专利名称：：一种生产生物工程化形式的组织型纤溶酶原激活因子的方法—种^生物工程化形式的组织型纤^ai原g因子&^发8胸域本发明涉及用于^可溶形式的人组织型纤原激活因子变体的重组方法。在该鄉中，内源组织邀纤溶酶原鹏因子的03位苏氛酸被天门冬繊替换，以出现新的糖Sifc位点。内源组织型纤目原激活因子in位的天门冬鹏被谷氨繊鄉'从而除去N连接糖靴位点。在296-299位，赖氨酸、组氨酸、皿酸和^M酸被四个丙氨酸皿。本发明还涉及编码组织型纤溶酶原激活因子的核酸序列的从头合成，将构建的核酸序列转,感受态细菌并将其亚克隆进哺乳动^ii^体以表达期望的蛋白质。包括与目的基因结合的控制元件的DNA构jt体已被公开。本发明的重^Aia织型纤溶酶原激活因子、及其盐和功能性衍生物可以构成治疗心发作和中风患者的药物组合物的活性成分。这些组，是本发明的另一个方面。发明背景纤自原激活因子是活tt^T溶酶原以产生丝氨酸蛋白酶活性的纤溶BIC纤维蛋白)的酶。在被研究的纤溶酶原激活因子之中，有,酶、尿'^0人组织型纤溶酶原^因子(t-PA)。这些纤,原^S因子各自的作用机制是不同的。^^酶与纤,原形成复合体而产生纤溶酶活性，尿激H直接剪切纤^il原，而t-PA是与纤维蛋白和纤溶酶原形^H^复雜，在血^fe置处活化纤溶酶原。组织邀纤繊原鹏因子(t-PA)，一种多繊域、糖基化的丝氨酸蛋白私是纤维蛋白特异的纤溶酶原激活因子和非常有效的溶栓剂。t-PA是一种重组蛋白，主要应用于心脏病发作和中风患者。最早于1979年，就将娜述为一种重要和有效的治疗各种血管疾病的生物药物，因为它的高纤维蛋白##性和体内有效的溶解血块能力。天然t-PA的半衰期大约为6，iEH短。因为它被1^Mi环系统清除，t-PA必^^以蹈iJ離效果。以提高浓度的t-PA織给药(fiontloadeddosing)显示出比标准输注方^快更完全的溶解，而早期的有效性与改善的存活率相关。推射可以进一步提髙溶解速率，因为这样能使较高浓度的酶快速与目标血^S触，但是因为清MS过快，天然^tJ生戰wt)t-PA的单一ffi^给药并不能被普ii^ffl。很多研究者^出了更长半衰期的t-PA品种，鹏t-PA可以推注给药，但^^i见绝大多数3^体的纤维蛋白t解活性新!显著下降。这样，本发明的目的是提供重组方法，用于^在保留全部溶纤活性的同时具有减小的清除速率的^，在t-PA的不同结构域做了系统^研究。i物还对新近形成的血栓有高特异性以及更强的亲和力，并且产生较少的循环性纤溶酶。因此，ICH和其它非脑部出血事件的发生率也会更低。織对PAI-I具有抗性并S^低。本发明涉及用于生产可溶形式的人组织型纤，原激活因子变体的重组方法，在该变体中，内源的组织型纤溶酶原^^因子103位的苏氨酸駄门冬酰胺魏以产生新的糖基化位点。内源的纟Hi尸邀纤娜原麟因子117位的天门冬鹏被谷氨鹏鄉，以去除N驗糖靴位点。在296-299位，赖氨酸、组氨酸、)ItM^和麟酸被四个丙氨酸鄉。本发明一，定方面涉及,组织逸纤溶酶原激活因子的核酸序列的M合成、将构建的核酸序列转化进感受态细菌并将其亚克fta晡乳动物^载体以^ii期望的蛋白。本发明的再一个方面提供了并入了本发明DNA序列的新的具生物功能的环形质粒DNA载体，以及以所述载ffil定转化^染的宿主。本发明相^J&提供了生产有用多肽的新方法，包縱有利于夕卜源的、质粒携带的DNA膀i汰规模表达的劍牛下培养这类转化宿主细胞，特别是哺乳动物细胞，^&M培养基、溶胞,鄉鹏组分中分离期望的多肽。附图和序列详细说明图1.编码组织型纤溶酶原激活因子的未经优化和经密码子优化形式的DNA核苷,列的Bfl^序子J对比图2.M合成的TENECTcDNA(^"成的TNK-tPA)与TNK-tPA基因的确，列的序列对比图3.