细胞分离的方法与设备的制作方法

专利名称：细胞分离的方法与设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶细胞分离的方法与设备。依照本发明，单个细胞或含有至少两种细 胞的细胞群被定位在基质上。然后根据细胞的大小或形状或通过使用细胞标记物将非耙 细胞或包括非靶细胞的细胞群与靶细胞或包括把细胞的细胞群区别开。将激光照射非輩巴 细胞或含有非靶细胞的细胞群，来选择性杀死非靶细胞或使非靶细胞发生功能性障碍。
背景技术：
在分析细胞功能和细胞基因和在利用细胞进行分析、诊断、与治疗的领域中，从 不同类型细胞构成的混合细胞群中选择性分离出特定的细胞是一项重要的技术。尤其在 近代再生医学和利用细胞进行细胞治疗的领域中，人们非常期望开发出制备安全和有疗 效的细胞的技术，以便将非靶细胞《j起的污染减少到最低。
通常，细胞分选仪被广泛用作选择性分离细胞的设备。细胞分选仪的特征在于它 们能迅速同时处理大量样品，但是有一些问题。例如细胞必须经化学或者生物化学处 理，或者在对细胞不良的条件下处理细胞。人们还设计了使用偶联了选择性结合特定类 型细胞抗体的磁珠的细胞分离方法。这种方法的细胞回收效率非常低，因此不适用于作 为分析、诊断与治疗的细胞分离。已经设计出将激光照射细胞群中的特定细胞以杀死非靶细胞并选择性获得靶细胞的系统(参考专利文献i和非专利文献i :)。因为在细胞群中 用激光辐射鉴别靶细胞的方法与激光辐射方法必须根据细胞的数量来进行，所以该系统 的分离效率不高。该系统的另一个问题是，由于细胞大小和形状的不同，激光不能充分 辐射细胞，从而导致分离效率的降低。
专利文献1: WO01/40454, Method and Apparatus for selectively Targeting Specific Cells within a Cell Population(细胞群中选择性乾向特定耙细胞的方法与设备)
非专利文献1: Niemz M. H., Laser-tissue interaction:Fundamentals and applications.(激 光组织互作原理与应用)Springer-Verlag, 1996
发明概述
本发明要解决的问题
本发明提供了 一种分离靶细胞的方法与所用的设备，本方法根据单个细胞或细胞群 体中细胞群的大小或形状，或根据细胞特异性标签，通过在不同类型细胞的混合细胞群
中鉴别靶细胞与非靶细胞，同时选择性应用物理能量照射非耙细胞来杀死非乾细胞或引 起非靶细胞功能性障碍。 解决问题的手段
通过利用具有细胞粘附区域的基质，将含有靶细胞和非靶细胞的混合细胞群体中的 单个细胞或含有至少两种细胞的细胞群定位在基质的某些位置或区域，然后用激光选择 性照射非耙细胞或含有非靶细胞的细胞群占据的某些位置或区域，来杀死非耙细胞或4吏 非靶细胞产生功能障碍，从而实现靶细胞的高效率分离。
本发明提供的细胞分离方法包括将单个细胞或含有至少两种细胞的细胞群放在基 质的某些位置处；根据单个细胞或细胞群中细胞的大小或形状，或利用细胞标记物，将 靶细胞或包括靶细胞的细胞群与非耙细胞或含有非靶细胞的细胞群分开；并用激光照射 非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群所在的位置或区域，选择性杀死非靶细胞或引起非粑 细胞的功能性障碍。
本发明还提供了一种细胞分离方法，包括将单个细胞或包括至少两种细胞的细 胞群置于基质中的某些位置处；根据所述的单个细胞或细胞群中细胞的形状或大小，或 利用细胞标记物，将非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群与靶细胞或包括靶细胞的细胞群 分开；以及，将激光照射所述的非乾细胞或包括非把细胞的细胞群的所在的位置或区域， 以选择性杀死所述非耙细胞或使所述的非耙细胞产生功能性障碍，然后仅选择性培养輩巴 细胞。
