专利名称：：类黄酮的酶促脱甲基化的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物雌激素和它们的制备以及包括这样植物雌激素的药物化合物和膳食补充剂。
背景技术：
：数世纪以来啤酒花(/^mw/w/w;^/m丄.)已经被用作啤酒酿造的主要原料，提供啤酒的苦味和风味。近几年，该植物作为异戊二烯基类黄酮的一种来源越来越受到关注，异戊二烯基类黄酮是一种含有附着于苯酚环之一上的非极性异戊二烯基侧链的类黄酮亚类。这些存在于蛇麻素腺中，发现于雌植株上啤酒花穗内的小苞片基部。这些异戊二烯基类黄酮中，两个查耳酮(黄腐酚(X)和去甲基黄腐酚(DMX))和三个黄垸酮(异黄腐酚(IX)，8-异戊二烯基柚皮素(8-PN)和6-异戊二烯基柚皮素(6-PN))图2)，现在因其有潜在的促进健康的特性而更受关注。X已被确定作为一种强的癌症化学保护剂，而已被证明8-PN是迄今为止分离的最有效的植物雌激素之一，具有比已知的大豆植物雌激素显著更高的活性。8-PN己被证明在体内表现雌激素的活性，预防大鼠骨丢失，阻止血管生成和转移以及显示出抗雄性素活性。X作为一种存在于雌啤酒花穗中的主要异戊二烯基査耳酮浓度高达1%(w/w)，而DMX则以较低的浓度存在(DeKeukeleire等，(2003)J.ofAgric.andFoodChem.51，4436-4441)。不同的啤酒花品种间X/DMX的比率是不同的。通过异构化，X被转化成IX以及DMX被转变为8-PN和6-PN。几十年前已认识到啤酒花的雌激素样作用。常报道，用雌啤酒花果沐浴可用于治疗妇科紊乱和妇科紊乱和月经不调。在1999年，Milligan等[J.CHn.Endocrinol.Metab.84，2249-2252]在啤酒花中鉴定了一种新的植物雌激素，8-异戊二烯基柚皮素。尽管它比173-雌二醇更少(<1%)，它是迄今为止鉴定的最有效的植物雌激素之一，具有比其他植物雌激素如大豆源的化合物染料木素和大豆黄酮显著更高的活性。现在问题是，饮食和/或环境接触植物雌激素能否产生健康危险如内分泌干扰。就啤酒花异戊二烯基类黄酮而言，啤酒是主要的饮食源。据计算，2001年美国每人每天大约平均消耗225ml啤酒(USDA，2003)。假如消费的是该量的美国主流的贮陈啤酒/比尔森啤酒(500-1000ug异戊二烯基类黄酮/1啤酒)，日吸收异戊二烯基类黄酮的量将是大约0.14mg。然而，啤酒的检测浓度(和因此的平均摄取量)强烈地取决于酿造过程，浓啤酒含有高达4mg异戊二烯基类黄酮/1。尽管X是啤酒花中主要的异戊二烯基类黄酮(干重的0.1-1%)，其大部分在持续地煮沸过程中被热异构化转化成IX。因此IX是啤酒中主要的异戊二烯基类黄酮并且其浓度从500yg/l(贮陈啤酒/比尔森啤酒)直到4mg/l(浓啤酒)。类似地，DMX被转变为8-PN，导致啤酒中的终浓度高达100wg8-PN/L。但是尽管8-PN具有高的活性，啤酒中总雌激素样活性仍然比体内有害活性浓度(100mg/l)低500至1000倍。(Milligan等，(2002)R印roduction123,235-242)。而且，现在许多啤酒是用啤酒花提取物制造而不是整个啤酒花，产生较低浓度的8-PN或者根本没有8-PN。因此，基于现有的知识人们普遍认为，适度的啤酒消费没有植物雌激素的不利健康影响。另一方面，现在许多数据显示主动摄取植物雌激素对健康可能有益处(Magee&RowIand(2004)Br.J.Nutr.91，513-531)。除啤酒之外，基于啤酒花的膳食补充剂也被销售，声称有增大乳房和降低热潮红的功效。植物雌激素的总体健康影响潜在地源自于许多个别的植物化学物质与多种植物化学物质的组合作用并且也许是助剂或干扰剂作用。到目前为止，在人类饮食中仅仅异黄酮和木酚素被认为是相关的植物雌激素，特别是因为啤酒中8-PN的浓度对于正面的或负面的健康影响来说均被认为是太低了几个专利出版物描述了饮食类黄酮的有益健康影响，例如使用IX预防骨密度下降(W004089359)，药物中使用啤酒花提取物具有雌激素样特性(W002085393)，以及食品中使用IX或X声称具有消炎的或耐老化特性(专利WO03090555)。而且，也建议在用于皮表的化妆品中使用8-PN(CA2426467)。为了在体内达到在体外所声称的功效，食用类黄酮需要从内脏吸收并且无变化的到达耙部位。一般而言，单体类黄酮不修饰地通过胃进入小肠，在此处从内脏中吸收进入肠系膜循环。体外研究显示了X(Yilmazer等(2001a)FEBSLett.491，252-256)和8-PN(Nikolic等(2004)DrugMetabolismandDisposition32，272-279)吸收后大规模的肝脏生物转化。然而，小肠中饮食多酚的吸收程度相当有限(10-20%)，因此意味着类黄酮的大部分到达了结肠。一种8-PN的无异戊二烯化类似物，柚皮素(naringenin)在肠管中显示增强的微生物所引起的生物转化，包括环破裂和脱羟基作用(Rechner等，(2004)FreeRadic.Biol.Med.36，212-225)，随后被吸收并经尿排泄掉。很少知道关于异戊二烯基类黄酮的肠转化。Nookandeh等(2004)Phytochemistry65，561-570，用X以1000mg/kg体重的剂量饲喂大鼠并且从粪便分离出22种代谢产物。然而，回收的类黄酮大部分(89%)是无变化的X。剩下部分由少量的不同代谢产物组成，包括一些IX。Avula等(2004)[J.Chromatogr.Sci.42:378-382]，用大鼠进行了一个类似试验并检测到大量的无变化X，其数量仅次于未确认的代谢产物。Coldham等(2002)FoodAdditContam.19:1138-1147认为IX可能作为一种前雌激素。这种设想基于肝脏的大规模生物转化能力，包括脱甲基化。然而，IX曝露于肝微体没有引起雌激素样活性的增加，据此推断不会产生8-PN。相比之下，Nicolic等描述了肝微体能够使IX脱甲基，但不会使X脱甲基(Nikolic等(2005)J.ofMassSpectrom.40，289-299)。然而已表明，除了脱甲基化外，微粒体也修饰了异戊二烯基侧链，最后产生多种轻度降解产物。Schaefer等(2003)(J.SteroidBiochem.Mol.Biol.84，359-360)，两个测试者口服IX后从尿中鉴定出低水平的8-PN并且由肝脏的脱甲基化促成的。除了肝脏，人体内结肠也是重要的转化场所。人类结肠含有1012个微生物/cm3(大约400个不同种)，具有巨大的催化和水解潜力。这些微生物群落在植物雌激素通常代谢中的重要性已被清楚地证实。Wang等(2000)Chem.Pharm.Bull.48，1606-1610鉴定了两种转化木酚素的细菌并且Decroos等(2005)Arch.Microbiol.183，45-55，最近分离一种微生物聚生体能够将植物雌激素大豆黄酮转化为牛尿酚。而且，几种大肠菌因为具有e-葡糖苷酶，被揭示能够增强植物雌激素的生物可用性，该酶对于植物雌激素糖苷的水解是需要的(Rowland等(2003)Br.J.Nutr89，S45-S58)。因此，对于植物雌激素生物可用性，内脏的微生物群被认为是重要的因素(Tumer等(2003)Nutr.Rev.61，204-213)。因为在雌啤酒花穗中只有精油和a-酸作为重要的啤酒成分具有经济利益，现已形成的啤酒花不同提取方法目的在于仅仅具体地提取这些化合物。一方面，C02是当前啤酒花提取物生产最为接受的溶剂(Palmer&Ting(1995)FoodChem.52，345-352)。