的产生。然而，为了满足未来增加的需求，开发以更低成本生产L-氨基酸的更为有效的方法仍是所期望的。
为了通过甲醇的发酵生产氨基酸(甲醇是可以以低成本大量获得的原料)，通常已知的方法包括使用属于无色杆菌属(Achromobacter)或假单胞菌属(Pseudomonas)(日本专利公告(Kokoku)No.45-25273/1970)、精朊杆菌属(Protaminobacter)(日本专利申请公开(Kokai)号49-125590/1974)、精朊杆菌属(Protaminobacter)或甲烷单胞菌属(Methanomonas)(日本专利申请公开(Kokai)号50-25790/1975)、微环菌属(Microcyclus)(日本专利申请公开(Kokai)号52-18886/1977)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)(日本专利申请公开(Kokai)号4-91793/1992)、芽孢杆菌属(Bacillus)(日本专利申请公开(Kokai)号3-505284/1991)等等的微生物。
已经公开了通过培养属于嗜甲基菌属的细菌来生产L-苯丙氨酸的方法，所述细菌具有产生L-苯丙氨酸的能力并对苯丙氨酸类似物，例如DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和苯丙烯酸(cinnamic acid)有抗性(EP1134283B1)。
并且，已经公开了通过在培养基中培养具有生产L-氨基酸的能力的微生物，从而L-氨基酸积累在培养基中，并从培养基收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸，包括L-苯丙氨酸的方法，其中所述微生物是具有Entner-Doudoroff途径的甲醇利用细菌，在所述途径中6-磷酸葡糖酸脱水酶活性和/或2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性增强(美国专利申请20040142435A1)。
还公开了通过在含有甲醇作为主要碳源的液体培养基中培养已被修饰从而使ybjE基因的表达增强的微生物，来生产L-氨基酸，包括L-苯丙氨酸的方法(PCT申请WO05073390A2)。
已经公开了通过在培养基中培养埃希氏菌属(Escherichia)细菌来生产L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸或L-色氨酸的方法，所述细菌的L-氨基酸生产率已经通过提高仅由yddG基因编码的蛋白质的活性来提高(PCT申请WO03044192A1)。
但是目前，还没有为了使用属于嗜甲基菌属的甲醇利用细菌生产L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸，而增强yddG、yddL、yddK和yddJ基因表达的报道。
发明内容
本发明的目的包括增强芳香族L-氨基酸生产菌株的生产能力以及提供使用这些菌株生产芳香族L-氨基酸的方法。
通过发现在属于嗜甲基菌属的细菌中、特别是食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)中增强来自大肠杆菌(E.coli)的yddG、yddL、yddK和yddJ基因的表达，可以提高芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，优选L-苯丙氨酸的生产而实现了上述目的。
本发明提供了具有提高的生产芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，优选L-苯丙氨酸的能力的属于嗜甲基菌属的细菌。
本发明的目的是提供属于嗜甲基菌属的具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌，其中所述细菌已经被修饰以增强编码涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白质的基因的表达。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述基因是从属于埃希氏菌属的细菌获得的。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述基因包括yddG、yddL、yddK和yddJ。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述表达通过修饰控制所述基因表达的表达控制序列来增强。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述表达通过增加所述基因的拷贝数来增强。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌是食甲基嗜甲基菌。
本发明的进一步的目的是提供生产芳香族L-氨基酸的方法，其包括-在含有甲醇作为主要碳源的培养基中培养如上所述的细菌来产生和分泌所述芳香族L-氨基酸到培养基中，和-从培养基中收集所述L-氨基酸。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
