用于区分个体的方法、阵列、装置和测试系统的制作方法

专利名称：用于区分个体的方法、阵列、装置和测试系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用DNA序列信息的个体区分方法，进一步涉及用于个体区分测试(individual discriminating test)的阵列、装置和系统。

背景技术：
通过对人基因组核苷酸序列的几乎完全解码，已经清楚了个体之间和种族之间的序列差异及其频率。个体之间的差异研究在医药领域用于阐明药物的作用与副作用之间的关系。
基因组核苷酸序列中的差异也用于在刑事调查中鉴定个体。目前个体鉴定中主要应用的方法是基于DNA序列上重复序列的重复次数中的差异，代表性的是短串联重复(STR)和可变数目串联重复(VNTR)。例如，自2003年以来警方已经采用的一种方法是通过聚合酶链反应(PCR)扩增STR的9个位置和VNTR的1个位置，将扩增产物进行毛细管电泳，并通过其迁移率确定重复数目。
然而，在诸如STR、VNTR等的序列中，由几个核苷酸单位组成的恒定序列重复出现，关于上述10个位置，重复序列的全长为大约30-600bp。为了测量这种重复次数，需要目标区域保留在测试样品中而不被切除。然而，很容易想到在进行刑事调查的取样现场遗留的体液和血液痕迹或者在重大灾祸如火灾、爆炸、意外事故等现场遗留的样品已经被破坏。在这种情况中，DNA序列可能已经成为片段，未保留全部的目标区域。如此，在需要较长序列的使用重复序列进行区分的方法中，存在一个问题是所述测量在一些情况中较为困难，因区分的方法中，存在一个问题是所述测量在一些情况中较为困难，因此优选的是测试所需DNA区域尽可能短。
因此，本发明涉及一种近年来已经阐明的使用单核苷酸多态性进行个体鉴定的方法。例如JP-A2004-239766(KOKAI)描述了可以使用微阵列的DNA探针中的单核苷酸多态性以区分个体。然而其中未揭示明确的方法。另外，Lee HY等(Selection of twenty-four highlyinformative SNP markers for human identification and paternity analysisin Koreans.；Forensic Aci Int.2005 Mar 10；148(2-3)107-12.)揭示了可用于在韩国人群的个体鉴定及亲子鉴定中的24种核苷酸多态性。
然而，目前发现了大量单核苷酸多态性，对其未全部进行测试。然而，目前还没有关于何种单核苷酸多态性应该被测试的强有力确定标准。
本发明的一个目的是提供一种可以简便及快速地区分个体的方法，所述方法通过选择对于个体区分有利的单核苷酸多态性而进行。本发明还提供了用于个体区分测试的阵列、测试装置和系统。
发明描述 根据本发明，提供了一种个体区分方法，以确定个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性，所述方法包括在待区分对象个体所属的群体中存在的单核苷酸多态性的组中选择多种单核苷酸多态性的步骤，以及确定对象个体具有的核苷酸序列及来自样品的核苷酸序列中所选择的多种单核苷酸多态性的基因型并通过对比基因型区分个体的步骤，其中在选择步骤中选择符合如下(i)-(iii)中任一条件的单核苷酸多态性 (i)在2核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定2个可能的核苷酸各自的等位基因频率是X和Y，X+Y＝1且Y≤X； 0.5≤X≤0.7； (ii)在3核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定3个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X； 1/3≤X且(1-X)/2≤Y且X+Y＜1；及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9；以及 (iii)在4核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定4个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X； 1/4≤X且(1-X)/3≤Y且X+Y＜1；及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
在此，X优选为0.55≤X＜0.7，更优选为0.6≤X＜0.7，更优选为0.65≤X≤0.68。
根据本发明的另一方面，提供了在个体区分测试中使用的阵列，其中核酸探针固定在基材上，用以确定个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性，所述阵列特征在于核酸探针具有与含有单核苷酸多态性的靶序列互补的序列，所述单核苷酸多态性选自待区分对象个体所属的群体中存在的单核苷酸多态性的组，并且符合如下(i)-(iii)任一条件 (i)在2核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定2个可能的核苷酸各自的等位基因频率是X和Y，X+Y＝1，Y≤X； 0.5≤X≤0.7； (ii)在3核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定3个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X； 1/3≤X且(1-X)/2≤Y且X+Y＜1，及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9； (iii)在4核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定4个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X； 1/4≤X且(1-X)/3≤Y且X+Y＜1，及 (a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
在此，X优选为0.55≤X＜0.7，更优选0.6≤X＜0.7，进一步优选0.65≤X≤0.68。
附图简述

图1A示出2核苷酸取代类型SNP的等位基因频率与基因型频率之间的关系。
图1B是图1A中的最大基因型频率与最小基因型频率。
图2示出3核苷酸取代类型SNP的等位基因频率与基因型频率之间的关系。