与使用常规的有机溶剂(乙醇，己垸，甲醇，或二氯甲垸)的步骤相比较，二氧化碳提取提供了更好的可选择的提取物用于啤酒生产，作为全啤酒花或颗粒酒花的替代。C02提取形成了大量进一步衍化和纯化产品的基础，如异-a-酸类和还原的衍生物。另一方法用于更进一步纯化C02提取物，通过去除不必要的异戊二烯基类黄酮，公开于美国专利US3794744。另一方面，已开发不同的方法具体地回收和纯化异戊二烯基类黄酮(主要为X)。这些提取法的实例公开于美国专利4121040和德国专利DE19939350。因为利用这些方法能够容易地回收黄腐酚，很少有兴趣去开发一套方法用于化学合成X。然而，由于8-PN以低浓度存在于啤酒花穗中，更难从天然提取物回收，因此，通过市场上可买到的柚皮素异戊二烯化来生产8-PN的合成策略已形成。首先，通过低产量的非选择性直接的柚皮素的C-异戊二烯化或者从根皮乙酰苯开始，来生产8-PN。通过铕(lll)-催化的Claisen重排作用实现有效的小规模化学合成(Gester等(2001)Tetrahedron57，1015-1018)。最近，基于这种方法的工业规模化生产已经描述在欧洲专利EP1524269中。'尽管啤酒花和啤酒花提取物有广泛的工业用途，没有有效的方法用于生产有生物活性的异戊二烯化植物雌激素如来自天然来源的8-PN。
发明内容本发明概述本发明的一个目的是提供一种从可得自自然资源的5-垸氧基类黄酮生产具有生物活性的异戊二烯化植物雌激素如8-PN的有效方法，以及采用这样的生物活性异戊二烯化植物雌激素的药物化合物和膳食补充剂。在第一个方面，本发明提供了具有5-垸氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-查耳酮-转移酶(6'-AO-CT)活性的组合物。更特别地，本发明提供了具有5-甲氧基-类黄酮-甲基转移酶(5-MO-FMT)和/或6'-甲氧基-査耳酮-甲基转移酶(6'-MO-CMT)活性的组合物。本发明更进一步的实施方式涉及能够使异戊二烯化5-烷氧基-类黄酮和/或异戊二烯化6'-垸氧基-查耳酮脱垸基化的组合物。本发明的一个具体实施方式提供能够使6'-烷氧基查耳酮黄腐酚(X)和/或5-烷氧基-类黄酮异黄腐酚(IX)脱垸基化的组合物。本发明的组合物因此能够生产生物活性植物雌激素，尤其是异戊二烯化植物雌激素，尤其是8-PN。根据一个具体实施方式，具有5-垸氧基-类黄酮-和/或6'-垸氧基-查耳酮-脱烷基化活性的组合物是这样的组合物，其包含或来源于非动物源的材料，更特别的是包含或来源于原核生物的材料。更特别地，本发明的组合物包含细菌细胞，或这种细菌细胞的提取物、上清液或其他纯化或半纯化的材料。本发明的具体实施方式涉及一种组合物，其包含一种同型乙酸菌，如真杆菌属(五"Z^"e〃'"msp)或消化链球菌属(尸e;^asfre尸tococcwssp.)，尤其是迟纟爱真木干菌(五w6a"en'w77/〖was^m)或产生f肖"[七链球菌(尸印to^"e;fococci^prao^"":y)，或者来自上述菌的提取物、上清液或其他纯化的或半纯化的材料。本发明另一具体实施方式包括细菌菌株和或包含细胞、它们的提取物、上清液或其他纯化或半纯化物质的组合物，其中，5-烷氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-査耳酮-转移酶(6'-AO-CT)活性的产生被富化，更特别地，是通过用5-烷氧基类黄酮，例如5-甲氧基异戊二烯基类黄酮重复培养富化的。本发明的另一具体实施方式包含组合物，其包含来自于同型乙酸菌菌株、特别是真杆菌属、尤其是迟缓真杆菌(五Wac^"/"w//moram)的5-甲氧基(异戊二烯基)类黄酮甲基转移酶和/或6'-甲氧基(异戊二烯基)查耳酮甲基转移酶。本发明的组合物一个具体实施方式包含富化的5-烷氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-查耳酮-转移酶(6，-AO-CT)活性，来源于其保藏于比利时微生物协作保藏中心(BCCM)BCCM/LMG中心的保藏编号LMGP-23546)的迟缓真杆菌(E^6a"m',/mos画)菌株，。本发明还提供生产植物雌激素的方法，包括5-垸氧基-类黄酮上5位的脱垸基化或者6'-烷氧基查耳酮上6'位的脱烷基化，其特征在于，该方法是利用非动物的真核生物或原核生物材料体外进行的。在一个具体实施方式中，该方法用于生产8-PN。根据一个具体实施方式，本发明的方法中脱垸基化是脱甲基化并且用非动物的真核生物或原核生物材料进行。更特别地是，所述非动物材料是细菌菌株或细菌菌株材料，最特别地是同型乙酸菌，或者它们的纯化或部分纯化的组份(fraction)或成分(component),例如部分纯化或分离的酶，最特别地是，所述细菌为同型乙酸菌。一个具体实施方式涉及用源自于真杆菌属或消化链球菌属如迟缓真杆菌(五^fl"en'^7//mcw^z)的材料进行脱烷基化。本发明的方法的具体实施方式还包括异戊二烯化5'-烷氧基-类黄酮和/或异戊二烯化6'-烷氧基-查耳酮的脱烷基化方法。根据另一具体实施方式，本发明提供用于植物来源，更具体的说是来源于啤酒花的5-烷氧基-类黄酮和/或6-垸氧基-査耳酮脱烷基化的方法。根据具体实施方式，提供的方法用于6'-烷氧基查耳酮、黄腐酚和/或5-垸氧基-类黄酮，异黄腐酚的脱烷基化。本发明还包括细菌细胞系用于5-烷氧基-类黄酮和/或6'-烷氧基-查耳酮体外脱垸基化的用途，更特别地是5-甲氧基-类黄酮和/或6'-甲氧基查耳酮的脱甲基化D更具体地，所述细菌细胞是来自于同型乙酸菌株的细胞，如来自迟缓真杆菌(五"^"en、M//mowm)的细胞。一个更进一步的具体实施方式是细菌细胞的应用，其中5-烷氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-查耳酮-转移酶(6'-AO-CT)活性的产生被提高，例如通过用5-垸氧基类黄酮如5-甲氧基异戊二烯基类黄酮重复培养来提高。本发明还提供体外生产植物雌激素的方法，包括以下步骤a)提供一种细菌菌株或其提取物，更特别地是，所述细菌为同型乙酸菌，和b)含有5-垸氧基-类黄酮(更特别地5-甲氧基-类黄酮)和域6，-烷氧基-査耳酮(更特别地6，-甲氧基-查耳酮)的组合物与该细菌菌株或其提取物接触，由所述细菌菌株或其提取物将5-烷氧基-类黄酮和/或6'-垸氧基-查耳酮脱垸基化。任选的，该方法还可以包括鉴定和/或纯化产出的脱垸基类黄酮。这些方法的具体实施方式包括提供细菌菌株提取物，还进一步包括富化和纯化(任选)细菌提取物的步骤，目的是具有富化的或纯化的5-烷氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)活性和/或富化的或纯化的6'-烷氧基-查耳酮-转移酶(6'-AO-CT)活性。在以上所述之外或与之不同，本发明的方法包括对细菌菌株的5-AO-FT和/或6'-AO-CT活性的产生的进行富化的步骤，通过用5-烷氧基类黄酮如5-甲氧基异戊二烯基类黄酮重复培养来实现。本发明还提供了来自于迟缓真杆菌(fiWa"en'wm/!7nowm)的5-甲氧基-异戊二烯基类黄酮甲基转移酶或6'-甲氧基-异戊二烯基查耳酮甲基转移酶。本发明还提供了药物组合物和膳食补充剂，其中包含了经本发明方法获得的生物活性植物雌激素。本发明还提供药物组合物和食品添加剂，其包含两种组分用于同时或依次施用，其中第一组分包含具有5-烷氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-烷氧基-査耳酮-转移酶(6'-AO-CT)活性的同型乙酸菌或其提取物或组分，第二组分包含5-垸氧基类黄酮或6'-烷氧基查耳酮或它们的源，如啤酒花提取物。