而且，本发明提供了一种细胞分离设备，包括用于将单个细胞或包括至少两种 细胞的细胞群置于基质中某些位置处的装置；根据所述的单个细胞或细胞群中细胞的形 状或大小，或利用细胞标记物，用于将非把细胞或包括非靶细胞的细胞群与靶细胞或包 括靶细胞的细胞群区分开的装置；以及，用于将激光照射所述的非靶细胞或包括非靶细 胞的细胞群所在的位置或区域的装置。
在下文中，根据本发明描述了通过激光杀死非靶细胞或使其产生功能性障碍，从 含有靶细胞和非靶细胞的的细胞群体中去除非靶细胞，从而有效单独分离靶细胞的方法 和设备。
依照本发明的细胞分离办法，首先将靶细胞和非靶细胞组成的混合细胞群体中的 单个细胞或细胞群排列在基质的某些位置处。其次，根据细胞形状或大小，或用细胞标 记物，把非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群从排列的细胞中鉴别出来。然后，用激光选 择性照射被鉴别出来的位置或区域，选择性杀死非靶细胞或引起非靶细胞的功能性障
碍，从而选择性分离靶细胞。
如果有必要，将其中非靶细胞已经被杀死或非靶细胞产生功能性障碍的细胞群在 适于靶细胞的条件下培养，以获得靶细胞。本发明也包含这种获得靶细胞的方法。
靶细胞可以是，以TGF-P (转化生长因子p)等等从一簇包含间质干细胞在内的 细胞诱导分化的软骨细胞，但不限于此。
在上面提到的从含有间质千细胞的一簇细胞分化成软骨细胞的诱导分化系统中， 非靶细胞可以是未分化成靶细胞的细胞(即软骨细胞)，或分化成的细胞不是靶细胞的细 胞，但不限于此。
首先，根据用于在基质上排列单个细胞或细胞群的方法，将单个细胞或细胞群放 置在细胞粘附表面上，该细胞粘附表面位于具有非细胞粘附表面的基质上的 一 个图形 中。
优选将单个细胞或细胞群定位在基质内某些位置处的方法，因为该方法易于识别 非靶细胞的位点，同时该方法可以使激光以一种既可靠又安全的途径杀死非靶细胞或《1 起非靶细胞产生功能性障碍。
例如为了获得位于非细胞粘附表面上图形内的细胞粘附表面，细胞粘附试剂的 细胞粘附表面可以位于具有非细胞粘附表面的基质上的图形内。或者，可以在具有细胞 粘附表面的基质上形成非细胞粘附试剂的非细胞粘附表面，从而暴露出图形内的细胞粘 附表面。
具有非细胞粘附表面的基质可以是不与细胞粘附或者结合的任何基质，但是该 基质的材料优选玻璃，硅复合物或非细胞粘附聚合物(如聚苯乙烯这样的树脂)。基质 的表面可任选用亲水聚合物包被的表面或修饰的表面。该亲水聚合物可以包括聚乙烯 醇，聚乙二醇，聚丙烯酰胺，聚二甲丙烯酰胺，和聚羟基乙基甲基丙烯酸乙酯；也可以 是构成这些聚合物的单体的共聚物；及纤维素，但不限于此。另外，非细胞粘附试剂可 以是与非细胞粘附表面基质 一样的材料。
细胞粘附试剂和具有细胞粘附表面的基质的材料不是特别限制，可以是任何能粘附 或结合细胞的试剂或材料。该试剂或材料可以是后面提到的金属氧化物，细胞粘附蛋白 及其衍生物，温敏型聚合物，光固化树脂和其他细胞粘附聚合物(如多糖)。
形成细胞粘附表面的方法包括日本专利出版物H7-308186所公开的固定细胞粘附 聚合物的方法，和日本专利出版物2002-355026所公开的通过喷墨过程在基质表面上形 成细胞粘附聚合物的图形的方法，但不限于此。在基质表面包括玻璃或活性功能团如羟 基，氨基，或巯基的情况下，可以用在基质表面加入乙醇，卣代烷，有机硅烷的方法通 过压印等加入疏水取代基。
为了在具有非细胞粘附表面的基质上产生细胞粘附表面，可以用金属氧化物物理沉 积法进行表面修饰，如真空蒸发或溅射，化学蒸汽沉积法，电化学包被法如电镀法等 等。金属氧化物优选氧化钛，但不限于此。另外，也可以用细胞粘附表面吸附或固定化 细胞粘附蛋白如明胶、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白或这些蛋白片段的衍生物。
而且，作为在具有非细胞粘附表面的基质上形成细胞粘附表面的方法，也可以用如 日本专利出版物H4-094679中介绍的，用聚(N-异丙基丙烯酰胺)这样的温敏型聚合物 形成图形的方法。特别是，在温度低于使基质表面上覆盖的聚合物层内发生疏水性降低 的温度时，由聚合物形成的细胞粘附表面变成非细胞粘附表面。