从头合成的TENECT-OptcDNA(合成的TNK-tPAOpt)与TNK-tPA-Opt基因的确i^列的序列M图4:5!i^纯化的TENECT、TENECT"Opt和pcDNA3.1D/V5-His的限制性酶切片段o图5:限制性酶切分析pcDNA3.1-TENECTD/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1-TENECTOpt/V5-His/TNK"tPA"Opt的假定克隆。图6:使用内部剪切TENECT和TENECTOptcDNA的酶，对PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和PcDNA3.1-TENECT"Opt/V5-His/TNK4PA-Opt克隆的限制性酶切分析。图7.结构图PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA图8.结构图PcDNA3.1-TENECT"Opt/V5-His/TNK-tPAOptSEQID.Na1.^重组组织型纤^SI原激活因子的1^酸序列SEQID.No.2.綱重组组织型纤鹏原鹏因子的经^f^化形式的蹄鹏列发明详细说明对于在高等真核系统中表达重组蛋白的几种方法已有阐述。CHOK1、HEK-293(及其变体)细自达系^L已确立为哺孚,蛋白^ii的t^系统。^^建的^:化、可选标记的选^n基因打ia&高通，选策略的进步使得建立具有高特异性产量的重组细胞系变得比较普通，也节约了培养细M所需的时间。在使用传统的基于病毒启动子的^i载体的表达ifc^上的最新ia^^a括使用内部核糖体iaA位点(IRES)序列或可变剪接的柳顷反子^i策略的发展和优化。实施例1綱组织型纤溶酶原激活因亍的DNA序列由从头合成方法得到。该方法可更有利于就特定细胞系iSt;^的^^W:化。并且，使合成的DNA成为真銜原綠达的对象，提供可分离量的多肽，该多肽表现出天然产生的t-PA的生物争顿以及t-PA在体内和体外的生鹏性。编码重组组织型纤溶酶原激活因子的核苷酸序列(TTENECn)如SEQID.No.l中所示。组胃纤,原激活因子的编码DNA序列中的密码子已经作为密码^^^a程的一部分被改变，以鹏在撤BCHOKl和HEK293的哺乳动物细胞系中优化的重组蛋白表达，这些经改变的密码子用大写宇母高亮显示。SEQID.No.2彰$编码组鄉纤溶酶原鹏因子的经密码:？^;化的核苷酸序列CTENECT2)编码组织型纤溶酶原激活因子的未经优化和经密m^c化的核苷,列的TO序列对比如图1所示。实施例2:确i^^^R型纤溶酶原激活因子的从头合成的cDNA的真实性商4kM务提供商所提供的从头合成的cDNA的真实性MilDNA自动测序进行确认的，,结果描述在图2和3中。实施例3:将TENECT和TENECT-OptcDNAs亚克隆进pcDNA3.1D/V5-His哺乳动物细胞特异表达载体在如预示鹏DNA自动领!l序以^iJE从头合成的cDNA分子(TENECT和TENECT-Opt)的真实'ft^后，TENECT和TENECT-Opt被分别亚克,哺乳动物细胞特异表达载体pcDNA3.1D/V5-His,生^ffl于转染的构建体。采用的方法详述如下A.试剂和酶1.QIAGENOT^鹏剂盒和PCR纯化试齐愴2.pcDNA3.1D/V5曙His载体DNA(Invilrogen)酶供应商U/pll.BamHIBangal加GCTei10缓冲液E2.XholBangaloreGenei10缓舰E3.HindmBangaloreGoiei20缓械E4.XholBangaloreGend10缓ME5.T4DNA连接酶Bangal鹏Genei40连接麟冲液所有的反应都按制造商建腿行。在針鹏中，提供的10X^z^冲液都被稀释成为最终^IX。B.载体和插A^列的限制鹏切步骤^ffi以下的DNA样^叩艮审胜酶；DNA样本限制鹏Rxn#l载浙用于TNK-tPA克隆)BamHI/XhoIRxn#2载辦用于TNK-tPA-Opt克隆)Hin孤/Xho1Rxn#3pBSK/TNK-tPA(#5)BamHI/XholRxn#4pBSK/TNK-tPAOpt(#18)HMH/Xhol參限帝,切反应组分终浓度RnMRn3Bnff4将MiS物混合、离心并在37t:孵育2小时。