根据具体实施方式，所述类黄酮是6'-烷氧基查耳酮黄腐酚或5-垸氧基-类黄酮异黄腐酚。更进一步具体实施方式涉及本发明的药物组合物和膳食补充剂，其中同型乙酸菌是迟缓真杆菌(五w^"en'"w/fmcwz^)。任选地，本发明的药物组合物中的细菌是以结肠特异性给药制剂的方式提供。本发明公开了IX能通过非动物的活体生物如人类或动物特别是脊椎动物或哺乳动物的肠道细菌脱甲基化成为8-PN，IX因此可作为雌激素前体。本发明进一步鉴定了能够将IX转化为8-PN的微生物(例如用这样微生物培养物体外生产8-PN)。另外，本发明提供了选择能够从IX大量生产8-PN的其它菌株的方法。本发明还证明了在体内通过微生物群体对甲基化类黄酮植物雌激素前体的转化是很不同的并且依赖于个体内微生物群体的组成(个体间或相同个体内不同时间都不同)。这可能对个体受到植物雌激素作用具有重要影响。实际上，在啤酒花提取物中、啤酒中以及食品或膳食补充剂中，雌激素活性较低的IX的含量比8-PN的浓度高得多通过提供生产活化的植物雌激素(体外或体内)的方法，本发明还为当前的食用啤酒花提取物提供了有益的替代物或补充物。通过体外预转化或体内/原位脱烷基化能够控制甲基化类黄酮植物雌激素前体(例如ix)转化为它们的活性脱甲基化合物的不可预见的产率。这些使得在每个个体内对与活性组分的接触进行控制成为可能，尽管肠内微生物群落存在个体间差异，或者，使得将这些差异特别将虑在内成为可能。这些图用来图解本发明，但不应被认为将本发明限制到所示实施方式。图l:类黄酮的一般结构。图2:啤酒花异戊二烯基类黄酮的结构和它们的转化。图3:粪便培养物(C)与IX共培养(培养0和8天)后的雌激素应答(平均值+标准方差)0=3)。图4:三天后，人类粪便培养物(E-L)将IX(25mg/l)转化为8-PN[平均值+标准方差平均值(11=3)]。图5:来自于51个不同人个体的肠到菌将异黄腐酚(IX)转化为8-异戊二烯基柚皮素(8-PN)。所述个体按照8-PN产量从低到高排列，结果表示为IX转化成8-PN的平均％(±标准方差)(11=3)。图6:尸.,o^"m将IX(25mg/l)转化为8-PN(三个培养物lnc1，lnc2和Inc3)。对IX的消散(实心符号)和8-PN产生(空心符号)进行为期B天的监测。图7:向粪便培养物B中添加￡.//mowm后IX向8-PN的转化(￡.//woswm培养物的百分比从0%(纯粪便样品)至100。/。(无外来菌的E.limosum培养物))(n-3)图8:在人类肠微生物生态系统模拟器中，在允许甲基化甲基类黄酮活化的条件下，IX向8-PN的转化。TWINSHIME中的PF+月空。图9:在人类肠微生物生态系统模拟器中，在不允许活化甲基化甲基类黄酮的条件下，IX向8-PN的转化。具体实施方式定义在整个本申请中，使用以下缩写X:黄腐酚；DMX:去甲基黄腐酚；IX:异黄腐酚；8-PN:8-异戊二烯基柚皮素；6-PN:6-异戊二烯基柚皮素5-AO-FT:5-院氧基类黄酮烷基转移酶5-MO-FMT:5-甲氧基-类黄酮甲基转移酶6'-AO-CT:6'-烷氧基查耳酮烷基转移酶6'-MO-CMT:6'-甲氧基-查耳酮甲基转移酶术语"类黄酮"是指一组基于C,5骨架的有机分子，其具有一个色原垸环(chromane)，该环的2、3或4位上带有第二个苯环B(图1A)。图1A表示在类黄酮上取代基的惯用编号，本发明亦照此编号。类黄酮的亚组是查耳酮、黄院酮、黄酮、黄垸醇和类异黄酮。查耳酮(图1B)是黄垸酮(图1C)的异构体。图1B和2显示査耳酮上原子的惯用编号。黄烷酮与黄酮(图1E)的区别在于它们没有2、3位的双键。黄酮(图1E)属于类黄酮，与黄垸醇(图1E)相比没有3-0H基团。类异黄酮属于类黄酮，其中苯环B位于3位(图1F)。所有这些亚组都具有一个4位上的酮官能团。本发明中，术语"异戊二烯基类黄酮"涉及这样一类类黄酮，其含有一个非极性的异戊二烯基侧链连接于其中一个酚样环上。异戊二烯基链主要出现在8位但也可能在6位，或者既在6位又在8位[在查耳酮中，异戊二烯基链位于3'和/或5'位]。在啤酒花中，异戊二烯基类黄酮主要存在于于蛇麻素腺内，存在于于雌株的啤酒花穗内小苞片的基部。异戊二烯基类黄酮的其他天然源包括例如单节假木旦(Dencira/o6/應/cmceotowm)、苦参(S。//zora/7flvesce—、毛苦参(Sop/zorafowewosa)、面包果(^WocflT/wscom/7zmw力禾口Marshalliagrandiflora。异戊二烯基类黄酮的实例是查耳酮(如黄腐酚(X)和去甲基黄腐酚(DMX)，脱氢环黄腐酚(dehydrocycloxanthohumol))和黄烷酮(如异黄腐酚(IX)，8-异戊二烯基柚皮素(8-PN)和6-异戊二烯基柚皮素(6-PN)。术语"香叶基类黄酮"涉及这样一类类黄酮，其含有非极性的香叶基侧链连接于其中一个酚样环上。实例包括四羟基香叶基类黄酮，6-香叶基柚皮素，3'-香叶基查耳酮柚皮素和8-香叶基柚皮素。所有这些香叶基化的化合物都曾经从啤酒花穗中分离获得，并且，据称，8-香叶基柚皮素具有雌激素样活性(Milligan等，(2000)J.CHn.Endocrinol.Metab.85，4912-4915)。本发明中，术语"酶促脱烷基化或脱甲基化"是指用酶从化合物上去除垸基或甲基。本发明中，术语"5-垸氧基脱垸基化"或"5-甲氧基脱甲基化"分别指从类黄酮5位上的烷氧基中去除垸基或者从该位置上的甲氧基(-OCH3)中去除甲基(环原子编号见图1A)。在本文中，"5-甲氧基"和"5-0-甲基-"具有相同意思。术语"5-烷氧基-(异戊二烯基)类黄酮转移酶(5-AO-(P)FT)"指能够保证5-垸氧基-(异戊二烯基)类黄酮发生5-垸氧基脱垸基化反应的酶。一类特别的类黄酮是查耳酮，其环原子编号与别不同。因此，相对于査耳酮，本发明涉及从查耳酮化合物上去除烷基，更特别地是6'-烷氧基脱甲基化，即从查耳酮6'位上的垸氧基(例如甲氧基(-OCH3))中去除甲基(环原子编号参见图1B)。在此，"6，-甲氧基"和"6'-0-甲基-"具有相同的意思。确保6'-垸氧基脱垸基化，尤其是6'-甲氧基-脱甲基化进行的酶也称为"6'-烷氧基-(异戊二烯基)查耳酮转移酶(6，-AO-(P)CT)"和"6-甲氧基-(异戊二烯基)查耳酮甲基转移酶(6'MO(P)CMT)"。本发明中，术语"微生物"包括细菌和真菌。它涉及单个微生物的菌株，微生物聚生体或微生物群落，如动物(包括人类)肠道或其它部分的微生物群落，或者例如来自于任何环境样品的微生物群落。本发明中，术语"体外方法"指在多细胞生物体外进行的方法，包括无活细胞参与的方法(使用例如裂解的细胞，蛋白提取物或重组蛋白质)和使用活细胞、尤其是分离细胞的培养物进行的方法。当提到体外方法时，它不包括例如完整啤酒花穗中或活体动物肠道中自然发生的过程。"'原位'脱垸基化"指在机体的一个或更多个特定器官内的体内脱甲基化活性。"细菌"包括好气菌和厌氧菌。本文中，细菌"同型乙酸菌"是厌氧菌，它通过乙酰辅酶A途径将C02还原成乙酸酯或氧化乙酸酯。例如，代表性的同型乙酸菌是，例如，厌氧乙酸菌(JcWoa"aeroZ^.Mw"orerae)，iE氏乙酸杆菌(JcWo6fl"en'wmwooc/")'威氏醋酸t干菌(」c"o6fl"m'丽w/e〃'"gae)，凯伍产酉昔菌(JcWoge"應h'vw/)，爿c""麵acw/膽/or附/co(3ce"cww，东方脱硫肠4犬菌(Desw//c^owacw/wwor/e/7/7's)，5^onmz^a！