为了在适宜条件下培养靶细胞，本发明包括一个用激光杀死非靶细胞或者引起非把 细胞功能障碍后回收未被杀死或其功能未被破坏的靶细胞的方法。鉴于此，优选用温敏 型聚合物形成细胞粘附表面，因为这种细胞粘附表面在从基质上回收靶细胞时不需要用 胰蛋白酶或其类似物进行处理。
在具有细胞粘附表面的基质上形成非细胞粘附表面以在具有细胞粘附表面的基质 上暴露出细胞粘附表面的图形的方法，包括日本专利出版物H7-308186中报道的固定非 细胞粘附聚合物的方法，日本专利出版物H11-151086中报道的将硅化合物的非细胞粘 附表面固定到细胞粘附基质上的方法，及形成具有底表面的微孔的方法，其中所述的具 有底表面的微孔由具有光固化树脂形成的细胞粘附表面的基质形成。
用来形成微孔的光固化树脂可以是任何树脂，这些树脂一旦固化就会呈现低细胞粘 附性和充足的细胞容量。但是也可以包括，比如，日本专利出版物H10-168165报道的 环氧丙烷化合物，环氧基化合物，阳离子型光聚合物引发剂的光固化树脂。
在具有非细胞粘附表面的基质上形成的细胞粘附表面的形状和大小以及暴露在具 有细黏附表面的基质上的图形化的细胞粘附表面的形状和大小没有特别的限制。对排列 的单个细胞来说，优选细胞粘附表面的大小为20平方微米-400平方微米，或对排列的 含有至少两种细胞的细胞群来说，优选细胞粘附表面的大小为200平方微米-1000平方 微米。细胞粘附表面的形状可以是圆形或长方形。
本发明采用的排列细胞的基质可以是，如陪替氏培养皿、培养瓶、封口细胞培养器。 为维持细胞的生存能力并阻止外界污染，优选封口细胞培养器。封口细胞培养器可以具 有使培养液循环的结构或装置。
下面介绍通过鉴别位于基质上的单个细胞或细胞群中的非靶细胞或含有非靶细胞 的细胞群，并用激光选择性照射非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群所排列的位置或区域 以分离靶细胞的方法。
根据细胞的大小或形状或用细胞标记物，从排列在基质上的单个细胞或细胞群中识 别非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群。于是，非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群所在的 位置就会被识别出来。
根据细胞大小或形状或用细胞标记物进行鉴别可以用显微镜观察或用荧光标记细 胞的荧光显樣i镜观察进行。
根据细胞的形状和大小进行鉴别时，根据显微照片或荧光标记细胞的荧光显微照
片，细胞的形状有圆形的，纺锤型的，stone-flagged，或树状的。利用显微照片或荧光 标记细胞的焚光显微照片，根据细胞的主轴或短轴或其组合，来鉴别细胞的大小。
在用细胞标记物鉴别细胞时，可以使用在非靶细胞中选择性结合标记物分子的抗 体；用肽，凝集素，糖链等等直接或间接进行荧光标记；或用选择性结合非靶细胞的细 胞膜的色素。
由于用细胞标记物进行鉴别需要一个允许标记分子去识别细胞的步骤，所以优选利 用细胞的大小和形状进行鉴别。当以细胞大小和形状来区分细胞的时候，用图像分析软 件等等可以更准确的进行定量测定。
所观察的单个细胞或细胞群的影像可以通过CCD照相机捕捉，然后再传给个人计 算机等图像处理器。通过利用获得的基质上细胞所在位置的点作为参照位点，就识别出 参照位点处的单个细胞或细胞群是否是非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群。将这些信息 直接传输到激光辐射设备或存储设备中。在CCD照相机捕捉的图片中，根据所用CCD 元件的视野的识别范围和细胞所在基质的大小，反复进行图像捕捉和并将图像数据传给 图像处理器，直到细胞所在基质的全部区域被扫描。该反复过程可以通过在X和Y方 向上移动放基质的载物台进行，也可以在X和Y方向上移动包括CCD照相机的图像处 理器，或以上两者的组合来实现。
在本发明中，囟素灯，发光二极管和激光二极管的透射光都可以作为影像观察的光 源，而卣素灯，发光二极管和激光二极管也可以作为荧光影像观察的光源。为了获得荧 光影像，可以用吸收滤光器或分光计除去一定波长的散射光，但不包括用于观察的荧光。