以下详细描述本发明。
附图1显示了PCR扩增的DNA片段的结构，所述片段带有RBSfmd和编码用于全套苯丙氨酸流出泵(efflux pump)的来自大肠杆菌的yddG、yddL、yddK、yddJ基因。
附图2显示了带有yddG基因的缺失衍生物的结构。
优选的实施方式1.本发明的细菌本发明的细菌是属于嗜甲基菌属、具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌，其中所述细菌已经被修饰以增强涉及芳香族L-氨基酸流出的基因的表达。
在本发明中，“具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌”是指一种细菌，当在培养基中培养该细菌时它具有产生和分泌L-氨基酸到培养基中的能力。在此使用的术语“具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌”还指一种细菌，其相比于食甲基嗜甲基菌(M.methylotrophus)的野生型或亲本菌株，例如食甲基嗜甲基菌AS1，能够以更大的量产生L-氨基酸并引起L-氨基酸在培养基中积累，优选的是指该微生物能够以不低于0.05g/L、更优选不低于0.1g/L目标L-氨基酸的量在培养基中引起积累。术语“芳香族L-氨基酸”包括L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。L-苯丙氨酸是特别优选的。
嗜甲基菌属包括以下细菌Methylophilus freyburgensis、Methylophilusleisingeri、食甲基嗜甲基菌、Methylophilus quaylei等。具体地，可以使用和包括根据NCBI(国立生物技术信息中心)数据库中使用的分类学被分类为嗜甲基菌的那些。属于食甲基嗜甲基菌菌种的细菌是优选的。可用于本发明的嗜甲基菌属细菌的具体实例包括食甲基嗜甲基菌菌株AS1(NCIMB10515)等等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)可以从国家工业和海洋细菌保藏所(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)获得。
编码涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白质的基因包括编码能将芳香族L-氨基酸从细菌细胞中泵出(pump out)的蛋白质的基因。所述蛋白质的活性提高赋予了细菌对芳香族L-氨基酸的抗性，并且当这种细菌在培养基中培养时引起芳香族L-氨基酸在培养基中的积累增加。
用语“属于埃希氏菌属的细菌”是指根据微生物学领域的技术人员已知的分类法被分类为埃希氏菌属的细菌。如本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括，但不限于，大肠杆菌(大肠杆菌)。
可用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌没有特别的限制；然而，例如Neidhardt，F.C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的细菌被本发明包括。
用语“细菌已被修饰以增强基因的表达”是指细菌已经通过这样的方式被修饰，从而与未修饰的细菌相比，修饰的细菌含有的由所述基因编码的蛋白质的量增加。
用语“增强的基因表达”是指基因的表达水平比未修饰的菌株，例如野生型菌株更高。这种修饰的实例包括提高每个细胞表达的一个或多个基因的拷贝数，和/或通过修饰基因的相邻区域，包括控制基因表达的序列，例如启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点，等等，提高一个或多个基因的表达水平。
用语“编码涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白质的基因”是指，当培养已被修饰以增强基因表达的微生物时，由所述微生物分泌到培养基中的L-氨基酸的量多于从未修饰的菌株，例如亲本菌株或相应的野生型菌株分泌的L-氨基酸的量。通过测定培养基中L-氨基酸浓度的增加来观察L-氨基酸流出能力的增加。此外，也通过测定将该基因导入微生物中后L-氨基酸的细胞内浓度的下降来观察L-氨基酸流出能力的提高。与由未修饰的菌株输出的L-氨基酸的量相比较，从本发明的微生物分泌的L-氨基酸的量优选地增加10％或更多，更优选30％或更多，特别优选50％或更多。此外，也根据将基因导入微生物中后L-氨基酸的细胞内浓度的下降来观察L-氨基酸流出能力的提高。例如，可以如下测量L-氨基酸的细胞内浓度向含有微生物细胞的培养基中添加具有1.07的比重的适量硅油，通过离心从培养基中收集细胞，优选在12,000rpm离心2分钟。然后用22％高氯酸处理细胞(Ishizaki，A.等，Biotech.Techniq.，9，6，409(1995))。使用这样制备的细胞，可以测量L-氨基酸的细胞内浓度。此外，可以通过使用外翻的膜小泡(everted membranevesicle)测量放射性标记的L-氨基酸的细胞摄取来间接地检测“L-氨基酸流出能力”(Pittman，M.S.等，J.Biol.Chem.，277，51，49841-49849(2002))。例如，从其中导入了基因的细胞制备外翻的膜小泡。然后，向所述小泡添加提供驱动能量的ATP或其他底物，并测量放射性标记的L-氨基酸的细胞摄取。可选择地，通过测量活性细胞中非标记氨基酸和标记氨基酸之间的交换反应速率来检测“L-氨基酸输出能力”。