图3示出4核苷酸取代类型SNP的等位基因频率与基因型频率之间的关系。
图4示出计算存在概率(existence probability)的实例。
图5是示出个体区分测试系统的整体构造示意图。
图6A示出关于第一个实施方案的芯片夹(chip cartridge)的详细构造。
图6B示出以B-B方向所见的图6A的视图。
图6C示出以C-C方向所见的图6A的局部透视截面图。
图6D示出以D-D方向从后面所见的图6A的视图。
图7示出在用上盖固定螺丝固定之前芯片夹上的支持物和盖子。
图8示出在其上包装有个体区分芯片的印刷电路板的详细构造。
图9A示出第一个实施方案的小池(cell)以及与小池连通的药物供应系统。
图9B是图9A的俯视图。
图9C是图9A的局部视图。
图10A示出小池附近每个组成元件的详细构造。
图10B示出芯片夹上盖固定在芯片上的外观。
图11是第一个实施方案的小池的俯视图。
图12是第一个实施方案的小池其它实例的俯视图。
图13A是生产个体区分芯片和印刷电路板过程的截面图。
图13B是图13A随后图示。
图13C是图13B随后图示。
图13D是图13C随后图示。
图14是个体区分芯片(individual discriminating chip)的俯视图。
图15示出第一个实施方案的流动系统的一个实例。
图16示出使用流动系统进行个体区分测试的流动步骤的流程图。
图17示出第一个实施方案的测量系统。
图18示出先前的恒电位仪。
图19示出分析测量数据的程序的一个实例。
图20示出类型确定过滤处理的流程图。
图21示出类型确定处理的一个实例。
图22是使用个体区分测试装置区分个体的自动化分析程序的顺序图(sequence view)。
图23A示出基因型检测实例的测量结果。
图23B示出基因型检测实例的测量结果。
实施本发明的最佳模式 本发明的一方面提供了一种区分个体的方法。在本说明书中，个体区分意味着确定个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性。例如，所述方法在刑事调查中可用于明确说明遗留的物品如残留的血液痕迹和毛发是否是嫌疑人或受害人的血液或毛发。因此，样品具有的核苷酸序列可以是这些遗留物品中含有的核酸序列，但不限于其。
如本文所用，术语“核酸”广义上包括核酸及核酸类似物如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、膦酸甲酯核酸、S-oligo、cDNA和cRNA，以及任何寡核苷酸和多核苷酸。这种核酸可以是天然存在的，或者可以是人工合成的。
在此，核苷酸序列优选是基因组DNA序列，或者可以是不保证是完全基因组的片段序列。另外，本发明的个体区分方法也可用于个人自身身份识别、亲子鉴定等，不限于这些用途。
在本发明的方法中，单核苷酸多态性(SNP)用于个体区分，特别是选择及使用在个体区分中有利的SNP。这种SNP选择通过参考其等位基因频率进行。
在此，SNP是指基因组DNA序列中的一个核苷酸的差异，在指定群体中通常为1％或更高频率。在大多数情况中，在一个SNP位置，两个核苷酸之间发生取代，例如在一个个体中取代A(腺嘌呤)，在另一个体中发生G(鸟嘌呤)取代。这种SNP称作2核苷酸取代类型，在这种情况中在一个SNP位置有三种基因型。在上述实例中，存在A/A纯合、G/G纯合和A/G杂合三种基因型。
然而，也存在罕见的3核苷酸取代类型或4核苷酸取代类型SNP。在这些SNP中，存在6或10种基因型，所以仅在一个SNP位点即可有许多基因型。
这些基因型的出现频率可得自每个核苷酸的等位基因频率。等位基因频率是指在群体中某一SNP可出现的核苷酸的比率。即当群体中某一SNP是A或T任一核苷酸时，群体中出现A的比率为70％，T的比率为30％，A的等位基因频率X表示为0.7，T的等位基因频率Y表示为0.3。在此，因为X+Y＝1，因此这是2核苷酸取代，0＜X，0＜Y。
这种等位基因频率是通过测试相当数量的群体中包含的个体基因型并获得其频率分布状态而确定。目前，不同群体中等位基因频率由多个数据库公布，对不同分类如种族和民族的群体已经分别进行了研究。列出SNP的位置和频率的数据库的例子有HAPMAP、NCBIEntrez SNP、JSNP、TSC等。
在本说明书中，通过例如种族、民族、国家、居住地、性别、年龄等这些分类方法分类的个体组群称作群体。用于确定等位基因频率所调查的个体数目是适当的，如果高度可靠则可以使用任何数据库公布的等位基因频率，或者等位基因频率的调查可以单独进行。
如上所述，基因型频率得自等位基因频率。在上述SNP的情况中，基因型有AA纯合、AT杂合和TT纯合基因型，每个基因型的频率得自(X+Y)2＝XX+2XY+YY。即AA∶AT∶TT＝0.49∶0.42∶0.09。
在本发明的方法中，根据这些等位基因频率和基因型频率选择正确的SNP。在个体的核苷酸序列与样品的核苷酸序列中，确定选择的SNP中的基因型并进行对比。如果两种基因型完全一致，则可以确定所述样品源自所述个体。
另外，在本说明书中，个体可以是任何实体如除了人之外的动物和植物，只要该实体可以通过基因组DNA序列区分即可。优选的对象是人，另外可包括家畜和宠物，或者培育的植物或野生植物。
同时，据报道在人基因组DNA中存在大约1千万的SNP。尽管当尽可能多地测试SNP时，测试精确度明显增加，但是在简便性、快速和经济学方面显然测试少量SNP会更好。
本发明人发现可以根据如下条件选择在个体区分中有利的SNP，这样可以选择个体区分所需的最小量的SNP。选择SNP的条件(i)-(iii)在下文继续阐明。
(i)首先，解释在2核苷酸取代类型情况中选择SNP的方法。假设被取代的核苷酸为A和B，等位基因频率与基因型频率之间的关系示于图1A。在图1A中，随着A的频率增加，基因型AA的频率也增加。相反，随着A的频率增加，B的频率降低，基因型BB的频率也随着降低。当A的频率为0.5时，即A和B的频率相同时，基因型AB的频率为最大。
图1A中最大基因型频率与最小基因型频率示于图1B。如该图示出，在2核苷酸取代类型SNP中，在A的频率为0.66时最高基因型频率(MAX)的基因型具有最低基因型频率4/9，并且不再降低。另外，在A的频率为0.5时最低基因型频率(MIN)的基因型成为最大基因型频率，并在其周围降低。
在此，要考虑SNP具有的多少基因型频率是个体区分所需要的。在一定的SNP中，需要具有最大基因型频率的基因型频率尽可能地低。这是因为当最大基因型频率较高时，导致该群体中具有该基因型的个体较多，降低了区分所述SNP个体的能力。因此，为了保证最低限度的区分能力，优选具有最大基因型频率的基因型的频率为0.5或更低。