接着，根据图像处理所获得的基质上的细胞信息，激光选择性照射非靶细胞或含有 非靶细胞的细胞群来杀死非靶细胞或《)起非靶细胞的功能性障碍。
激光辐射可以采用对非靶细胞或含有非靶细胞的细胞群所在位置进行点辐射，或根 据非把细胞或含有非革巴细胞的细胞群所在区域的图形进行激光图形化辐射。
激光通过透镜系统可以传给个人计算机这样的图像处理器或任意传给储存装置，并 作用于非靶细胞或非靶细胞所在的位置。
激光点辐射中，点的大小可以根据所用基质上细胞或细胞群的粘附表面上的细胞， 用复合透镜系统进行调节，以便激光照射细胞或细胞群整个粘附表面。
通过移动承载细胞所在基质的二维载物台，激光柱扫描用电镜如电控光束扫描镜， 或其结合使用，可以对基质上的所有非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群进行激光福射。 在使用电镜的激光柱扫描中，日本专利出版物H4-334544报道用电镜(电控光束扫描镜) 可以让激光辐射更有效率。优选电镜(如电控光束扫描镜)和扫描透镜(如ffi透镜) 结合使用，因为这样可以使激光扫描更广泛，也可以消除或减少移动承载基质的载物台。
使激光进行图形化辐射便于同时辐射多个非靶细胞或多个非靶细胞占据的区域，因 此可以提高对非耙细胞或包括非靶细胞的细胞群辐射的效率。在不移动承载基质的二维 载物台的情况下使激光进行图形化的辐射，优选用电控光束扫描镜(或电控光束扫描镜 和份透镜的组合)对比较大的区域的细胞进行处理。
根据本发明，为了使发射的激光形成图形，采用了 一个包括一 系列反射镜且每个反 射镜都可以独立进行角度调节的单元(如数字微镜器件DMD )，和一个通过改变光的相 位控制激光强度的空间光调度单元， 一个液晶滤光镜等等。
本发明中，将照射非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群的激光强度调节到足以杀死细 胞或引起细胞功能性障碍的能量强度的程度，同时激光又不影响临近的靶细胞或靶细胞 群。
本发明中所用的激光光源可以是具有足够激光强度的准分子激光器，固态激光器， 半导体激光器，但不限于此。由于脉冲激光辐射可以诱导多光子吸收从而导致非线性光 效果，引起细胞的局部光反应，并增加杀死细胞或引起其功能性障碍的效果，所以激光 光源优选脉冲激光。并且高重复的激光光源适宜于提高处理效率。
为了获得该多光子吸收过程，所用激光的脉冲宽度一定要比光能转换成分子热能的 时间短。由于时间范围采用的是数十纳秒到数百皮秒，因此激光脉冲的宽度上P艮优选十 纳秒或更少，更优选5纳秒或更少，最优选l纳秒或更少。下限优选50fs或更多，更 优选100fs或更多。
虽然为提高处理效率优选采用高重复频率脉冲激光光源，但重复频率在20千赫兹到50千赫兹是合适的，因为在更高重复频率下每个激光脉冲的峰值功率是下降的。
鉴于此，理想的激光的输出功率为1-20瓦，脉冲带宽为100fs到10纳秒，及重复 频率为20-50赫兹。
作用于细胞或细胞群的能量可以通过激光辐射时间和激光的输出功率来调节。更优 选光阀用于控制激光的辐射时间。
声光调节元件(AOM)能够以大约30-50赫兹的最大频率高速处理样品，该频率比 激光的重复频率更快。因此，杀死细胞或31起其功能性障碍的处理速度取决于激光光源 的重复频率。
同时，所用的激光的波长优选300到1100纳米，但是不局限于这个范围。采用400 纳米或400纳米以上波长的激光的情况下，将吸收该波长光的化合物如色素加到细胞培 养液中能更有效的杀死细胞或引起细胞功能性障碍。作为一个非限制性实施例，在激光 采用波长为532纳米的时候，可以加入诱惑红。
另外，可以通过光学元件来调节所用激光的强度。例如，可以采用中强度滤光镜， 1/2入波长光板与偏振光分束镜的组合，或声光调节元件(AOM )。
在采用中强度滤光镜的情况下，为了允许激光衰减，将其放在激光的光轴上，中强 度滤光镜采用吸收或反射一定量的光的材料制成，并且除了激光强度，它不会影响激光 的其他成分。