来自属于埃希氏菌属的细菌、涉及芳香族L-氨基酸流出的基因的实例包括来自大肠杆菌的yddG、yddL、yddK和yddJ基因。
yddG基因编码推定的跨膜YddG蛋白(同义词-B1473)。yddG基因(与核苷酸位置1544312到1545193互补的核苷酸；GenBank登记号NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO1)位于大肠杆菌K-12的染色体上yddL和fdnG基因之间。yddG基因的核苷酸序列和由yddG基因编码的YddG蛋白的氨基酸序列分别在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中示出。
yddL基因(同义词-B1472)编码推定的外膜孔蛋白(outer membrane porin)YddL蛋白。yddL基因(与核苷酸位置1543762到1544052互补的核苷酸；GenBank登记号NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO3)位于大肠杆菌K-12的染色体上yddG和yddK基因之间。yddL基因的核苷酸序列和由yddL基因编码的YddL蛋白的氨基酸序列分别在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中示出。
yddK基因(同义词-B1471)编码推定的糖蛋白YddK。yddK基因(与核苷酸位置1542782到1543738互补的核苷酸；GenBank登记号NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO5)位于大肠杆菌K-12的染色体上yddJ和yddL基因之间。yddK基因的核苷酸序列和由yddK基因编码的YddK蛋白的氨基酸序列分别在SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中示出。
yddJ基因(同义词-B1470)编码YddJ蛋白，其功能是未知的。yddJ基因(与核苷酸位置1542408到1542743互补的核苷酸；GenBank登记号NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO7)位于大肠杆菌K-12的染色体上narU和yddK基因之间。yddJ基因的核苷酸序列和由yddJ基因编码的YddJ蛋白的氨基酸序列分别在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中示出。
由于在埃希氏菌属菌株之间的DNA序列中可能有某些差异，将过量表达的上述基因不限于SEQ ID NO1、3、5和7中所示的核苷酸序列，还可包括与SEQ ID NO1、3、5和7中所示的那些类似的核苷酸序列。因此，由上述基因编码的蛋白变体可能与SEQ ID NO2、4、6和8所示的完整氨基酸序列有不低于80％、优选不低于90％、最优选不低于95％的相似性，只要维持了蛋白引起芳香族L-氨基酸流出的能力。
此外，以上描述的基因可以由变体代表，所述变体在严格条件下可以与SEQ ID NO1、3、5和7所示的核苷酸序列、或与基于这些核苷酸序列制备的探针杂交，条件是它们编码功能性蛋白。“严格条件”包括这样的条件，在这些条件下形成特异性杂合体，而不形成非特异性杂合体。例如，通过用含有1×SSC和0.1％SDS，优选的0.1×SSC和0.1％SDS的溶液在60℃洗涤一次，优选两次或三次作为严格条件的例子。取决于杂交条件，可以适当地选择探针的长度，并通常从100bp到1kbp变化。
基因表达的增强可以通过提高基因的拷贝数，和/或通过导入携带基因的载体来实现。嗜甲基菌细菌的载体，例如，是在嗜甲基菌细菌的细胞中可自主复制的质粒。嗜甲基菌细菌的载体的具体实例包括RSF1010和其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))、pMFY42(Gene，44，53(1990))、pRP301和pTB70(Nature，287，396，(1980))。
通过例如同源重组、Mu整合等的方法，通过将基因的多个拷贝导入细菌染色体中，可以实现基因表达的增强。例如，通过限制性切割(restrict)染色体DNA随后使用基于基因序列的探针进行Southern印迹，通过荧光原位杂交(FISH)，等等，可以估计表达的基因的拷贝数。
基因表达的增强也可以通过将一个或多个基因置于强启动子的控制下来实现，所述强启动子适合于在属于嗜甲基菌属的细菌中起作用。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的PR或PL启动子被称为强启动子。强启动子的使用可以与基因拷贝的扩增相结合。