paucivorans，消化链球菌属(Peptostreococcussp.)禾口真杆菌属(Eubacterriumsp.)。说明书和权利要求书中，术语"第一"、"第二"、"第三"等用于区别类似元素(件)而不一定具有排序例如时间排序的意思。应当理解，以上术语在合适的环境下是可以互换的，并且，本发明在此描述的具体实施方式也能够不同于在此所述的次序操作。根据本发明，酶促脱烷基化，尤其是类黄酮的5-烷氧基脱垸基化能够通过酶实现，所述酶通常指5-烷氧基-转移酶，尤其是5-甲氧基类黄酮甲基转移酶(5-M0-FMT)和/或6'-甲氧基查耳酮甲基转移酶(6，-MO-CMT)，并且，可以通过能生产5-烷氧基-类黄酮院基转移酶或者6'-烷氧基査耳酮垸基转移酶的完整活体细胞或灭活细胞(或者细胞材料)，通过这种细胞的裂产物，这种细胞的溶解产物的部分(例如，膜或细胞质)，通过包含所述5-烷氧基-类黄酮垸基转移酶和/或6'-烷氧基查耳酮烷基转移酶的经富集或纯化的蛋白组份，或者通过重组表达的5-烷氧基-类黄酮垸基转移酶和/或6'-烷氧基查耳酮垸基转移酶来实现。其中，重组脱烷基化酶是柚细胞分泌的，可采用条件培养基。当重组酶位于细胞质时，可以向重组DNA中添加分泌信号来获得可从其生长培养基收获的蛋白质。本发明提供烷氧基-去烷基酶，更具体地说是能够从垸氧基类黄酮上除去烷基的酶。该垸基可以是直链或支链垸基。更特别地，该垸基是C,-C6烷基。在一个具体实施方式中，该烷基是甲基。根据本发明，5-垸氧基-垸基转移酶，尤其是5-烷氧基-类黄酮-垸基转移酶来自非动物的原核生物或真核生物，包括源自植物细胞或微生物的5-烷氧基-烷基转移酶。本发明的第一方面涉及能够将5-垸氧基-类黄酮脱垸基化尤其是将5-甲氧基类黄酮和/或6'-甲氧基査耳酮脱甲基化的细胞，提取物，和富集的、半纯化或纯化的蛋白质(也涉及包含一种或多种上述物质的组合物)。根据本发明的一个具体实施方式，包含5-AO-FMT(和/或6，-AO-CMT)活性的细胞、提取物和蛋白质是细菌源的。最特别地，所述细菌是同型乙酸菌。本发明的更进一步具体实施方式涉及选自真杆菌属属和消化链球菌属的同型乙酸菌。同型乙酸菌可在厌氧条件下培养，用蔗糖、一碳化合物如甲酸酯，甲醇，CO和C02加H2培养以及用甲氧基化芳香族化合物作为碳源。具有增强的或富化的异戊二烯基类黄酮脱垸基或脱甲基活性的细菌菌株可通过用相关底物重复培养来选择获得，如此处实施例部分所述的。在此所述的活性富化指活性是原始菌株的约1.5至约10倍之间，更特别地是，活性原始菌株的约3倍。在此之外或与此不同，本发明的富化方法保证酶活性达到90-100。/。的底物(如25mg/lIX)转化率。因此，本发明还涉及富化细菌菌株的5-烷氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-査耳酮-转移酶(6'-AO-CT)活性的方法，包括在含有5-烷氧基类黄酮如5-甲氧基异戊二烯基类黄酮(或6'-甲氧基查耳酮)的培养基上培养菌株的步骤，更具体地说，包括将细菌涂布在包含IX(或X)的培养基上，然后选择最具生产能力的菌落。最特别地是，重复地将菌株涂布在包含底物的培养基上，如重复2-10次，更特别地是3或4次，随后选择具有最高5-垸氧基-类黄酮-转移酶(5-AO-FT)和/或6'-烷氧基-查耳酮-转移酶(6，-AO-CT)活性的菌落。所述活性能够被测量，例如基于反应终产物的产量。根据一个具体实施方式，富化方法在同型乙酸菌株上进行，更特别地是真杆菌或消化链球菌菌株，最特别地是迟缓真杆菌(E//mwwm)或产生消化链球菌(尸/7ra^c^^)。在2006年3月15日，WillyVerstraete将一株经富化的迟缓真杆菌CEw6a"er/wm///w(wwm)保藏于比利时微生物保藏协作中心(BCCM)的BCCM/LMG中心，保藏编号LMGP-23546，LaboratoriumvoorMicrobiologie，UniversiteitGent(UGent)，K丄.Ledeganckstraat35，B-9000Gent，比利时。因此，本发明提供了一种生产富化、半纯化和/或纯化的5-烷氧基类黄酮转移酶的方法，更特别地，所述转移酶是5-甲氧基异戊二烯基类黄酮甲基转移酶，该方法包括获得具有增强/富化5AO-FT活性(尤其是5MO-FMT活性)的细菌菌株(尤其是同型乙酸菌菌株，尤其是迟缓真杆菌(五"6ac&n'ww//mcm^)，使用经典提纯法富集、半纯化或纯化所述酶，包括采用硫酸铵沉淀，离子交换层析和凝胶过滤层析。本发明的细菌菌株提供了这样的源材料，其中烷基或甲基转移酶以高浓度存在和/或其中存在高活性的天然突变体。在这两种情况下，菌株都称为"经富化的"菌株。根据本发明的另一具体实施方式，包含5-垸氧基脱烷基活性、尤其是5-甲氧基类黄酮-脱甲基活性(和/或6'-甲氧基查耳酮-脱甲基活性)的细胞是转基因细胞，是通过将编码5-烷氧基-垸基转移酶尤其是5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)的DNA序列导入微生物或植物细胞获得的。可将经遗传改造具有增强的5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)活性的植物细胞培植成具有增强的5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)活性的植物，与天然的或人工诱导高烷氧基类黄酮(例如甲基类黄酮)水平相结合即可实现"在植物中"生产植物雌激素。因此，本发明提供了遗传改造的、提高了植物雌激素含量的植物，例如但不限于啤酒花。根据另一具体实施方式，包含5-烷氧基脱垸基活性尤其是5-甲氧基脱甲基活性的细胞、提取物和蛋白质是桑科啤酒花(/Zwmw/^/w/w〃^)或其他合成8-PN的植物例如Marshalliagrandiflora和毛苦参(So;/zo^owe"cwa)的植物细胞。为了更大规模的转化，可筛选具有增强X或IX向8-PN自然转化能力的植物，目的是找到5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)自然突变体或5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)过表达自然突变体。可以使用如下试验来分析细胞或组合物中的5-AO-FT(和/或6'-AO-CT)或5-MO-FMT(6，-MO-CMT)活性，用所述试验检测5-0-甲基化类黄酮(6'-0-甲基化查耳酮)测试底物向其脱甲基形式的转化。测试底物优选异戊二烯化5-甲氧基类黄酮。根据一个具体实施方式，化合物IX用作底物，通过质谱法、HPLC或其他分析法来分析其转化为8-PN的情况。包含5-甲氧基脱甲基活性的细胞、提取物或组合物的酶特异性可用在其它位置上具有甲氧基的类黄酮底物进行分析。例如，用于分析的合适底物是红桔素(tangeretin)，它在4'、5、6、7和8上都有甲氧基。这一试验可以将细菌的5-AO-FT(和/或6'-AO-CT)脱烷基活性或者5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)脱甲基活性与哺乳动物微粒体或植物细胞的脱甲基活性区分开来。保留了5-甲氧基脱甲基活性的细菌或植物细胞提取物可通过标准蛋白质提取方法获得。具有5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)活性的纯化蛋白质可通过蛋白质提纯法与纯化组份的活性筛选相结合来获得。