在采用1/2入波长光板与偏振光分束镜的组合的情况下，1/2 A波长光板可以用来改 变线性偏振-激光的偏振方向，且分束镜用于改变发射束与反射束间的分离比率，从而 改变激光的强度。
在用声光调节元件(AOM)的情况下，声光调节元件在元件中产生一个折射率的 压缩波，该折射率由元件(超声波)提供的调节信号决定。压缩波用做衍射光栅通过调 节超声波的强度来改变引起衍射光的强度。让激光通过元件进行传输，并补偿衍射光， 可以得到一定光强度的激光。
这样就可以选择性杀死非靶细胞或引起其功能性障碍，从而分离靶细胞。
如果有必要，已经杀死或引发功能性障碍的非靶细胞的细胞群体可以在靶细胞适宜 的条件下培养，以获得靶细胞。
下面，介绍本发明的细胞分离设备。
本发明的细胞分离设备包括一 个在基质上定位单个细胞或含有至少两种细胞的细 胞群的装置， 一个根据细胞大小或形状，或者根据细胞标记物，区别非靶细胞或包括非
靶细胞的细胞群与靶细胞或包括靶细胞的细胞群的装置， 一个将激光照射非把细胞或细 胞群的位置或区域的装置。
如果需要，细胞分离装置可以包括一个整体控制上述装置的装置。
依据非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群的排列形状，为了使激光照射已鉴别出的非 靶细胞或包括非靶细胞的细胞群所在的位置，该细胞分离装置优选包括一个根据细胞排 列形状使发射的激光形成图形(patterning)的设备，并将激光同时照射多个非靶细胞或 含有非靶细胞的细胞群。
根据细胞或细胞群的排列形状，当所述的装置使激光照射被识别出的非靶细胞或含 有非靶细胞的细胞群的位置的时候，细胞分离设备优选包括一个装置，该装置含有一个 使发射出的激光形成一定形状的元件和一个使成形的激光反射的元件，该设备还包括一 个由扫描透镜组成的使反射激光聚焦在细胞或细胞群所在位置的装置。
图1,根据本发明的细胞分离设备的一个实施例。
细胞分离设备由四个系统组成(1 )细胞观察系统；(2 )激光光源和光学系统；(3 ) 细胞操作系统；和(4 )控制系统。
上面提到的定位细胞的装置，区别细胞的装置与实施辐射的装置分别对应于(3) 细胞操作系统，(1)细胞观察系统与(2)激光光源和光学系统。
细胞观察系统(1 )包括用于观察细胞的显微镜，且显微镜带有捕捉显微影象的CCD 照相机。显微镜也包括透射光源和用来观察荧光标记细胞的焚光光源。CCD照相机捕 捉的影象传给个人计算机，计算机将非靶细胞与靶细胞区分开，以确定非耙细胞所在的 位置或区域。细胞观察系统包括一个电控基质载物台，可以观察整个基质上的细胞。
激光光源和光学系统(2)包括一个通过辐射杀死细胞或引起其功能性障碍的具有 足够输出功率的激光光源。当需要的时候在光轴上安装一个光阀以应用激光。激光通过 电控光束扫描镜进入显微镜，以将聚焦的激光照射显微视野中任何已识别的位置。电控 光束扫描镜是一种电镜。这可以让聚焦激光的辐射位置进^^黄向和纵向扫描。另一方面， 在显微镜视野中的焦点位置的聚焦激光的焦点位置和光斑尺寸可以通过显微镜外部的 透镜来控制。
在细胞操作系统(3)中，细胞接种于在非细胞粘附表面具有细胞粘附表面图形的 培养瓶中，且细胞在该图形上排列。电动载物台可以在X和Y方向移动培养瓶，让激 光照射含有细胞的培养瓶的整个区域，所述细胞排列在所述图形上。含有排列的细胞的 培养瓶可以与一个泵连接来供应，回收或循环细胞接种液、培养液、细胞回收液等等。
配置控制系统(4 )来获得观察到细胞的图形并识别每个图形化区域的靶细胞和非 靶细胞。通过控制电控光束扫描镜的角度和显微镜外部透镜的位置，可以将激光照射非 靶细胞所在的区域。控制系统也可以设计成控制光阀和光源的强度。
图2表示根据本发明的细胞分离设备的另 一个实施例
细胞分离设备由四个系统组成(1 )细胞观察系统；(2 )激光光源和光学系统；(3 ) 细胞操作系统；和(4 )控制系统。
细胞观察系统(1 )具有一个用于观察细胞的CCD照相机和一个用于识别细胞的焚 光光源，因此在培养瓶中观察到的细胞的外观可以通过fB透镜(如扫描透镜)和一个电 控光束扫描镜识别。在不移动载物台的情况下，可以通过电控光束扫描镜进行大区域观 察。