可选择地，例如，通过将突变导入启动子中以提高位于该启动子下游的基因的转录水平，可以增强启动子的效果。此外，已知核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中的几个核苷酸的取代，特别是紧靠起始密码子上游的序列，可以深刻地影响mRNA可翻译性。例如，取决于起始密码子前三个核苷酸的性质，发现了表达水平方面20倍的变动(Gold等.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。早先，显示了rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置处的A对G的取代(ABSTRACTS of 17thInternational Congress of Biochemistry and MolecularBiology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society forBiochemistry and Molecular Biology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No.457)。因此，可以表明，rhtA23突变增强了rhtA基因表达，而作为结果，提高了对苏氨酸、高丝氨酸和一些其他转运出细胞的物质的抗性。
通过使用各种公知的方法，包括Northern印迹、定量RT-PCR等等，测量从基因转录的mRNA量，可以估计基因表达水平。通过公知的方法，包括SDS-PAGE继之以免疫印迹分析(Western印迹分析)等等，可以测量由基因编码的蛋白质的量。
制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择寡核苷酸作为引物等等的方法，是本领域技术人员公知的普通方法。例如，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，″Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述了这些方法。
L-氨基酸生产细菌通过增强编码细菌中涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白质的基因的表达，可以获得本发明的细菌，所述细菌固有地具有生产芳香族L-氨基酸的能力。可选择地，通过给细菌赋予生产芳香族L-氨基酸的能力，所述细菌已经具有编码涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白质的基因的增强表达，可以获得本发明的细菌。
生产芳香族氨基酸的能力可以是细菌的野生型菌株原本的能力，或是通过培育被赋予的能力。
在下文中，将说明给如上所述的亲本菌株赋予芳香族氨基酸生产能力的方法。
为了赋予芳香族氨基酸生产能力，可以使用通常用来培育属于埃希氏菌属或棒状杆菌细菌的L-氨基酸生产细菌的方法。例如，可以使用用于获得具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型(auxotroph)突变菌株、类似物抗性菌株或代谢调控突变菌株的方法，和用于产生具有增强的L-氨基酸生物合成酶活性的重组菌株的方法(″Amino Acid Fermentation″，the Japan ScientificSocieties Press[Gakkai Shuppan Center]，1st Edition，published on May 30，1986，pp.77-100)。当使用这些方法培育L-氨基酸生产细菌时，可以赋予一种或多种性质，包括营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变。
当产生重组菌株时，可以增强单个或多个L-氨基酸生物合成酶的活性。此外，赋予营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变性质的方法可以与增强L-氨基酸生物合成酶活性的方法组合。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型突变菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调控突变的菌株，可以通过使亲本或野生型菌株经过通常的诱变处理，例如X射线或紫外线照射、用例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的诱变试剂处理来获得。然后，可以从突变的菌株中选择具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型菌株、类似物抗性菌株或代谢调控突变菌株。
通过增强3-脱氧-D-arabinoheptulosonate-7-磷酸合酶(DAHP合成酶，EC2.5.1.54)(由aroG基因编码)、3-脱氢奎尼酸合酶(由aroB基因编码)、莽草酸激酶(由aroL基因编码)、分支酸变位酶(由aroA基因编码)、分支酸合酶(由aroC基因编码)的活性，可以获得具有生产芳香族氨基酸的能力的细菌(PCT申请WO02/38777)。