另外，需要具有最小基因型频率的基因型的频率尽可能地低。当这种基因型频率较低时，可以说这种基因型较罕见，可以说所述SNP具有极高的区分能力，是有用的SNP。
在此，核苷酸A和B各自的等位基因频率以X和Y表示。条件是X+Y＝1且Y≤X。另外，需要说明的是0＜X及0＜Y，从这些条件中0.5≤X。因此在图1B中，X中最大基因型频率(max)不超过0.5，使得0.5≤X≤0.7。因此，合适地使用其中等位基因频率为0.5≤X≤0.7的SNP。
如上所述，为了降低最大基因频率，需要X的数值接近0.66。然而，为了降低最小基因型频率，优选X的数值更大一些。综合这些条件，进一步优选的范围是0.55≤X＜0.7，更优选范围是0.6≤X＜0.7，最优选范围是0.65≤X≤0.68。
具有前述范围的X(等位基因频率)的SNP在区分能力中具有较好的平衡性，这种SNP可优选用于本发明的方法中。
(ii)其次，解释在3核苷酸取代类型情况中选择SNP的方法。如上所述在3核苷酸取代类型SNP中有6种基因型。因此，改善了通过一个SNP进行区分的能力，这对于区分个体是有利的。
进一步地，在2核苷酸取代类型中，最小基因型频率与最大基因型频率比率为4/9。因此，在3核苷酸取代类型中，可以通过选择具有较小基因型频率的SNP而选择在区分个体中更有效的SNP。
在此，假定被取代的核苷酸是A、B和C，其等位基因频率分别为X、Y和Z。在这种情况中，X+Y+Z＝1，Z≤Y≤X。因此，1/3≤X，(1-X)/2≤X，X+Y＜1。
此时3核苷酸取代类型中的基因型为X2、Y2、Z2、2XY、2YZ和2ZX。其中基因型频率可以是最大的基因型是X2或2XY。
(a)在2XY≤X2的情况中，即Y≤1/2·X，最大基因型为X2。如上所述，由于需要基因型频率小于4/9，因此X2＜4/9。因此，期望的等位基因频率为Y≤1/2·X及X＜2/3，选择这样的SNP。
或者，(b)在2XY＞X2的情况中，即1/2X＜Y时，最大基因型为2XY。如上所述，由于需要基因型频率小于4/9，因此2XY＜4/9。因此，期望的等位基因频率为1/2·X＜Y及XY＜2/9，选择这样的SNP。
符合上述条件(a)和(b)的X和Y的范围在图2中以斜线区域示出。具有这个范围等位基因频率的3核苷酸取代类型SNP是较2核苷酸取代类型SNP更有助于个体区分的SNP，可以说是具有高效力的SNP。
(iii)接着，解释在4核苷酸取代类型情况中选择SNP的方法。如上所述，在4核苷酸取代类型SNP中有10种基因型。因此，通过一个SNP进行区分的能力最高，可有利地用于个体区分。在4核苷酸取代类型SNP中，如3核苷酸取代类型SNP一样，通过选择具有最大基因型频率小于4/9的基因型频率的SNP，可以在个体区分中更有效地选择SNP。
在此，条件是被取代的核苷酸为A、B、C和D，其等位基因频率分别为X、Y、Z和W。在此，X+Y+Z+W＝1，W≤Z≤Y≤X。由此1/4≤X，(1-X)/3≤Y且X+Y＜1。
其中的基因型频率可以最大的4核苷酸取代类型中的基因型是X2和2XY。
(a)在2XY≤X2的情况中，即Y≤1/2·X时，最大基因型为X2。如上所述，由于需要基因型频率小于4/9，因此X2＜4/9。因此，期望的等位基因频率为Y≤1/2·X及X＜2/3，选择这种SNP。
或者，(b)在2XY＞X2情况中，即1/2·X＜Y时，最大基因型为2XY。如上所述，由于需要基因型频率小于4/9，因此2XY＜4/9。因此期望的等位基因频率为1/2·X＜Y及XY＜2/9，选择这种SNP。
符合上述(a)和(b)条件的X和Y的范围在图3中斜线区域示出。具有这个范围等位基因频率的4核苷酸取代类型SNP是较2核苷酸取代类型SNP更有助于个体区分的SNP，可以称作具有高效力的SNP。
可以搜索上述(ii)和(iii)示出的SNP，例如从国立生物信息中心的SNP数据库(NCBI)中登记的SNP中搜索。
希望的是从基因组的不同染色体中选择符合条件(i)-(iii)的SNP。当使用同一染色体上存在的SNP时，希望的是使用明显彼此不连锁的SNP，或者具有低概率的SNP。
另外，希望的是选择根据上述条件选择的多个SNP的组合，以便在从等位基因频率计算基因型频率中，i个所选择的单核苷酸多态性中的每一个，假定第n个单核苷酸多态性中最高基因型频率为 (Max)n，最低基因型频率为(Min)n，1/∏(Max)i和1/∏(Min)i分别为适当值。
例如，假定组成群体的个体数目为U，也可以如此选择SNP，以便当以与U的比率表示时，每个1/∏(Max)i和1/∏(Min)i均在适当范围内。1/∏(Max)i代表在选择的SNP组合中，具有最高概率的组合的个体以每1/∏(Max)i个人一个人(one person per 1/∏(Max)I persons)的比率存在。当1/∏(Max)i数值较低时，群体中存在许多具有所述SNP组合的个体，可以说SNP组合具有较低的个体区分能力。
另外，1/∏(Min)i表示在选择的SNP组合中，具有最低概率的组合的个体以每1/∏(Min)i个人一个人的比率存在。当1/∏(Min)i数值较低时，具有所述SNP组合的个体很罕见，可以说所述组合是具有高度个体区分能力的SNP组合。
经选择用于本发明个体区分方法中的SNP的数目i可以根据必需的区分能力确定，可以考虑到进行确定的简便性、快速、经济及可靠性加以确定。
在使用根据前述条件选择的SNP的个体区分方法中，进一步通过从等位基因频率计算对象个体具有的基因型频率，将所有选择的SNP的基因型频率相乘，取倒数，可以计算群体中存在的对象个体具有的基因型组合的概率。使用图4进行解释，当对象个体的基因型为1:CC、2:CC、3:CT、4:CC和5:TT时，各基因型频率的乘积是0.078×0.518×0.3942×0.314×0.2916＝0.001458，其倒数为685.7。因此，这个样品的基因型是在每686人中有1个人存在的基因型。
例如，在100百万群体中每10人中有1人具有的基因型情况中，即使当对象个体与样品的基因型一致时，它们是相同个体的可靠性也降低。相反，在基因型情况中，当对象个体具有的基因型是罕见的基因型时，确定的可靠性增加。因此，对于个体区分而言也尤为重要的是确定群体中的存在概率，并弄清确定个体具有的核苷酸序列与样品的核苷酸序列是否一致的可靠性。通过这个步骤计算存在概率，可以确定个体区分结果的可靠性。