本发明的第二方面涉及产生5-烷氧基类黄酮转移酶(5-AO-FT)和/或6'-烷氧基査耳酮转移酶(6'AO-CT)尤其是5-甲氧基类黄酮甲基转移酶(5-MO-FMT)和/或6'-甲氧基査耳酮甲基转移酶(6'-MO-CMT)的细菌，或者含该活性的它们的提取物或纯化蛋白质的用途，即用于天然和合成5-甲氧基类黄酮，包括异戊二烯化或香叶基化的5-甲氧基类黄酮的脱烷基化或脱甲基化。本发明的一个具体实施方式中，能够将5-甲基化类黄酮例如IX转化为8-PN的细胞尤其是微生物被用于在体外生产8-PN和相关化合物，该方法具有良好的经济效益。可设计不同的具体实施方式，例如，用啤酒花提取物或(部分)纯化的提取自于啤酒花的化合物与例如脱甲基细菌菌株共培养；将脱甲基细菌菌株、细胞提取物或最终的条件培养基喷在啤酒花提取物或(部分)纯化的源自啤酒花的化合物上；或者将后者浸没在含有例如脱甲基细菌菌株或细胞提取物或最终条件培养基的培养基中，随后，经一定时间后，可以灭活菌株。因此，本发明也提供了用于大规模经济地体外生产植物雌激素的方法。根据本发明，含有5-AO-FT(和/或6'-MO-CT)活性的细菌、提取物和/或蛋白质能被用于生产活性雌激素，更特别地是由5-烷氧基类黄酮生产植物雌激素。本发明的一个具体实施方式涉及5-MO-FMT禾n/或6'-MO-CMT活性在植物类黄酮尤其是从啤酒花(Hamuluslupulus)获得的类黄酮的脱甲基化中的应用。本发明的更进一步具体实施方式涉及IX转化成8-PN，或者IX衍生物脱甲基转化为具有基本相同的生物活性的8-PN衍生物。根据一个具体实施方式，脱甲基异戊二烯基类黄酮衍生物例如8-PN可通过如下方法获得首先对易获得的甲基化前体的结构进行修饰，随后根据本发明所述进行脱甲基化从而获得脱甲基异戊二烯基类黄酮衍生物。可能的改动包括例如添加侧链或者键的饱和或去饱和。此外，含有5-AO-FT禾口/或6'-AO-CT尤其是5-MO-FMT和/或6'-MO-CMT活性的本发明细胞和提取物能被用于其他5-烷氧基类黄酮的脱垸基化。最特别地是，除IX(或X)之外的其他5-甲氧基类黄酮(或6'-甲氧基査耳酮)也可用作本发明所述的底物，例如如下所述的5-甲氧基类黄酮或6'-甲氧基查耳酮，它们在4、6、7、8、2'、3'、4'、5'和6'(按照类黄酮编号)位上具有取代基，所述取代基独立地选自H、CVC6烷基、C「C6垸氧基和C厂C6酰基、卤素、更长的碳链、芳香族基团、一种或多种糖残基或糖醇、醚、酯、磷酸酯、硫酸酯，胺等。根据本发明的一个具体实施方式，5-烷氧基类黄酮尤其是5-甲氧基类黄酮的特征在于在7位上有一个羟基和/或在2和3位有一双键和/或在4'位上有一羟基。最特别地，本发明涉及用5-MO-FMT活性对在6禾口/或8位上具有异戊二烯基或香叶基的5-甲氧基类黄酮化合物进行脱甲基化。任选地，所述异戊二烯基或香叶基可以是进一步修饰过的，所述修饰例如但不限于对双键的修饰，转化为类异戊二烯和取代修饰。在某些实施方式中，这些5-甲氧基类黄酮是6'-甲氧基查耳酮或5-甲氧基黄烷酮，包括它们的异戊二烯化或香叶基化形式。在特别的实施方式中，它们选自由黄腐酚(X)(2',4,4'-三羟基-3-异戊二烯基-6'-甲氧基查耳酮)(查耳酮的原子编号显示在图1B和图2中)和异黄腐酚(IX)(5-0-甲基-8-异戊二烯基柚皮素)，或者它们的具有基本相似生物活性的衍生物(或者，脱甲基产物化合物具有基本上相似生物活性的化合物)组成的组。本发明的另一实施方式涉及包含5-烷氧基类黄酮转移酶(5AO-FT)和/或6'-垸氧基查耳酮转移酶(6'AO-CT)活性的细菌或它们的提取物的在化合物脱垸基化中的应用，所述化合物选自以下不仅含有5-甲氧基的分子组成的组4'-乙酰基-7-异戊二烯基氧基柚皮素，(±)-(￡)-8-(4"-羟基异戊稀基)柚皮素(8^仏0印，(士)-(五)-8-(4"-氧基异戊稀基)柚皮素(8-PN:0)和6,8-双异戊二稀基柚皮素。本发明提供了使用非动物真核生物或原核生物材料体外生产脱甲基异戊二烯基类黄酮的改进方法。这对于那些具有商业价值的脱甲基异戊二烯基类黄酮例如8-PN来说特别有意义。如前所述，8-PN在体内表现雌激素样活性，预防骨质流失，抑制血管生成和(肿瘤)转移并显示出抗雄性素活性。因此，通过本发明的方法生产的化合物可用于治疗或预防例如骨质疏松症和癌症等疾病。具有雌激素样特性的脱甲基异戊二烯基类黄酮或脱甲基香叶基类黄酮，例如本发明方法所得的那些，能够被用于人类或动物的食品或膳食补充剂，例如饮料(包括啤酒)，还可用于人用或动物用的化妆品中。因此，本发明更进一步提供了生产这样食品或膳食补充剂和药剂的改进方法。本发明的另一方面涉及甲基化类黄酮在人类或动物体的肠或任何其他部分中的原位活化，这是通过施用具有5-MO-FMT或6'-MO-CMT活性的细胞、细胞提取物或纯化酶。根据一个具体实施方式，5-MO-FMT和/或6'-MO-CMT活性的施用与甲基化类黄酮或它们的来源的施用相结合，所述结合包括在不同或同一组合物中，同时或依次施用。包含所述酶活性的组合物和包含所述底物的组合物均可作为药物组合物或膳食补充剂。甲基化类黄酮的来源包括但不局限于植物(例如啤酒花)部分或提取物或纯化的甲基化类黄酮化合物。脱甲基异戊二烯基类黄酮尤其是8-PN的原位生产为治疗和/或防止可用雌激素治疗的疾病和病状提供了新的选择，所述疾病或病状例如但不限于，骨质流失，病理性血管生成，(癌)转移病变，还可用作抗雄激素疗法。任选地，针对具体靶向的垸基化类黄酮设计不同的策略对大肠给药。这可以通过例如将组合物配制成在大肠中释放的胶囊或通过与选自由葡糖苷酸，硫酸酯(盐)，乙酸酯(酯)，丙酸酯(盐)，糖苷，乙酰基糖苷，丙二酰基糖苷以及它们的混合物相结合来实现。本发明的另一方面涉及药物组合物和/或膳食补充剂，其包含具有5-MO-FMT禾口/或6，-MO-CMT)活性的细胞、它们的提取物或纯化蛋白或由上述物质组成。根据本发明的这方面的一个具体实施方式，细胞是微生物细胞，更特别的是同型乙酸菌细菌细胞，例如真杆菌属和消化链球菌属的同型乙酸菌。任选地，药物组合物或膳食补充剂还包含甲基化异戊二烯基类黄酮或甲基化香叶基类黄酮的来源，当它们成为脱甲基化合物将显示出强的雌激素样活性。这样的来源可能是植物提取物(特别是啤酒花提取物)或其富化组份。它还可以是合成的甲基化异戊二烯基类黄酮。为了同时或依次给药，微生物和甲基化类黄酮可以配制在分开的药物载体内或用分开的药物载体来配制，或者，可以配制在同一药物载体内，均匀分散或不匀称分散。相应地，本发明提供了药物组合物的组合，多种药物组合物与膳食补充剂的组合，以及多种膳食补充剂的组合。而且，本发明提供了治疗的方法，包括依次或同时地对有需要的患者施用本发明的药物组合物。同样地，本发明提供了含有5-烷氧基-垸基转移酶活性的组合物和/或包含所述5-垸氧基类黄酮的组合物用于生产药物的用途。典型地，本发明的组合物用作雌激素补充剂和/或雌激素替代疗法。甲基化IX或X(其将被脱甲基化成8-PN)的用量介于10至20000微克/天/75kg之间，介于50至10000微克/天/75kg之间或介于50至7000微克/天/75kg之间，例如大约5、10或20毫克/天/75千克。将脱甲基形式与8-PN就雌激素样活性进行比较后，较弱类黄酮的甲基化形式可相应地以较高剂量使用。本发明的一个方面提供了一种药物组合物，包含具有本发明的5-烷氧基-烷基转移酶活性的细菌或细菌提取物和药用载体。为了达到最佳功效，药用载体以能够将微生物释放至结肠的为佳。药物的结肠定向给药是大家熟知的，例如可参考Chourasia&Jain(2004)Drug.Deliv.11(2)，129-148。