激光光源和光学系统(2)采用一个透镜系统组合，该透镜系统包括一个用于确保 强度分布均匀的来自激光光源的放大激光光束的透镜和将激光光束变成平行光束的其 他的透镜。DMD元件或相位调节元件根据识别的图形化区域用来调节放大的均匀光束 的光束形状。这些成形光束通过电控光束扫描镜和份透镜可以同时辐射观察到图形化区 域中的所有被鉴别的区域。被电控光束扫描镜反射的激光光束通过fB透镜可以使激光光 束聚焦在细胞所在的平面。如果需要，可以在光轴上安装光阀来使用激光。
在细胞操作系统(3)中，细胞接种于在非细胞粘附表面具有细胞粘附表面图形的 培养瓶中，且细胞在该图形上排列。电动载物台可以在X和Y方向移动培养瓶，将激 光照射含有细胞的培养瓶的整个区域，所述细胞排列在所述图形上。含有排列细胞的培 养瓶可以与一个泵连接来供应，回收或循环细胞接种液、细胞培养液、细胞回收液等等。 在该细胞操作系统中，培养、观察和激光处理同时进行。
配置控制系统(4 )用来获得观察到细胞的图形并识别每个图形化区域的靶细胞和 非靶细胞，如稍后实施例l中所描述的。通过分析识别的结果，发射计算得到的光束模 型，这样激光就可以同时照射所识别的非靶细胞的区域。将这些计算的结果传给光束成 形生成元件，可以生成所用的特定图形的光束。为了看到所有的观察区域，可以利用电 控光束扫描镜，连续扫描能够识别的区域。这样既便于观察且激光辐射又不影响细胞的 状态。
发明效果
本发明的方法和设备，不需物理或化学处理细胞，通过从不同类型细胞群体的混合
细胞中选择性去除非靶细胞，可以高效率地分离靶细胞，由本方法和设备分离的细胞和 细胞群适于分析细胞的功能和基因，使用细胞分析试剂的功能以及使用细胞应用于医药 领域。
优选实施例
下文中，参考以下实施例将详细地描述本发明。但是本发明不局限于该实施例。 实施例1
如下所述，从骨髓细胞中分离间质细胞。
1 )通过骨髓穿刺法从日本白兔肱头骨获得的骨髓液与等体积含有1 u/mL肝素钠(清 水制药有限公司提供)的生理盐水(大冢制药有限公司提供)混合。然后上述混合物1200 转离心IO分钟，分离血细胞。
2)分离的血细胞加入含有oc MEM (Invitrogen 12571-063)的T-75培养瓶(IWAKI 3110-075)中，并补充15 o/。胎牛血清(Invitrogen 10099-141)和抗生素-抗真菌试剂 (Invitrogen 15240-062)。血细胞培养两天后，仅分离出粘细胞。
3 )将得到的粘细胞分散在a MEM中。接着将这些细胞加到光固化复合树脂(D-MEC SCR950)微孔的玻璃材料基质上，并继续培养12小时，该微孔直径100微米。
4) 洗掉微孔外的非粘细胞后，在微孔中加入荧光染料藻红蛋白(PE )标记的抗CD34 抗体。然后含CD34阳性细胞的微孔通过荧光观察鉴别，接着355纳米激光辐射这些微 孔。激光强度是155瓦/平方厘米且激光辐射微孔的整个区域10秒钟。激光辐射后，用 锥虫蓝染色试验测试细胞的活性，结果表明微孔所有被辐射的区域中，细胞被杀死了 。
5) 激光辐射后，基质用PBS緩冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)冲洗，以去除被杀死 细胞的碎片。用胰蛋白酶处理后，回收没有被辐射的细胞。将回收的细胞加入含有a MEM (Invitrogen 12571-063)的T-75培养瓶(IWAKI 3110-075)中，该a MEM (Invitrogen 12571-063)加入了 15 %的胎牛血清(Invitrogen 10099-141)和抗生素-抗真菌试剂 (Invitrogen 15240-062)。细胞培养两天后，以获得对软骨再生有用的间质干细胞。
工业适用性
本发明的方法和设备，不需物理或化学处理细胞，通过从不同类型细胞群体的混合 细胞中选择性去除非靶细胞，可以高效率地分离輩巴细胞。通过本方法和设备所分离的细 胞或细胞群适于细胞的功能和基因的分析，利用细胞分析试剂的功能和使用细胞应用在 医学领域。