在此对已经在上文详细描述的本发明的个体区分方法进行概括。首先，从要进行区分的对象个体所属群体中存在的SNP的组中选择符合上述(i)-(iii)任一条件的多个SNP。分别在对象个体具有的核苷酸序列和源自样品的核苷酸序列中确定所选择的多个单核苷酸多态性中的基因型。然后对比所述对象个体与样品的经确定的基因型，基于对比结果确定对象的核苷酸序列与样品的核苷酸序列一致与否。
可以通过熟知的方法确定对象个体与样品的核苷酸序列中基因型，例如通过聚合酶扩增反应扩增SNP位点及研究基因型的方法，以及分析DNA序列的方法。
通过使用根据本发明选择的SNP，可以在需要的可靠性范围内使用最小数目的SNP区分个体，可以简便而快速地进行测试，并且降低成本。
根据本发明的另一方面，提供了用于个体区分测试的阵列。本发明的阵列是将具有与靶序列互补的序列的核酸探针固定在基材上。在此，靶序列是指具有如下靶序列的核酸链，其含有选自要区分的对象个体所属群体中存在的一组SNP的符合上述(i)-(iii)任一条件的SNP。固定在基材上的核酸探针可以在适当条件下与靶序列杂交。
如本文所用，术语“互补”是50％-100％互补，优选100％互补。
固定在基材上的核酸探针可以是单一的核酸探针，或者多个不同的核酸探针。即可以固定这样序列的核酸探针，所述序列与具有分别含有不同的SNP的靶序列的靶核酸互补。
另外，例如在A和T这种2核苷酸取代类型的SNP中，与A的情况中的序列及T的情况中的序列互补的核酸探针均可固定在阵列上，或者仅固定一个序列的探针。相似地，在3核苷酸取代类型和4核苷酸取代类型的SNP中，可以使用相应于在各个核苷酸情况中的序列的探针，或者可以仅使用相应于意图被检测的序列的探针。就核酸探针的长度而言，可以适当选择适于固定于基材上及杂交的长度，所述长度可以比靶核酸的长度短。例如，所述长度可以是大约3-1000bp，优选大约10-200bp。
靶核酸是这样的核酸，其具有由存在SNP的位置上游和下游序列组成的序列。
就与阵列上的核酸探针进行杂交的靶核酸而言，可以使用含有所述核酸的测试溶液，或者可以例如提前通过PCR扩增靶序列位点、切下并使用。因此，靶核酸的长度可以任意确定，或者根据引物设计而可以是例如大约30-500bp。通过调整靶核酸的长度为合适长度，可以增加杂交效果。
可用于本发明中的基材可以是核酸探针可以固定于其上的基材，可呈孔状，具有凹槽或平表面的平板，或者由无孔的硬或半硬材料制成的立体形状如球形。所述基材可以(不限于)由含硅石基材制造，如由硅、玻璃、石英玻璃和石英，或者塑料或聚合物如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料制成。
在本发明的阵列中，作为检测由于固定在基材上的核酸探针与靶核酸的杂交而产生的双链体存在的手段，可以使用电化学方法，但不限于。
可以使用已知的双链体识别物质通过电化学方法检测双链核酸。所述双链体识别物质(不限于)是Hoechster 33258、吖啶橙、奎纳克林、道诺霉素、金属嵌入剂(metallointercalater)、双嵌入剂(bisintercalater)如双吖啶等，可以使用三嵌入剂(trisintercalater)和多嵌入剂(polyintercalater)。进一步地，可以使用电化学活性金属复合物例如二茂铁、biogen等修饰这些嵌入剂。或者，可以使用其它已知双链体识别物质。
在通过电化学方法检测双链核酸的方法中，在基材上放置一个电极，将核酸探针固定在该电极上。所述电极不特别限于但可以是碳电极如石墨、玻璃碳、热解石墨、碳粉和碳纤维，贵金属电极如铂金、铂黑、金、钯、和铑，及氧化物电极如氧化钛、氧化锡、氧化锰和氧化铅，半导体电极如Si、Ge、ZnO、CdS、TiC2和GaAs、钛等。如果需要，这些电极可以用导电聚合物包被，或者可以用分子膜包被，或者可以用其它表面处理剂处理。
可以通过已知方法固定核酸探针。例如，核酸探针可以通过间隔物固定在电极上，即将所述间隔物固定在电极上，并将核酸探针固定在所述间隔物上。或者，预先将间隔物与核酸探针结合，然后通过间隔物将探针固定在电极上。或者，可以通过已知方法在电极上合成间隔物和核酸探针。另外，为了将核酸探针与间隔物固定，可以将所述间隔物直接固定在经共价键、离子键或物理吸附处理或未处理的电极表面上。或者，可以使用有助于通过间隔物固定核酸探针的接头剂。另外，电极可以用封闭剂处理以防止测试核酸与电极及接头剂的非特异性结合。另外，本发明中使用的接头剂和封闭剂可以是有利于进行电化学检测的物质。
具有不同核苷酸序列的核酸探针可分别通过间隔物固定在不同的电极上。
进一步地，与其它普通电化学检测方法一样，可以提供具有辅助电极和/或参考电极的阵列。当安排参考电极时，可以应用例如普通参考电极如银/氯化银电极和汞/氯化汞电极。
可例如如下文所述通过阵列检测靶核酸。从对象如个体(如动物包括人)、组织和细胞中收集的样品中提取核酸成分作为样品核酸。如果需要，对所得样品核酸可以进行处理如逆转录、延伸、扩增和/或酶处理。将根据需要已经预处理的样品核酸与固定在核酸探针固定基材上的核酸探针接触，在允许合适杂交的条件下进行反应。本领域技术人员可以根据不同情况如靶序列中含有的核苷酸种类、间隔物的种类和核酸探针固定基材上安置的核酸探针、样品核酸的种类及其状态而适当地选择这种合适条件。
杂交反应可例如在如下条件下进行。作为杂交反应溶液，使用离子浓度在0.01-5范围内及pH在5-10范围内的缓冲液。向这个溶液中可以加入杂交促进剂硫酸葡聚糖，以及鲑精DNA、牛胸腺DNA，及表面活性物质如EDTA。向其中加入样品核酸，将其在90℃或更高温度加热变性。在核酸变性后或者在快速冷却至0℃之后，立即将固定了核酸探针的基材插入这个溶液中。或者，也可以通过向基材中滴加所述溶液而进行杂交反应。
在反应期间，反应速度可以通过如搅拌和摇动等方法加快。反应温度在例如10℃-90℃范围内，反应时间不少于1分钟直至接近过夜。在杂交反应后，洗涤电极。使用的洗涤溶液例如是离子浓度为0.01-5及pH为5-10的缓冲液。当样品核酸中存在含有靶序列的靶核酸时，其与核酸探针杂交在基材上产生双链的核酸。
随后，通过电化学方法检测双链的核酸。在常用的方法中，将基材在杂交后洗涤，然后双链体识别物质对电极表面上形成的双链部分起作用，由此产生的信号通过电化学方法测量。
双链体识别物质的浓度根据其种类不同而不同，通常使用范围是1ng/mL至1mg/mL。在此基础上，可以使用离子浓度为0.001-5及pH为5-10的缓冲液。
电化学测量以例如通过应用不低于双链体识别物质电化学起反应的电压的电压及测量得自所述双链体识别物质的反应电流值而进行。在此基础上，电压可以恒定速度扫描或者以脉冲方式应用。在进行测量时，使用如恒电位仪、数字多用表和信号发生器等装置控制电流和电压。再者，基于所得电流值，可以从标准曲线中计算靶核酸浓度。