已知的结肠定向药物释放策略包括形成前药，pH敏感性聚合物包衣，采用结肠特异性生物可降解聚合物，定时释放系统，渗透系统，和压力控制药物递送系统。在各种结肠定向给药方法中，采用聚合物尤其是可由结肠细菌降解的可生物降解聚合物具有很好的前景。聚糖酶是细菌酶，可以获得足量的该类酶用于开发结肠靶向药物。基于该方法，已经就许多多糖用于结肠特异性药物释放进行了研究。这些多糖包括果胶，瓜耳豆胶，直链淀粉，菊糖，葡聚糖，脱乙酰壳多糖和硫酸软骨素。该天然聚合物家族适用于药物递送是因为组成该家族的聚合物具有大量可转化基团，分子量分布广，不同的化学组成，并且，大多数低毒、可生物降解而稳定性高。这些材料最有利的特性是它们已被批准可作为药物赋形剂。为了防止不期望的本发明脱垸基细菌介导的降解，可先将细菌置于非细菌可降解药物载体内，然后用可被结肠内微生物群降解的聚合物包衣。此后，该细菌能够例如通过pH控制和时间控制药物释放机制释放，或者利用(Leopold(1999)MedKlin.94Suppl1，6-11所述)强蠕动波产生的腔压增强来释放不依赖于肠微生物的酶活性的结肠定向递送系统也是已知的。例如，欧洲专利EP0673645描述了一种结肠定向药物递送系统，包括三个部分(l)肠溶衣，用于阻止胃液渗透入该递送系统，由此阻止药物释放至胃里；(2)易蚀聚合物层，穿过上部肠道期间该层暴露并逐渐被浸蚀，和(3)核，其是一个含有活性成分的常规片剂或者微型胶囊，该核易分解，在易蚀的聚合物层被浸蚀后，将药物释放至目标地点，结肠。欧洲专利申请EP0453001描述了能够定向控释活性主要成分的药物组合物，它能够在肠道内尤其是结肠内和回肠末端部分起效。将活性主要成分配制成多颗粒多剂量形式并用至少两层膜包被，一层具有pH依赖性溶解度，另一层不溶但能为肠液所透过。当被包被的活性成分在胃和肠起始部分停留，也就是说在pH值小于5.5时，它不会被释放。只有当它到达pH值更高的环境(小肠或者结肠)时，pH值依赖性膜溶解并开始释放活性成分。此时起，pH值依赖性的但能为肠液所透过的第二层膜开始降解并控制药物在小肠至结肠的肠道内溶解。EP0778778描述了一种组合物，具有一种或多种益生菌微生物例如真杆菌和运送微生物至大肠的载体。载体是一种经修饰的或未修饰的耐腐淀粉，特别是一种高直链淀粉，其在大肠中充当微生物的生长或维持培养基。美国专利申请2004175389公开了一种制剂用于保护益生菌使其活性在通过胃时保留而不释放，但可在肠中释放，特别是在结肠内释放，并且，该制剂具有低的水活性和，相应的，具有较长的储存期。该制剂包含益生菌与单价藻酸盐的基本无水混合物，形成的混合物被保持在基本无水的环境中。所述藻酸盐包括海藻酸钠和藻酸钾，但不包括二价盐如藻酸镁或海藻酸钙。通常，.该制剂具有肠溶包衣(例如，凝胶或纤维素胶囊)。要理解的是，尽管具体的实施方式、特定的结构和构造以及材料在以下的实例部分进行了讨论，但这仅是示例性的并且在没有背离本发明的范围和精神的前提下各种形式上和细节上的改变或修饰均是可以完成的。实施例实施例1:用人类粪便培养物进行异黄腐酚(IX)的脱甲基化。粪便样品来自于12个健康的人类受试者，年龄在20和35岁之间，用A至L表示。没有受试者有胃肠疾病的历史并且在采样前的3个月里没有服用抗生素。用含有lg/1还原剂巯基乙酸钠的磷酸盐缓冲盐水(0.1M，pH7)匀浆粪便，制备20。/。(w/v)的新鲜粪便样品的粪便浆。通过离心(lmin，500xg)除去颗粒物。此上清液在下文称之为"培养物"。通过在厌氧条件下在含有25mg/l的异黄腐酚的BrainHeartInfusion培养基(含有0.5g/1盐酸半胱氨酸)中培养粪便培养物(10。/。(v/v))，培养8天，测试来自于粪便样品A、B、C和D(后文记作培养物A-D)的培养物降解或转化啤酒花异戊二烯基类黄酮IX的能力。根据DeBoever等(2001)Env.HealthPerspectives109，691-697，根据Routledge&Sumpter(1996)Environ.Toxicol.Chem.15，241-248，在第0和8天分析培养物提取物，利用酵母雌激素样筛选(YeastEstrogenicScren)分析提取物者的IX生物活性转化产物。简言之，用人类雌激素受体(ERa)基因，与含有应答元件和lacZ报告基因(编码e-半乳糖苷酶)的表达质粒一起转化酿酒酵母OS^cc/zarawycwcerev/Wfle)。在540纳米处通过显色物质氯酚红-P-D-吡喃半乳糖转化为氯酚红来量化P-半乳糖苷酶活性。生物测试反应记作540nm的吸光度与630nm的光密度的比值[(A540/A630)M]。样品的雌激素样活性用相对于10nM雌二醇(E2)的当量百分数来表示，所述lOnM雌二醇在雌激素受体生物测试中引起100%反应。生物测试在96孔板中进行，其中测试lOtxL的测试化合物，将其与240uL的遗传修饰的酵母(在610nm的光密度为0.25)共培养。在二甲基亚砜中连续稀释测试化合物，这可产生剂量(纵座标)对活性(横坐标)的量效曲线。利用Marquardt-Levenberg算法(Sigmaplot4.0，SPSS公司，芝加哥，伊利诺斯州，美国)(DeBoever等(2001)Env.HealthPerspectives109，69卜697)通过4参数逻辑模型拟合数据。结果提供于图3中。在第0天，没有培养物显示雌激素样反应。8天后，在培养物C中观察到雌激素样特性急剧地提高(图3)，但在培养物A、B或D中却不是(数据未显示)。这些结果说明粪便培养物C能够将IX转化为雌激素样特性更强的化合物。为了更进一步测试该转化，在厌氧条件下，在含有25mg/lX或IX的BrainHeartInfusion肉汤(含0.5g/1cystein-HCl)中培养培养物A-D(10%(v/v))培养8天，并且通过HPLC检测转化产物(表1)。在培养物A、B和D中，IX被证明不被转化，这与酵母雌激素样筛选的结果相一致。然而，在培养物C中，回收到几乎40%的8-PN，这说明了培养物C雌激素样特性提高的原因。所有样品中都检测到X被少量转化为IX，但是，因为当X与经热压处理的培养物共培养时也检测到这样的转化，表明这是一非酶促异构化。在培养物C中，再次检测到少量8-PN，其来自于人粪中细菌对IX的转化。表1:用粪便样品A、B、C和D培养后X和IX的微生物转化。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*结果表示为相对于类黄酮所给予量的X、IX或8-PN的平均(stdev)摩尔百分比回收率。an.d.:低于检测水平结果显示肠道细菌能够通过对组分5位上甲氧基的O-脱甲基化酶反应将X和IX转化为8-PN。但不是所有的培养物均能够完成该反应。因此，在厌氧条件下，在BrainHeartInfusion培养基(含0.5g/1盐酸半胱氨酸)中，将其余培养物E-L(10。/。(v/v))与25mg/1IX共培养3天(图4)。仅仅在样品E、J和K中检测到IX的微生物介导的O-脱甲基化。本实施例表明，甲基化异戊二烯基类黄酮在摄取后不是代谢惰性的，它们能够被活化成生物学上具有(更高)活性的脱甲基衍生物。然而，该转化能力显著依赖于肠内微生物群落的组成和活性，因为IX的活化仅仅发生在三分之一的测试样品中。为了更进一步调查这些个体间的差异，在厌氧条件下，在含有25mg/lIX的BrainHeartInfusion培养基(含有0.5g/1cystein-HCI)中培养共51个粪便样品，培养3天(图5)。