限制鹏切7^由琼月11鹏电泳分析。观察到期望的酶切图谱，其以被切下的约1700bp(对于Rxn弁3和4〉基因片段为特征，并BJd察到约5.5kb的载体骨架片段(Rxn#1和2)。>fTENECT和TENECR)ptcDNAs的约1700bpDNA片Sffla^fflQIAGEN^^提试剂盒的抽提法分别纯化。pcDNA3.1D/V5-His哺？L动物表达载体酶切后的约5.5kb载体骨架也用同样的试剂盒纯化。^需cDNA和载体DNA片段的限制腾切和凝^tl取后，各取一份0-2微升)纯化DNA样品用琼月識电泳检査纯度和完整性，如以下图4所示C.pcDNA3.1D/V5-His骨架与TENECT和TENECTOptcDNA的^:4體经酶切并魂化的载^f入片段的DNA浓度(参考上面图4)，连接按以下方式设定_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将S/S鄉和地混合、离心并温魏育2-3小时。以连接^Z混糊内容物转化DH10感^^态细胞。D.限制性酶切分析pcDNA3.1-TENECT/V5-HisAMC-tPA和dcDNA3.11>TENECT^Qpt/V5-Hi&nrNK-tPA-Qpt的f^克隆。分别从在錄节青霉素的LB琼脂糖平板上获得的克隆中纯,粒DNA,并fflil限制自切分析分离的质粒DNA,以确认期望的cDNA插入片段的存在，如图5所示。按照限制性酶切几个带有pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1-TENECTOpt/V5-His/TNK-tPA"Opt的假定克隆后所得到的结果，选出一些表现出期望限制性模式的克隆用于进一步的限第化:tBSM析，该限制性酶切分析使用内部切割TENECT和TENECTOptcDNA的P艮制性酶以产生不同大小的片段，如图6所示。基于已知的限制性内部位点，大多数选出用于限制性酶切谱分析的PcDNA3.1-TENECT/VS-His/TNK-tPA和PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK曙tPA^Opt克隆鹏到了预期的片駄小，因此鹏克隆将用DNA测序分析进一步确认。^ffl从头合成的TENECT和TENECT-OptcDNA构建的重组^ii载体图如图7和图8所示。实施例4:人t-PA构Jt体的保^增殖^f马人t-PA的cDNA构建体的保存与增殖是在标准细菌iS^中进行。所有克隆时H"油菌(glycerolstock)均维持和保存在-70r。实施例5:CHCMC1细胞中重组蛋白的瞬B寸和稳^ii。使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO),—种FDA认可的用于^^治疗用蛋白的哺乳动物细胞系，ia行人t-PA的瞬时和稳定表达n瞬时^Ji可用于^i构建体表达和快速^f小量的重组蛋白。顿像体外生测或EUSA等施筛选表达t-PA的稳定转她选择驗的生产细胞。同质稳定细胞系可用克降稀释^择，然后进fi^扩增和冻存-。^m像Western印迹、ELISA和功能翻瞎方￡12—步分析蛋白^Ei情况。实施例6:重组纟fl^M纤溶酶原^因子的纯化按照管理机构指南粒过量表舰需重组蛋白的无污染细胞系之后，纯化策略将以步骤经济、加速上市、可扩展性(scalaMity)、可重现性和最大产品纯度为目标，而功能稳定和结构完整为主要目标。为了到达这一效果，可开发带有过敏常规和切向流过滤)和层析这二者的的组合方案。工艺合^求和验收标准,究WE3,品中实施。，步骤要求和验收标准的研究^3品中实施。tam本发明考虑了鹏娜呈中禾鹏身为改辦^^J以下步膝a."