2.本发明的方法本发明的方法是通过在培养基中培养本发明的细菌以生产和分泌L-氨基酸到培养基中，并从所述培养基收集L-氨基酸来生产L-氨基酸的方法。
在本发明中，培养、收集和从培养基纯化L-氨基酸等等可以按照与使用细菌生产氨基酸的常规发酵方法类似的方式进行。
用于培养的培养基可以是合成的或天然培养基，只要该培养基包括碳源和氮源和矿物质，和如有必要，细菌生长所需的合适量的营养物。用于属于嗜甲基菌属的细菌的碳源包括Cl化合物，例如甲醇。如果甲醇被用作主要碳源，可以以低成本生产芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸。当甲醇被用作主要碳源时，它以0.001％到30％的量添加到培养基中。对于氮源，可以使用各种铵盐例如氨和硫酸铵，其他氮化合物例如胺，天然的氮源例如蛋白胨、大豆水解产物和消化的发酵微生物。作为矿物质，可以使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等等。作为维生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等等。
培养优选在有氧条件，例如摇动培养，和带通气的搅动培养，在20到40℃、优选的30到38℃温度下进行。培养物的pH值通常在5和9之间，优选在6.5和7.2之间。可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液来调整培养物的pH值。通常，1到5天的培养导致目标L-氨基酸在液体培养基中的积累。
培养之后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基除去固体例如细胞，然后可以通过离子交换、浓缩和/或结晶方法收集L-氨基酸。
实施例以下将参考下述非限制性实施例更具体地说明本发明。
实施例1.来自大肠杆菌的L-苯丙氨酸流出泵基因在食甲基嗜甲基菌菌株中的克隆、分析和应用。
已经报道了，当在培养基中培养细菌时，增强由来自大肠杆菌的yddG基因编码的蛋白质的活性增加了L-氨基酸例如L-苯丙氨酸或L-色氨酸通过大肠杆菌细菌的产生(PCT申请WO03044192A1)。
因此，推测yddG基因编码L-苯丙氨酸流出泵。
食甲基嗜甲基菌是用于L-苯丙氨酸流出基因的分析的很好的测试微生物，因为它在含有高L-苯丙氨酸浓度(2.0-5.0g/L)的培养基中不生长。而且活性的L-苯丙氨酸流出泵赋予了食甲基嗜甲基菌细菌对苯丙氨酸的抗性。
首先，通过PCR扩增来自大肠杆菌的单个yddG基因。使用两个合成引物P1(SEQ ID NO9)和P2(SEQ ID NO10)，用食甲基嗜甲基菌甲酰胺酶(fmd)基因的新的核糖体结合位点AGGAGA(Mills，J.等，Eur.J.Biochem.，251，p.45-53(1998))来扩增它。引物P1含有SmaI限制性位点和食甲基嗜甲基菌甲酰胺酶基因的RBS。引物P2含有KpnI限制性位点。使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板。
用SmaI和KpnI限制酶处理得到的扩增的DNA片段，并且连接到预先已用相同的限制酶处理的pTACTER2载体中Ptac启动子的控制下。得到的质粒称为pTYD6(pTACTER2-RBSfmd-yddGEco)。
通过导入Ptac启动子从pAYCTER3载体获得pTACTER2载体。为此，用HindIII和BamHI限制酶处理商业上可获得的Ptac启动子(Pharmacia，瑞典)，并连接到预先已用相同的限制酶处理的pAYCTER3载体中。
pAYCTER3载体是pAYC32的衍生物，pAYC32是一种在质粒RSF1010的基础上构建的中等拷贝数并且非常稳定的载体(Christoserdov A.Y.，Tsygankov Y.D，Broad-host range vectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid，Plasmid，1986，v.16，pp.161-167)。通过将来自pUC19质粒的多接头(polylinker)和强终止子rrnB引入pAYC32质粒中替换它的天然终止子，来获得pAYCTER3载体。在PCT申请WO03044192A1中描述了pAYCTER3载体的详细构建。
然后，将得到的pTYD6质粒从大肠杆菌菌株S17-1(McPheat，W.L.，FEMS Microbiology Letters，41，185-188(1987))移动到食甲基嗜甲基菌菌株AS1中。食甲基嗜甲基菌AS1菌株可以从国家工业和海洋细菌保藏所(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，英国)获得。
通过在含有2％甲醇的121培养基的试管中发酵来测试菌株AS1和得到的AS1/pTYD6(发酵的条件和测量L-苯丙氨酸浓度的方法参见以下的实施例2)。发酵数据在表1中示出。可以看出，当仅有来自大肠杆菌的yddG基因在质粒上扩增时，野生型食甲基嗜甲基菌菌株AS1不产生苯丙氨酸。