所示结果为相对于培养所用IX浓度的8-PN生产百分率，并且样品按照增强的8-PN生产能力来排序。通过两步聚类分析(TwoStepCluster)来分析数据，聚成3组(记作a、b和c)，彼此的平均值具有显著差异(PO.Ol，Kruskal-Wallis)这些数据表明，甲基化异戊二烯基类黄酮的活化依赖于肠内微生物群落，据此可将个体分为高的(组C，16%)，中等的(组b，22。/。)和迟钝的(组a，63%)8-PN生产者。通常，最终接触到活性组分在相当程度上取决于前体浓度和肠内微生物群落转化潜力。实施例2.微生物用来生产具有8-异戊二烯基柚皮素型雌激素样特性的化合物的用途本实施例描述了两种已知肠厌氧菌将IX转化为8-PN的能力。迟缓真杆菌(五^fl"en'"m//moww)ATCC8486和产生消化链球菌(尸印^sfre/^ococowpro^"w"ATCC27340得自于德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCuItures)(DSMZ，Braunschweig,德国)。在厌氧条件下在BrainHeartInfusion培养基(含0.5g/1盐酸半胱氨酸)中，五.//moww与25mg/1IX和8-PN共培养13天(表2)。该菌株能够将IX转化为8-PN。该菌株不会进一步降解8-PN，因为培养13天后所有作为底物加入的8-PN均能够被回收。这些特征明显不同于在肝微粒体内观察到的代谢途径，在肝微粒体内，8-PN被大量地进一步代谢[Nikolic等(2005)J.ofMassSpectrom.40，289-299;Nikolic等(2004)DrugMetabolismandDisposition32，272-279]。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*结果为乂、IX、8-PN或6-PN的平均(stdev)摩尔百分比回收率。an.d.:未检测到因为￡.//mowm具有将IX转化成8-PN的能力，进行了一次选择过程来挑选出能够大量生产8-PN的菌株。选择过程包括平行地将6株￡./Zworam[各自为单菌落的培养物]与25mg/lIX共培养8天。接着，选出8-PN产量最高的培养物，将其用于下一轮的6株平行培养(表3)。虽然第一轮选择中的最低产量仅仅是2%，经三个选择步骤后明显提高到82%，并且，最有效的培养物将添加的所有IX都转化成了8-PN。经选择，每轮全部6个培养物的平均产量从22.5%提高到90.5%，并且，标准偏差从20%下降至7%。这意味着，仅三轮选择后就可选择到一个几乎能将IX全部转化(高平均值)且保持稳定的(低标准偏差)的菌株。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>为了检验P.yo*cto将IX转化为8-PN的酶转化能力，在厌氧条件下在BrainHeartInfusion培养基(含0.5g/1盐酸半胱氨酸)中，该菌株与含有25mg/1的IX共培养13天，一式三份。每2天分析一次样品，测定IX和8-PN的浓度((图6)。随着培养的进行，尸.将培养所用IX中的10%至50%转化成8-PN。这表明，该菌株也适于用来生产8-PN。还可以参照以上就五./^a^m所述进一步选择具有更高脱甲基化活性的i3菌株。经富化五z^a"eWwm〃woswot菌株的一具体实例已由WillyVerstraete于3月15日保藏于比利时微生物协作保藏中心(BCCM)的BCCM/LMG中心，保藏编号LMGP-23546。实施例3能够转化甲基化异戊二烯基类黄酮的微生物在发酵中的应用。设计了一项分批加料发酵试验，使用一如上所述述选出的￡m^c^/^7"mosi^菌株在发酵条件下转化甲基化异戊二烯基类黄酮。发酵在BraunBiostatM发酵罐(2L的容器)中进行，向其中加入1.5LBrainHeartlnfusion培养基(含0.5g/l盐酸半胱氨酸)。随后，发酵罐在12rC下高压灭菌30min。在接种前，发酵罐用氮气冲洗系统冲洗1h制造厌氧环境。此后，在发酵罐中，向培养液中接入2天龄的￡./〖mosw7i培养物，并加入25mg/L的IX。发酵在37'C下进行2周，没有pH控制。从第1天开始，每天3次以10ml/min的速度向发酵罐中添加含有25mg/LIX的无氧BrainHeartInfusion培养基(含0.5g/1盐酸半胱氨酸)200ml，同时以200ml/mhi速度从系统中放出发酵物。从放料中取10ml样品，进行化学分析。在第0、1、2天进行如是采用分析，此后每2天做一次。数据为％转化率(8-PN/(IX+8-PN))。结果，IX转化成8-PN的转化率为0%(第0天)，43%(第1天)和100%(自第2天起)。该实施例表明，选出的菌株能够在基于发酵的方法中将IX转化成高雌激素样活性的8-PN，由此可实现例如由前体生产具有雌激素样特性的产物之类的应用，实现纯化目标化合物以在其他用途中用作组分或者活化啤酒花提取物或包含甲基化异戊二烯基类黄酮的其它蔬菜提取物中前体的目的。实施例4:菌株添加剂引发IX向8-PN的非体内转化。将实施例2选择试验中获得的最有效尺//mowm菌株加入到原先在实施例1表现为无转化能力的培养物B中，检测该菌株在粪便悬液的复杂环境中引发8-PN生产的能力。向培养物中加入菌株的比例为0%到100%(v/v)。在厌氧条件下在BrainHeartInfusion培养基(含有0.5g/l盐酸半胱氨酸)中，该混合物与10%(v/v)的25mg/L的IX的共培养七天。8-PN的浓度每两天检测一次(图7)。结果表明，8-PN的产量随着五.//mowm的加量逐渐增加而提高。等量的￡./z'mcwwm培养物和粪便样品(在图7中100%)将IX完全转化为8-PN，即使菌株加量为1%，仅在一天后，半数IX已经被转化成8-PN。值得注意地是，所有培养的8-PN均在第一天达到了最高浓度，这表明所有可用IX被立即转化。没有检测到8-PN的继续转化，因为第一天和第七天的8-PN浓度没有显著差异(StudentT-test，p>0.05)。这个实施例表明，所选菌株能够在粪便培养物这样的复杂环境中将IX转化成高雌激素样活性的8-PN，由此可实现的应用例如在诸如啤酒花提取物或含有甲基化异戊二烯基类黄酮的其他蔬菜提取物等不同介质中将前体原位转化为具有雌激素样特性的产物。实施例5.在肠道的体外动态模型中甲基化异戊二烯基类黄酮的转化在下一步骤中，为了证明前体如IX原位转化成具有雌激素样特性的产物如8-PN，使用肠道的体外动态模型(人类肠微生物生态系统模拟器(SHIME))，(Molly等(1993)A卯1.Microbiol.Biotechnol.39，254-258)。SHIME由5个依次串联的反应器组成，各自代表人类胃肠道的不同部分。前两个反应器(胃[反应器l]和小肠[反应器2])是基于充填和排空原理来模拟食物摄取和消化过程中的不同步骤，用蠕动泵向胃和十二指肠腔添加限量的SHIME进料(3次/天)和胰液和胆汁液，并在指定时间间隔后排空相应的反应器。后三个腔(对应于升结肠[反应器3]，横结肠[反应器4]以及降结肠[反应器5])是具有恒定体积和pH值控制的持续搅拌反应器。选择不同容器内的保留时间和pH值，目的是模拟胃肠道不同部分的体内环境。在反应器2中添加60ml人造胰液和胆汁液、胰酶和NaHC03来模拟食物在小肠中的通过。用恒温箱将系统温度保持在37°C，并且，通过每天进行15min的N2吹洗将系统维持在缺氧条件下。按DeBoever等(2000)J.Nutrition130，2599-2606中所述从粪便中制备接种物。