使用前述阵列通过杂交反应检测的靶核酸的序列是测试个体和样品具有的核苷酸序列。从而可以确定每个样品含有的核苷酸序列中选择的SNP的基因型。
在确定了被区分个体和样品各自的基因型之后，将其进行对比，确定其是否一致。另外，基于所用SNP的基因型频率，计算所述个体或样品的基因型存在比率，确定可靠性。
根据本发明另一方面，提供了一种具有前述阵列的个体区分测试装置。在所述装置中，适当地使用基材样阵列，在此将其也称作芯片。进一步地，根据本发明的另一方面，提供了通过个体区分测试装置实施个体区分测试的系统。
本发明的个体区分测试装置配置有本发明的阵列，在所述阵列的基材上沿药物溶液或空气流动方向的流体通道，在所述基材上沿流体通道的并且其上固定了所述探针的多个工作电极，赋予与工作电极之间电势差的辅助电极，所述工作电极位于相应于工作电极的流体通道的内周表面(intemal circumferential surface)上，每一个的排列都使得其位于面对所述基材表面的第一表面，将检测电压反馈给工作电极的参考电极，所述参考电极位于相应于工作电极的流体通道的内周表面上，每一个的排列都使得其位于面对所述基材表面的第二表面，入口，其开在所述流体通道内，使药物溶液或空气从流体通道的上游流至流体通道内，出口，其开在流体通道内，使药物溶液或空气从流体通道流至流体通道的下游，用于向所述流体通道中注入测试溶液的注射口。
另外，本发明的个体区分测试系统配置有个体区分测试装置，与入口连通的第一管道系统，所述第一管道系统通过入口使药物溶液或空气进入所述流体通道中，供应系统，其具有第一阀以控制第一管道系统的药物溶液或空气的流速，与出口连通的第二管道系统，所述第二管道系统通过出口使药物溶液或空气从所述流体通道中排出，第二阀，其控制第二管道系统中药物溶液或空气的流速，在第二管道系统中的排出系统，所述排除系统具有从流体通道中抽吸药物溶液或空气的泵，具有赋予工作电极与辅助电极之间的电势差的电压施加单元的测量系统，控制阵列温度的温度控制系统，用于控制所述供应系统的第一阀、排出系统的第二阀和泵、测量系统的电压施加单元的控制装置，及温度控制系统，其检测工作电极或辅助电极的电化学反应信号并将这种电化学反应信号作为测量数据加以贮存，计算机，其告知控制装置控制条件参数以控制所述控制装置，同时基于测量数据实施核苷酸序列分析处理，并确定个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性。
本发明的个体区分测试装置和系统的一个实施方案在下文通过图示加以解释。
图5示出本发明一个实施方案中的个体区分测试系统的完整构造图。如图5示出，个体区分测试系统1由如下结构构成芯片夹(chipcartridge)11(个体区分测试装置)；测量系统12，其与这个芯片夹11电连接；流动系统13，其与芯片夹11中的流体通道通过界面部分物理连接；温度控制系统14，其控制芯片夹11的温度。
这些测量系统12、流动系统13和温度控制系统14由控制装置15控制。控制装置15与计算机16电连接，控制装置15由这个计算机16的程序控制。在这个实施方案中，芯片夹11、测量系统12、流动系统13和温度控制系统14称作测量单元10。
配置有其上固定了核酸探针的芯片21的印刷电路板22附于所用芯片夹11上。核酸探针固定在芯片21的工作电极上。导入芯片21的小池中的样品(测试溶液)含有待测试的核酸。这个实施方案的个体区分测试装置确定样品(测试溶液)中是否含有靶核酸，通过将靶核酸与核酸探针杂交并监测在导入缓冲液和嵌入剂之后所述杂交反应的存在与否而进行确定。
图6A-6D示出芯片夹11的详细构造。图6A示出俯视图，图6B示出以B-B方向所见图示，图6C是以C-C方向所见局部透视截面图，图6D示出支持物111图示，其是以D-D方向从后部(from a back)所见芯片夹11的一个组成元件。芯片夹体110由支持物111和芯片夹上盖112组成，所述支持物111从下面支持印刷电路板22，盖子112从上面支持、固定和支撑印刷电路板22，与支持物111联合。
在芯片夹上盖112的侧面有两个开口，界面部分113a与一个开口连接，界面部分113b与另一个开口连接。这些界面部分113a和113b作为流动系统13和芯片夹11的界面。在这些界面部分113a和113b的内部，分别具有流体通道114a和114b。药物溶液或空气从流体通道系统13的上游通过流体通道114a流进芯片夹11内部。芯片夹11中的样品、药物溶液和空气通过流体通道114b排出至流体通道系统13下游。
在图6A-6C中，流体通道114a和114b以虚线示出。这些流体通道114a和114b通过界面113a和113b与芯片夹上盖112的内部连通，并进一步与小池115连通。小池115是芯片21与导入这个芯片21中的各种溶液产生电化学反应的地方。这个115周围由芯片21、密封材料24a、和芯片夹上盖112密闭，条件是配置有芯片21的印刷电路板22的四角用基材固定螺丝25固定在这个芯片夹11的芯片夹上盖112上。在配置有芯片21的印刷电路板22固定在芯片夹上盖112上的情况中，印刷电路板22与支持物111和芯片夹上盖112一起，支撑密封材料24a。再者，芯片夹上盖112用上盖固定螺丝117固定。从而，指定了与流体通道114b连通、从流体通道114a经由小池115的各种药物溶液和空气的注射和排出途径。芯片21用密封树脂23密封于印刷电路板22。
芯片夹上盖112位于小池115上面，有入口116a和出口116b。116a的流动口从侧面穿透至芯片夹上盖112的底面，在小池开口部分115a的芯片夹上盖112底面开口。出口116b从另一侧面穿透至芯片夹上盖112的底面，在小池开口部分115b的芯片夹上盖112底面开口。通过入口116a与流体通道114a及出口116b与流体通道114b的连通，流体通道114a与小池115及流体通道114b与小池115连通在一起。
电连接器22a位于印刷电路板22表面，与小池115隔开。电连接器22a与印刷电路板22的基体的引线框电连接(electricallyconnected)。另外，基体的这个引线框通过引线与芯片21各个电极电连接。通过测量系统12的终端与这个电连接器22a的连接，在芯片21中获得的电信号可以通过在印刷电路板22预定位置安置的预定终端及进一步通过电连接器22a输出至测量系统12。
如图6D示出，支持物111为U形，在其中心具有凹部(notchpart)111a。这个凹部111a形状比印刷电路板22小，比芯片21大。由此，温度控制系统14不用支持物111而可以与芯片21接触，同时保留支持物111支持印刷电路板22的功能。117a是一螺旋口，在其中固定上盖固定螺丝117。