据推测，来自大肠杆菌的单个yddG基因仅编码内膜蛋白，其在食甲基嗜甲基菌菌株中不足以起到跨越内膜和外膜的输出者(exporter)的作用。因而，为了在食甲基嗜甲基菌细菌中形成多组分的苯丙氨酸流出泵，必需找到和克隆除yddG基因以外的来自大肠杆菌的其他基因。
分析了大肠杆菌基因组中位于yddG基因周围的基因，并发现几个下游的基因编码与其他细菌中的外膜蛋白(孔蛋白)同源的蛋白。这组大肠杆菌基因，yddG、yddL、yddK和yddJ(图1)，通过PCR进行扩增，克隆到pTACTER2中Ptac启动子和甲酰胺酶(fmd)基因的RBS的控制下，并转移到食甲基嗜甲基菌菌株AS1中。
为此，使用引物P1(SEQ ID NO9)和P3(SEQ ID NO11)通过PCR扩增这组基因，yddG、yddL、yddK和yddJ的组。引物P3含有SmaI限制性位点。
用SmaI限制酶处理得到的扩增的DNA片段，连接到预先已用相同的限制酶处理的pTACTER2载体中Ptac启动子和fmd基因的RBS的控制下。产生的质粒称为pTBG4(pAYCTER3-PtacEco-RBSfmd-yddGEco-yddLEco-yddKEco-yddJEco)。然后，将得到的pTBG4质粒从大肠杆菌菌株S17-1(McPheat，W.L，FEMS Microbiology Letters，41，185-188(1987))移动到食甲基嗜甲基菌菌株AS1中。
野生型食甲基嗜甲基菌菌株AS1对高浓度的L-苯丙氨酸敏感，并在含有1g/L或更多L-苯丙氨酸的培养基中不生长。L-苯丙氨酸抑制单个的DAHP合酶。这个特征有助于阐明编码在食甲基嗜甲基菌菌株中起作用的苯丙氨酸流出泵机制的整套蛋白的大肠杆菌基因。活性的大肠杆菌L-苯丙氨酸流出机制从食甲基嗜甲基菌输出L-苯丙氨酸，降低L-苯丙氨酸的内部浓度，并容许细菌在含有高浓度L-苯丙氨酸的培养基上生长。
测试了几个菌株对L-苯丙氨酸的抗性。它们是食甲基嗜甲基菌菌株AS1/pTBG4(pAYCTER3-PtacEco-RBSfmd-yddGEco-yddLEco-yddKEco-yddJEco)(克隆No.7、No.8、No.9)；AS1/pTYD6(pAYCTER3-PtacEco-RBSfmd-yddGEco)；AS1/pAYCTER3。在标准方案下进行苯丙氨酸敏感性/抗性实验。将所述菌株在液体培养基中生长过夜，然后稀释到105细胞/ml，并涂覆在含有1％甲醇、100mg/L氨苄青霉素和不同浓度的L-苯丙氨酸(g/L)的121-培养基琼脂平板上。72小时后分析菌落生长。实验的数据在表3中示出。
确定了只有带有克隆的来自大肠杆菌的四个yddG-yddL-yddK-yddJ基因的食甲基嗜甲基菌AS1/pTBG4菌株可以在含有高浓度例如5g/L、2.5g/L或1.2g/L苯丙氨酸的培养基中生长。
与对照菌株AS1/pAYCTER3类似，携带单个yddG基因的食甲基嗜甲基菌AS1/pTYD6菌株在含有高浓度苯丙氨酸(1.2、2.5、5g/L)的培养基中不生长。
此外，食甲基嗜甲基菌AS1/pTBG4菌株的克隆No.8在无L-苯丙氨酸的培养基中生长很差(泄漏生长(leaky growth))。这意味着活性的大肠杆菌苯丙氨酸流出系统(yddG-yddL-yddK-yddJ)实际地在食甲基嗜甲基菌菌株AS1中起作用，并且如果在没有L-苯丙氨酸的培养基中生长就产生泄漏营养缺陷型。
通过在含有2％甲醇的121培养基的试管内发酵，测试了菌株AS1和菌株AS1/pTBG4的三个克隆的L-苯丙氨酸产生(发酵条件和L-苯丙氨酸浓度的测量方法参见下文的参考实施例)。发酵的数据在表2中示出。可以看出，携带具有活性苯丙氨酸流出系统的质粒的野生型食甲基嗜甲基菌菌株AS1将0.06-0.11g/L的L-苯丙氨酸分泌到培养基中。
为了支持所有四种大肠杆菌基因都是食甲基嗜甲基菌中苯丙氨酸流出系统发挥正常功能所必需的这一论述，使用适合的限制酶构建了携带两个和三个苯丙氨酸流出基因的两种pTBG4缺失衍生物(图2)，并测试了携带所述衍生物的菌株AS1对L-苯丙氨酸的抗性和通过所述菌株的L-苯丙氨酸生产。
pTBG4质粒的HpaI-SmaI缺失衍生物，pBHPA2(pAYCTER3-Ptac-RBSfmd-yddGEco-yddLEco)仅具有两个大肠杆菌基因，且不赋予对L-苯丙氨酸的抗性。携带该衍生物的菌株AS1在含有3g/L的L-苯丙氨酸的培养基中不生长，且不向培养基分泌任何L-苯丙氨酸。这意味着L-苯丙氨酸流出机制是不完整的。
pTBG4质粒的HindIII缺失衍生物，pBHIN3(pAYCTER3-Ptac-RBSfmd-yddGEco-yddLEco-yddKEco)具有三个大肠杆菌基因。携带该衍生物的菌株AS1在含有3g/L L-苯丙氨酸的培养基中也不生长，而且不向培养基分泌任何L-苯丙氨酸。这个结果意味着所有四种大肠杆菌基因，yddG、yddL、yddK和yddJ，都是从食甲基嗜甲基菌菌株分泌L-苯丙氨酸所必需的。
实施例2.食甲基嗜甲基菌菌株的发酵过程和L-苯丙氨酸浓度的测量。