在反应器3、4、和5中加入营养培养基，并将pH值调节至相应的pH值范围。最后，向后三个反应器中添加50ml的接种液。为了此项试验，将两个上述的系统组合为由同一泵驱动(具有两个泵头的泵，能够精确地向两个系统提供相同剂量的液体)，具有相同的pH值和温度控制并且接受相同的液体食品的两套完全彼此独立的反应器。这样，所有参数被完全受控并且相同，只有这2个系统中肠微生物群落是分别导入的。本例中，我们分别导入一种能够活化甲基化异戊二烯基类黄酮(PF+)的菌群和一种无此活化能力的菌群(PF-)。经两个星期的稳定期后(稳定期中饲以普通SHIME进料)，向SHIME进料中加入25mg/L的IX，持续4周(第15-44天)。在后两周，还将实施例2选出的￡Wac^/wm//mow,"菌株加入第一个结肠腔，将这一菌株接入模拟为自有益生菌(probiotic)(第30-44天)。图7和8显示PF+和PF-菌群系统中升结肠、横结肠和降结肠中的IX和8-PN的浓度。在PF+腔中，当仅给予IX时，在结肠末端部分观察到甲氧基化异戊二烯基类黄酮的活化(第15-30天)，而在PF-腔中则没有发生转化。补充菌株后(从第30天开始)，在PF+腔和PF-腔中的活化能力都增加，并且在结肠的末端部分检测到了具有雌激素样活性的8-PN的产生。本实施例表明，实施例2所选菌株能够在模拟的人类肠道条件下活化甲基化异戊二烯基类黄酮。实施例6:实施例2选出的菌株在体内将5-烷氧基异戊二烯基类黄酮脱甲基化的能力。用原生(axenic)大鼠和人类菌群相关(HFA)大鼠进行试验，测定实施例2选出的菌株在体内活化甲基化异戊二烯基类黄酮的能力。共12个原生大鼠用于该研究。当大鼠5周龄时，用刚排出的经匀质的具有异戊二烯基类黄酮脱甲基活性的粪便培养物经口管词3个大鼠成为HFA大鼠。这些HFA大鼠标记为PF+大鼠。同时，用刚排出的经匀质的没有异戊二烯基类黄酮脱甲基活性的粪便培养物经口管饲3个大鼠成为HFA大鼠。这些HFA大鼠标记为PF-大鼠。余下大鼠控制在无菌条件下。在实验开始前，所有的大鼠置于分开的，封闭的集体笼子中。微生物培养物在大鼠肠内稳定3周后，开始第一项实验。将大鼠移至单独的代谢笼中，每个大鼠每日给药2mglX/kg体重，持续5天，汇集每天24h的尿。3天后，定量测定尿中的IX和8-PN排泄。转化[8-PN/(IX+8-PN)]列于表4。此后，在实验的第二部分开始之前，将大鼠送回到集体笼中过2周。在此，对6个原生大鼠每日经口管饲实施例2中选出的五.//mo5^n菌株的Iog9细菌悬液共7天，使之成为人类菌群相关鼠。在第2天，将大鼠移至单独代谢笼中收集24h总尿。从第2天至第7天，给大鼠经口管饲2mglX/kg体重。在第7天，定量测定尿中的IX和8-PN排泄。转化[8-PN/(IX+8-PN)]列于表4。表4:24h总尿的％8-PN/(IX+8-PN)排泄平均值与Stdev。<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>本实施例表明，甲基化异戊二烯基类黄酮的活化是一个纯粹的微生物现象，因为原生大鼠不产生8-PN。而且，肠的转化能力的差异导致8-PN排泄的差异，因为与PF-大鼠相比PF+大鼠的尿具有更高的8-PN比率。最后，本实施例表明，所选￡.//mwt^菌株能够在体内活化甲基化异戊二烯基类黄酮，因为原生大鼠在被接入所选菌后开始产生8-PN。权利要求1.一种体外生产一种或多种植物雌激素的方法，所述方法包括a)提供同型乙酸菌的细菌菌株或其提取物的第一组合物，b)包含5-烷氧基-类黄酮和/或6’-烷氧基查耳酮的第二组合物与所述包含细菌菌株或其提取物的第一组合物接触，从而由所述细菌菌株或提取物将所述5-烷氧基-类黄酮和/或6’-甲氧基查耳酮脱烷基化。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述5-烷氧基-类黄酮和/或6'-烷氧基査耳酮是5-甲氧基类黄酮和/或6'-甲氧基查耳酮。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物雌激素是8-PN。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括通过用5-甲氧基异戊二烯基类黄酮重复培养来富化所述细菌菌株的脱烷基活性。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一组合物是所述菌株的细菌细胞培养物。6.根据权利要求6所述的方法，其中所述菌株是真杆菌(EMa"en^m^.)或消化链球菌(尸一o欲e/tococci^S/7.)。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述5-垸氧基-类黄酮是IX。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述5-烷氧基-类黄酮和/或6'-垸氧基查耳酮是植物来源的。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物是啤酒花。10.细菌细胞系用于5-甲氧基-类黄酮或6'-甲氧基查耳酮体外脱甲基化的用途。11.来自迟缓真杆菌(^/^^7'"附/^0^附)的5-甲氧基-类黄酮甲基转移酶。12.用于同时或依次施用的一种或多种药物组合物和/或一种或多种膳食补充剂的组合，包括含有具有5-烷氧基类黄酮脱烷基活性的同型乙酸菌、其提取物、半纯化或纯化组分的第一药物组合物和/或膳食补充剂以及含有5-烷氧基类黄酮源或6'-烷氧基-査耳酮源的第二药物组合物和/或膳食补充剂。13.根据权利要求12所述的组合，其中所述5-烷氧基类黄酮源是啤酒花提取物。14.根据权利要求12或13所述的组合，其中所述6'-垸氧基-査耳酮是黄腐酚，并且/或者，所述5'-垸氧基类黄酮是异黄腐酚。15.根据权利要求12至14中任一项所述的组合，其中所述的同型乙酸菌是迟缓真杆菌(五w6o"m',//mos訓)。16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合，其中所述的同型乙酸菌、其提取物、半纯化或纯化组分以结肠特异性递送制剂形式提供。17.—种富化同型乙酸菌株的5-烷氧基-烷基转移酶活性的方法，所述方法包括将所述菌株涂布在含有5-垸氧基-类黄酮的培养基上和选择具有最高5-烷氧基-烷基转移酶活性的菌落。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的步骤重复至少两次。19.包含细菌来源的5-烷氧基-垸基转移酶活性的组合物。20.根据权利要求19所述的组合物，其是一种同型乙酸菌提取物。21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述同型乙酸菌是真杆菌(^^"m'画)或消化链球菌(尸印to欲一ococcwssp.)。22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其能够将IX(25mg/1)100%地转化为8-PN。全文摘要本发明公开了用细菌酶进行5-甲氧基类黄酮的脱甲基化，这些酶类在体外生产植物雌激素，还公开了其与甲基化的5-甲氧基异戊二烯基类黄酮源结合在药物组合物中的应用。文档编号C12P17/02GK101208436SQ200680009379公开日2008年6月25日申请日期2006年3月27日优先权日2005年3月25日发明者A·海瑞克,D·德库克勒伊尔,S·普斯赛米尔斯,W·韦斯特雷特申请人:根特大学