温度控制系统14调节芯片21的温度，例如使用Peltier元件。由此，可以将在±0.5℃范围控制温度。核酸反应通常在相对接近室温的温度进行。因此，仅用加热仪控制温度稳定性较差。另外，由于必需通过温度模式控制核酸的反应，因此还必需一种冷却装置。在这方面，在Peltier元件中，因为可以通过改变电流的方向而进行任何加热和冷却，因此这个元件是最理想的。
图7示出在用上盖固定螺丝117固定之前的支持物111和芯片夹上盖112。如图7示出，将四角用芯片21包装的印刷电路板22用基材固定螺丝25固定在芯片夹上盖112上。将密封材料24a集成至芯片夹上盖112中。由密封材料24a和芯片夹上盖112围绕的小池115限定在芯片21上。再者，芯片夹上盖112用上盖固定螺丝117固定在支持物117上。另外，基材固定螺丝25可以从印刷电路板22的后面或表面固定对象。如此，通过将印刷电路板22固定在芯片夹上盖112上，可以确定保留芯片21、密封材料24a与芯片夹上盖112之间的粘附性。
图8示出用芯片21包装的印刷电路板22的详细构造。如图8示出，芯片21用密封树脂23密封在印刷电路板22上。在芯片21上具有工作电极501。这个工作电极501沿着图8箭头所示药物溶液和空气的流动方向一个接一个地排列。药物溶液和空气的流动方向通过用芯片夹上盖112和密封材料24a关闭而限定，沿着芯片21上工作电极501周围箭头所示方向留有间隔。虚线所示区域是安置密封材料24a的区域。将多个工作电极501适当地排列在这个曲线指定区域中。
电连接器22a安置在印刷电路板22的末端。将芯片21的工作电极501及电连接器22a用印刷电路板22表面上的引线框经电连接在一起。芯片21和测量系统12的各个电极可以通过连接测量系统12的信号接口而与电连接器22a电连接。
图9A是在图6A中以D-D方向所见小池115及与小池115连通的药物溶液供应系统截面图，图9B是小池115附近的俯视图。如图9A示出，在芯片夹上盖112的底部具有高度为d42的流体通道1样凸起部分112a。密封材料24a预先印刷在这个流体通道1样凸起部分112a中，例如通过丝网印刷术，将该部分与密封材料24a集成在一起。由此，小池115可以不用配置密封材料24a和芯片夹上盖112而限定，装配小池115的步骤得以简便化。密封材料24a固定在流体通道1样凸起部分112a与芯片21之间。由此，在芯片夹上盖112与芯片21之间限定一个密闭的空间。这个密闭的空间是作为反应室的小池115，在此样品或药物溶液与探针之间产生电化学反应。小池115的底部是芯片21。小池115的侧面是芯片夹112上流体通道1样凸起部分112及侧面的密封材料24a。小池115的上面是芯片夹112的位置，其中没有流体通道1样凸起部分112a。由此，限定了其中围住了除了小池开口部分115a和115b之外的实体的密闭空间，保持芯片21与盖子120之间不透液体。这个小池115的高度为大约0.5mm。在此，所述高度为大约0.5mm而不限于此，根据需要而可以是0.1-3mm范围。
当从上面看小池115时，具有其中排列着如图9B所示细长流体通道601的形状。在图9B中，具有与流体通道相同宽度的流体通道601从入口116a侧小池开口部分115a直至小池开口部分115b。这个流体通道601由检测流体通道601a、开口连接流体通道601b和601c及流体通道连接流体通道601d组成。检测流体通道601a是其中排列工作电极501的多个流体通道。开口连接流体通道601b将与小池开口部分115a最近的检测流体通道601a与小池开口部分115a连接起来。开口连接流体通道601c将与小池开口部分115b最近的检测流体通道601a与小池开口部分15b连接在一起。流体通道连接流体通道601d将彼此相邻的检测流体通道601a的末端连接在一起，使得药物溶液或空气以一个方向流至多个检测流体通道中。由此，已经流进某一检测流体通道601a中的药物溶液或空气流入流体通道连接流体通道601d中，再以相同方向流入邻近的另一检测流体通道601a中。另外，所有流体通道601a-601d均具有相同的宽度和横截面，流体通道的宽度为0.5-10mm。
在图9B，虚线围绕的且其中未形成流体通道601的区域是其中具有流体通道1样凸起部分112a和密封材料24a的区域，与芯片21和密封材料24a接触。其中形成流体通道601的区域是其中无流体通道1样凸起部分112a和密封材料24a的区域。入口116a和出口116a分别从小池115上面以与小池底部接近垂直的方向向上延伸到指定高度。入口116a和出口116b从中心向彼此远离的方向在其流体通道中进一步弯曲，分别与流体通道114a和114b连接。
出口116b以与小池底面大致垂直的方向延伸至指定高度，并且以远离小池115中心的方向弯曲成接近直角，在弯曲部位分成两条通路。一条通路穿过芯片夹上盖112表面，与注射口119连通。由此，样品经注射口119通过出口116b注入小池115中。注射口119的中心轴和出口116b的中心轴几乎一致，注射口119的孔径大于流动口116b的孔径。另外，注射口119可以用其附近的盖子120覆盖。由此，不用注射口119的情况下，当药物溶液在流体通道114b中从流体通道114a通过小池115至流体通道114b中循环时，可以而阻止药物溶液通过注射口119流出，而药物溶液途径被保留。另外，在盖子120上有密封材料121，通过密封注射口119，可以防止药物溶液的轻微泄漏。在图9A中，尽管未特别示出，当密封材料121的深度使得注射口119的通道被完全阻塞，仅剩下从出口116b与流体通道114b连接的通道时，可以减少药物溶液或空气在注射口119的滞留。
通过上述构造，药物溶液可以图9A中箭头所示方向按流体通道114a、入口116a、小池115(流体通道601)、出口116b和流体通道114b顺序流动。另外，以箭头所示方向将样品通过注射口119注入，通过出口116b导入小池115中。因此，样品是从流出侧注入，注射途径与药物溶液的供应流向相反。由此，在洗涤步骤中，可以增强样品的洗涤效力。