(OT常^^切向流步^t粗培养基进行初步纯化和^Sb.超漱透wa救基于切向流过銜c.色谱步骤-I:利用肝素、赖氨酸、金属(銜螯合物Sepharose和固定至Sepharose的多克隆抗体进蹄合层析。更雌的是，在下游单元操作鄉麟酸Sepharose。e.色谱步骤-n:OTDEAE纤维素进行阴离子^M析f.除病毒和无菌过滤g.除去内毒素注意另外，基于流出物的阴离子交船ij，如硫酸cellufine可鹏于工艺污,、内原tt/外来病毒和柱可提取物的选择性结合。实施例7:鹏生物化学、M和物理化^4确认目标蛋白身份舰二娜甲酸方缺CA)/Bradford染料结合方法测定^"^总蛋白质的回收率-在纯化針阶段目标蛋白浓度将被例ffl!!l定，测定鹏高特异性和高可靠性的基于酶的^测定技术，比如^OT抗tPA的多克隆7单克隆抗体的捕获ELISA法，这些抗体以天然的序列t-PA作为标准。在^t步骤后，g进行定性的和目标蛋白特异性western分析。^M反相色谱法、等电点聚焦和双向繊电泳^i平价纯^品。顿远紫外圆二色谱进行二级结构分析。鹏^fR排阻色谱和MALDI-TOF检测分子量和低聚状态。该研究也注意蛋白质与pH和温度有关的稳定性。权利要求1.一种制备在体内具有生物活性的组织型纤溶酶原激活因子的方法，包括以下步骤(a)在合适的营养条件下培养用分离的DNA序列转化或转染的宿主细胞，所述DNA序列选自(i)SEQIDNo.1和SEQIDNo.2中列出的DNA序列，或(ii)与(i)和(ii)中定义的DNA序列或它们的互补链在严紧条件下杂交的DNA序列；(b)从中分离所述重组组织型纤溶酶原激活因子产物。2.—种制备在体内具有生物学活性的组织型纤溶酶原激活因子产物的方法，包括以SEQID.No.1或2中麻的编码W^纤溶酶原鹏因子的合成DNA序列转化宿主细WP从所述宿主细JKm其生长培养基中分离所^物的步骤。3.如权利要求1或2中的方法，其中所述宿主细胞是哺乳,细胞。4.如权利要求1或2的施，其中所述的宿主细胞雌CHOKl细胞。5.—种生产在体内具有治疗心脏病发作和中风的生物学性能的可溶形式的组织逸纤,原撒活因子的^，包括以下步骤a)在^i的营^f牛下i^i孚,细胞，^i孚L^^胞包含不同于组织邀纤,原、^S因子的启^DNA的启动子DNA,DNA可,b)纯,述细]达的所述糖基化的促红细胞素多肽。6.如权利要求5的方法，其中^M启动子DNA^毒启动子DNA。7.—种制备在体内具有生物学活性的组织型纤溶酶原激活因子产物的方法，包括用图7或8所示的载糊建條化宿主细胞并M^述宿主细鹏其生^^基中分离^组全KM纤^ai原^^因子^的步骤。8.如权利要求7的方法，其中所述载体是哺乳动物细胞特异表达载体，并fiSit^如图7和8所示的载体。9.—种药物组，，包含治疗有效量的人组织型纤溶酶原激活因子和药用稀释剂、佐剂纖体，其中所述织型纤娜原激活因子是从在^^l中生长的哺乳动物细化的。全文摘要本发明涉及用于生产可溶形式的人组织型纤溶酶原激活因子变体的重组方法。在该变体中，内源的组织型纤溶酶原激活因子的103位苏氨酸被天门冬酰胺替换，以出现新的糖基化位点。内源的组织型纤溶酶原激活因子117位的天门冬酰胺被谷氨酰胺替换，从而除去了N连接糖基化位点。在296-299位，赖氨酸、组氨酸、精氨酸和精氨酸被四个丙氨酸替换。本发明还涉及编码组织型纤溶酶原激活因子的核酸序列的从头合成，将构建的核酸序列转化进感受态细菌并将其亚克隆进哺乳动物表达载体以表达期望的蛋白质。包括与目的基因结合的控制元件的DNA构建体已被公开。在本发明中的重组人组织型纤溶酶原激活因子、及其盐和功能性衍生物可以构成治疗心脏病发作和中风患者的药物组合物的活性成分。这些组合物是本发明的另一个方面。文档编号C12N9/72GK101218344SQ200680019092公开日2008年7月9日申请日期2006年5月31日优先权日2005年6月2日发明者V·莫拉瓦拉帕特尔申请人:阿维斯塔金格兰技术有限公司