1.试管和摇瓶培养的培养基成分和过程食甲基嗜甲基菌菌株的培养在30℃在含有2％甲醇和3％碳酸钙的5ml121(Fe2，Fe3)培养基中在试管(18mm直径)内，在摇动器上以240rpm进行48-72小时。
121(Fe2，Fe3)培养基的成分(1升)K2HPO4×3H2O1.57gKH2PO40.62g(NH4)2SO43gNaCl0.1gMgSO4×7H2O 0.2gCaCl20.025gEDTA-Na25mgFeSO4×7H2O 3mgFeCl3×6H2O 10mgMnSO4×5H2O 0.01mgZnSO4×7H2O 0.07mgNa2MoO4×2H2O 0.01mgH3BO30.01mgCoCl2×6H2O 0.005mgCuSO4×5H2O 0.005mg甲醇20ml(过滤器灭菌)CaCO330gpH 7.0。发酵试管中培养基的初始体积5ml。
种子培养物在5ml没有CaCO3的相同液体培养基中在试管内在摇动器上以240rpm在30℃生长24小时。接种量-10％。温度维持在30℃。搅动-摇动器上240rpm。
2.L-苯丙氨酸浓度的测量。
L-苯丙氨酸浓度通过由例如McCaman，M.W.和Robins，E.描述的荧光测定法(J.Lab.Clin.Med.，59，No.5，885-890(1962))来测量。在存在铜离子的情况下苯丙氨酸与茚三酮(ninhydrin)反应形成高度荧光复合物。通过在反应混合物中包括L-Leu-L-Ala二肽，大大地增强荧光。在荧光计中测量的荧光强度与苯丙氨酸浓度成比例。
尽管已经参考本发明的优选的实施方式详细地描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是可以进行各种变化和采用同等物，而不背离本发明的范围。所有在此引述的参考文献通过引用来并入作为本申请的一部分。
表1.
表2
+/-是泄漏生长微型菌落；+是正常生长；++是良好生长表3
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto-Genetika Research Institute)<120>使用属于嗜甲基菌属的细菌产生芳香族L-氨基酸的方法<130>yddG-fmd<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>882<212>DNA<213>大肠杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(882)<223>
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<221>CDS<222>(1)..(957)<223>
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<221>CDS<222>(1)..(336)<223>
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1.属于嗜甲基菌属的细菌，其具有生产芳香族L-氨基酸的能力，其中所述细菌已经被修饰以增强编码一种或多种蛋白质的基因的表达，所述蛋白质与芳香族L-氨基酸流出有关。
2.根据权利要求1的细菌，其中所述基因是从埃希氏菌属细菌获得的。
3.根据权利要求2的细菌，其中所述基因包括yddG、yddL、yddK和yddJ。
4.根据权利要求1的细菌，其中所述表达通过修饰控制所述基因表达的表达控制序列来增强。
5.根据权利要求1的细菌，其中所述表达通过增加所述基因的拷贝数来增强。
6.根据权利要求1的细菌，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
7.根据权利要求6的细菌，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
8.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是食甲基嗜甲基菌。
9.生产芳香族L-氨基酸的方法，其包括-在含有甲醇作为主要碳源的培养基中培养根据权利要求1到8中任一项的细菌以产生和分泌所述芳香族L-氨基酸到培养基中，和-从培养基中收集所述L-氨基酸。
10.根据权利要求9的方法，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
11.根据权利要求10的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
全文摘要
本发明提供了使用属于嗜甲基菌属的细菌生产芳香族L－氨基酸的方法，其中所述细菌被修饰以增强涉及芳香族L－氨基酸流出的基因，特别是来自大肠杆菌的yddG、yddL、yddK和yddJ基因的表达。
文档编号C12R1/185GK1990856SQ20061017212
公开日2007年7月4日 申请日期2006年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者伊里那·L·托克马科瓦, 纳塔尔亚·V·戈尔什科瓦, 埃琳娜·G·阿巴拉基纳, 尤尔吉斯·A·V·约曼塔斯 申请人:味之素株式会社