图9C示出入口116a、出口116b与流体通道601之间的最佳位置关系。入口116a的外周与开口连接流体通道601c的外周相接触。此外，出口116b的外周原理开口连接流体通道601c的外周。由此，在药物溶液或空气流入的基础上，可以减少易于在入口116a的开口角落附近产生的药物溶液剩余或空气剩余，同时可以降低在药物溶液或空气排出时在出口116b角落产生的流速分散，及可以减少剩余的空气。另外，如图中虚线所示，当入口116a的形状构建为从通过重叠开口连接流体通道601b的外周与入口116a的外周而从开口连接流体通道601b突出时，可以获得相似的作用。当然，入口116a与出口116b的流体通道601之间的位置关系不限于图9C所示关系。在入口116a侧，认为与开口连接流体通道601b的连接有三种情况，其一是这两个口的外周是接触的，其二它们是重叠的，其三它们是分离的。在出口116b侧，认为与开口连接流体通道601C的连接有三种情况，其一是这两个口是基础的，其二它们是重叠的，其三它们是分离的。
图10和11示出小池115的详细构造。图10A是其中小池被连接小池开口部分115a和115b的直线切割的横截面，图10B示出其中芯片夹上盖112固定于芯片21的外观，图11是小池115的俯视图。如图10A所示，多个检测流体通道601a以大约相同的间隔排列。当药物溶液或空气从后向前流入图10A左侧所示检测流体通道601a的横截面时，其以相反方向流入中间的检测流体通道601a中，即其从前向后流入，其进一步以相反方向流入左侧所示检测流体通道601a中，即其以从后向前方向流动。如此，相邻的检测流体通道601a的药物溶液或空气流动方向是相反的。当这些检测流体通道601a以与药物溶液或空气的流动方向垂直的横截面切割时，均形成相同的椭圆形横截面，电极排列相同。
检测流体通道601a的底面是芯片21。每一个工作电极501排列在检测流体通道601a的底面上。检测流体通道601a的侧面通过流体通道样凸出部分112a限定，其从芯片夹上盖112和密封材料24a上凸起。参考电极503分别固定在这个流体通道的侧面上，即流体通道样凸出部分112a的侧面上，达到自流体通道底部起的预定高度。如此，将多个参考电极503置于与芯片表面平行的平面上并面向芯片表面，将此平面置于比其上安置了工作电极501的平面更高的平面上。检测流体通道601a的上面是芯片夹上盖112的底面，所述盖子上没有流体通道样凸出部分112a。将每个辅助电极502固定在这个流体通道的上面。如此，将多个辅助电极502置于与芯片底部平行的平面上并面向芯片表面，将该平面置于比其上安置了工作电极502或参考电极503的平面更高的平面上。如此，工作电极501、辅助电极502和参考电极503分别立体地排列在不同平面上。
将密封材料24a预先经印刷固定在芯片夹上盖112的流体通道样凸出部分112a上。因此，当装配小池115时，集成了密封材料24a的芯片夹上盖112以图10B箭头所示方向向芯片21推进。由此，具有图10A所示密闭外周的流体通道601通过密封材料24a限定于芯片夹上盖112和芯片21之间。
如图11所示，由工作电极501、辅助电极502和参考电极503组成的三个电极以箭头所示药物溶液或空气流动方向以相等间隔沿着每个流体通道601排列。这三个电极排列在与药物溶液或空气流体通道方向垂直的平面上。
在图11的实例中，不论流体通道的方向如何，当从上方观察时工作电极501、辅助电极502与参考电极503之间的位置关系是相同的矩阵(matrix)状态(不限于这种状态)。如图12所示，相邻的检测流体通道601a中流体通道横截面与药物溶液或空气的流动方向可以是左右相反的。在这种情况中，在任何检测流体通道601a中，辅助电极502朝流动方向排列流体通道右侧侧面上。由此，可以实现在药物或空气的流动方向中的所述三个电极的排列均具有相同形状。关于工作电极501和辅助电极502，当其在横截面中未以左右对称位置排列时，其在相邻检测流体通道601a中可以以左右相反的位置排列，如参考电极503那样。
如此，每个工作电极501、辅助电极502和参考电极503以三个电极一组的形式以相同横截面形状流体通道沿着药物溶液或空气的流动方向安置，由此这三个电极的位置关系是相同的，流体通道形状是相同的。当从工作电极501观察时，流体通道底面、侧表面和上表面相对于工作电极501的方向，及工作电极501与相应的辅助电极502和参考电极503的位置关系是相同的。由此改善了通过三个电极的每一个检测到的电化学信号的一致性。因此改善了检测可靠性。
在此，辅助电极502和参考电极503的排列使得相对于相应工作电极501为分离的，但不限于这种排列。辅助电极502或参考电极503可具有多个电极在任何情况中均连接的构造方式。在这种情况中，每个电极中最接近每个工作电极的区域发挥辅助电极或参考电极功能。另外，流体通道的横截面形状不限于图10A所示。
然后，在图13的逐步横截面图中解释生产前述芯片21和印刷电路板22的方法。洗涤硅基材211，将硅基材211加热在其表面上形成热氧化的薄膜212。可以使用玻璃基材代替硅基材211。然后通过喷射(sputtering)将Ti薄膜213置于整个基材上，例如薄膜厚度为50nm，然后通过喷射将Au薄膜214置于整个基材上，例如薄膜厚度为200nm。在此，优选Au薄膜214具有<111>方向的晶体状平面方向。然后，将光致抗蚀剂薄膜210塑型(图13A)以保护以后成为电极或布线的区域，蚀刻Au薄膜214和Ti薄膜213(图13B)。在这个实施方案中，使用KI/I2混合溶液蚀刻Au薄膜214，NH4OH/H2O2混合溶液用于蚀刻Ti薄膜。为了蚀刻AU薄膜214，有使用稀释的王水的方法，及用离子蚀刻方法。相似地，为了蚀刻Ti薄膜213，可以应用使用氢氟酸或缓冲的氢氟酸湿法腐蚀处理方法，及使用得自CF4/O2混合气体的等离子体干性蚀刻的方法。
然后，通过氧灰化除去光致抗蚀剂薄膜210(图13C)。除去光致抗蚀剂薄膜210的步骤可以联合使用溶剂、抗蚀剂剥离器或者使用氧灰化步骤进行 然后，将光致抗蚀剂215包被在整个表面上，塑型以使电极部分和焊盘露出(图13D)。之后进行硬烤(hard baking)，例如在200℃在清洁的烤箱中烘烤30分钟。在硬烤方法中，可以使用热平板或者可以适当使用处理条件。在此，选择光致抗蚀剂薄膜215作为保护膜，但是除了光致抗蚀剂之外，也可以使用有机薄膜如聚酰亚胺BCB(苯并环丁烯(benzocyclobutene))等。或者，可以使用无机薄膜如SiO、SiO2和SiN。在这种情况中，可以通过打开光致抗蚀剂形成薄膜以保护电极部分、沉积SiO等，并通过剥离(lift off)方法保护除了电极部分之外的区域，或者在整个表面上形成SiN薄膜等，形成光致抗蚀剂薄膜215以仅打开电极部分，通过蚀刻除去电极上SiN薄膜，最后剥离光致抗蚀剂薄膜215。
然后，通过最后切割以分割成芯片，清洁电极表面，用CF4/O2混合的等离子体处理。由此，获得芯片21。将芯片21安置在用电连接器22包装的印刷电路板22上。将芯片21的焊盘与印刷电路板22上的引导线通过引线接合法连接。之后引线接合部分用密封树脂23保护。通过上述步骤，可以生产出用芯片21包装的印刷电路板22。