图1显示了根据本发明的细胞分离设备的构造实施例；和 图2显示了根据本发明的细胞分离设备的构造实施例。
权利要求
1.细胞分离方法，包括将单个细胞或包括至少两种细胞的细胞群置于基质中的某些位置处；根据单个细胞或细胞群中的细胞的形状或大小，或利用细胞标记物，将非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群与靶细胞或包括靶细胞的细胞群区分出来；及将激光照射所述的非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群所在的位置或区域，以选择性杀死所述的非靶细胞或使所述的非靶细胞产生功能障碍。
2. 细胞分离方法，包括将单个细胞或包括至少两种细胞的细胞群置于基质中的某些位置处；根据所述的单个细胞或细胞群中的细胞的形状或大小，或利用细胞标记物，将非靶 细胞或包括非耙细胞的细胞群与靶细胞或包括靶细胞的细胞群区分出来；将激光照射所述的非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群所在的位置或区域，以选择性 杀死所述非乾细胞或使所述的非靶细胞产生功能障碍；及仅选择性培养所述的乾细胞。
3. 细胞分离设备，包括用于将单个细胞或包括至少两种细胞的细胞群置于基质中某些位置处的装置； 根据所述的单个细胞或细胞群中的细胞的形状或大小，或利用细胞标记物，用于将非耙细胞或包括非靶细胞的细胞群与靶细胞或包括靶细胞的细胞群区分出来的装置；及用于将激光照射所述的非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群所在位置或区域的装置。
4. 根据权利要求1或2所述的细胞分离方法或根据权利要求3所述的细胞分离设 备，其中所述的单个细胞或包括至少两种细胞的细胞群位于细胞粘附表面上，所述的细 胞粘附表面在基质的非细胞粘附表面上排列成一定的形状。
5. 根据权利要求1或2所述的细胞分离方法或根据权利要求3所述的细胞分离设 备，其中所述的单个细胞或包括至少两种细胞的细胞群位于微孔中，所述的微孔具有暴 露的细胞粘附表面。
6. 根据权利要求3所述的细胞分离设备，还包括一种装置，所述的装置根据所述 的非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群的排列形状，使发射出的激光形成相应的形状照射 被识别的非乾细胞或包括非乾细胞的细胞群所在的位置，并且使激光同时照射多个非靶 细胞或包括非靶细胞的多个细胞群。
7. 根据权利要求3或6所述的细胞分离设备，还包括一装置，所述的装置含有使所述的发射出的激光形成一定形状的元件和使所述的成 形的激光折射的元件；一装置，所述的装置含有使所述的折射的激光聚焦在非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群所在位置的扫描透镜；其中，上述两种装置根据非靶细胞或包括非乾细胞的细胞群排列形状用于将激光照 射被识別的非靶细胞或包括非乾细胞的细胞群所在的位置。
8.根据权利要求1或2所述的细胞分离方法或根据权利要求3所述的细胞分离设 备，其中所述的用于照射细胞的激光是脉冲激光。
全文摘要
本发明提供了选择性分离靶细胞的方法和细胞分离设备，其中所述的分离方法是从由不同类型细胞构成的细胞群中选择性去除非靶细胞实现的。选择性分离靶细胞的方法包括将由不同类型细胞构成的细胞群以单个细胞或含有两种或更多种细胞的细胞群置于特定二维坐标系中，然后根据细胞的形状或大小，或利用细胞标记物，区分被固定的单个细胞或细胞群中的细胞，用物理能量特别是激光束照射非靶细胞或包括非靶细胞的细胞群所在的位置或区域，以选择性杀死非靶细胞，或使非靶细胞产生功能性障碍，以及所使用的设备。
文档编号C12N5/00GK101208426SQ20068001162
公开日2008年6月25日 申请日期2006年2月17日 优先权日2005年2月18日
发明者丹羽英夫, 佐藤節哉, 小林明, 松本由多加, 勇 王 申请人:阿不赛斯株式会社