生产的芯片21的俯视图示于图14。如图14示出，在芯片表面的中心附近有一个以上的工作电极501。另外，将其中形成了工作电极501的区域置于其中形成了虚线所示密封材料24a的区域中。另外，焊盘221排列在芯片外周部分。每个工作电极501通过配线222与焊盘221连接。尽管在图14中未示出，但是将其中形成了焊盘221的外周部分用前述密封树脂23密封。
然后，使用图15解释流动系统13的特殊构造。将这个流动系统13粗略分为芯片夹11的流体通道114a上的供应系统和流体通道114b上的排出系统。将空气供应源401与管道系统404的最上游连接。在这个空气供应源401的下游，具有止回阀402以防止除了空气之外的药物溶液通过管道系统404反向流入空气供应源401中，在接下来的下游侧具有双向电磁阀403(Va)。由此，控制空气从管道系统404流入芯片夹11中的流动速度。
将供应作为药物溶液之一的Milli Q水的Milli Q水供应源411与管道系统414连接。在这个Milli Q水供应源411的下游侧具有止回阀412，以防止除了Milli Q水之外的药物溶液或空气反向流入MilliQ水供应源中，在接下来的下游侧具有三向电磁阀413(Vwa)。该三向电磁阀413在管道系统404与管道系统415的连通及管道系统414与管道系统415之间开关。即在三向电磁阀413关闭时，管道系统404与管道系统415连通，在该阀打开时，管道系统414与管道系统415连通。由此，可以转换空气与水Milli Q供应至管道系统415。供应作为药物溶液之一的缓冲液的缓冲液供应源421与管道系统424连通。在这个缓冲液供应源421的下游具有止回阀422，以防止除了缓冲液之外的药物溶液或空气反向流入缓冲液供应源421中，在接下来的下游具有三向电磁阀423(Vba)。这个三向电磁阀423在管道系统424与管道系统425的连通及管道系统415与管道系统425的连通之间开关。即当电磁阀423关闭时，管道系统415与管道系统425连通，当这个阀打开时，管道系统424与管道系统425连通。由此，可以转换将缓冲液供应至管道系统425及空气或Milli Q水的供应。
供应作为药物溶液之一的嵌入剂的嵌入剂供应源431与管道系统434连通。在这个嵌入剂供应源431的下游有一个止回阀432，防止除了嵌入剂之外的药物溶液或空气反向流入嵌入剂供应源431中，在接下来的下游具有一个三向电磁阀433(Vin)。这个三向电磁阀在管道系统434与管道系统435的连通及管道系统425与管道系统435的连通之间开关。即在这个三向电磁阀433关闭时，管道系统425与管道系统435连通，在其打开时，管道系统434与管道系统435连通。由此，可以转换供应至管道系统435的嵌入剂及空气、Milli Q水或缓冲液的供应。
如上所述，在空气或药物供应系统中，通过控制双向电磁阀403或三向电磁阀413、423和433，可以转换空气、Milli Q水、药物溶液如缓冲液和嵌入剂通过管道系统435供应至芯片夹11中，并且可以控制供应的空气或这些药物溶液的流速。在管道系统435的上游连通前述三向电磁阀433，在其下游连通三向电磁阀441(Vcbin)。通过三向电磁阀441，管道系统435可以分成管道系统440和侧支的管道系统446。三向电磁阀441如下开关在关闭时，管道系统435与侧支管道系统466连通，在其打开时，管道系统435与管道系统440连通。另外，三向电磁阀445如下开关在其关闭时，侧支管道系统446与管道系统450连通，在其打开时，管道系统440与管道系统450连通。通过这些三向电磁阀441和445，可以在侧支管道系统446与管道系统440之间转换各种药物溶液与空气的供应。
在管道系统440中，朝向下游依次可见三向电磁阀441、双向电磁阀442(Vlin)、芯片夹11、液体传感器443、双向电磁阀444(Vlout)及三向电磁阀445(Vcbout)。双向电磁阀442与相应于芯片夹11的流入系统的流体通道114a连通，双向电磁阀444与相应于芯片夹11的排出系统的流体通道114b连通。由此，药物溶液或空气通过管道系统440供应至芯片夹11的流入系统，这些药物溶液和空气可以从芯片夹11的排出系统排出。另外，通过双向电磁阀442和444，可以控制在此通道中作为流动溶液和排出溶液的药物溶液或空气的流速。另外，通过液体传感器443，可以监测流入芯片夹11中的药物溶液的流速，或者监测从芯片夹11排出的药物溶液的流速。
在管道系统450中，朝向下游依次可见三向电磁阀445、双向电磁阀451(Vvin)、折算压力区域452、双向电磁阀453(Vout)、流动泵454及三向电磁阀455(Vww)。双向电磁阀451和453防止药物溶液或空气反向流入折算压力区域452周围的通道中。流动泵454由管泵组成，特征在于当从芯片夹11中观察时其位于排出侧(下游侧)的排出系统中。即通过使用管泵使得药物溶液与除了管壁之外的机械装置不接触，这样可以防止污染。另外，通过抽吸作用为芯片夹11供应药物溶液或空气及从芯片夹11中排出药物溶液或空气，不仅可以在芯片夹11内部平稳地进行药物溶液与空气之间的置换，而且甚至当管道系统偶然松开时或者当芯片夹11从管道系统440中滑出时，也不会发生液体泄漏。由此改善了装置装备的稳定性。
当然，在芯片夹11上游的管道系统中安置一个泵，这个泵可以向芯片夹11中泵入空气或药物溶液。所述泵不限于管泵，也可以使用注射泵、活塞泵、膜片泵和磁性泵。
开关三向电磁阀455以使得在关闭时管道系统450与管道系统461连通，在打开时管道系统450与管道系统463连通。废物槽462置于管道系统461中，嵌入剂废物槽464置于管道系统463中。由此，除了嵌入剂之外的药物溶液如Milli Q水和缓冲液可以通过三向电磁阀455的开关导入废物槽462中，嵌入剂可以导入嵌入剂废物槽464中。由此，可以分级回收嵌入剂。
另外，电磁阀可以与管道系统如特氟隆管连接，本实施方案可以构建多种形式结构，其中电磁阀和流体通道分别集成在芯片夹11的上游和下游。由此，由于管道系统的体积降低，因此也可以降低药物溶液的需要量。另外，由于药物溶液流动在管道系统中是稳定的，因此改善了检测结果的再生产性和稳定性。
图15中示出的使用流动系统13的流动步骤使用图16的流程图解释。首先，在小池115中进行固定在工作电极501上的核酸探针与样品之间的杂交反应(s21)。为了进行这种杂交反应，控制例如温度控制系统14以使得芯片夹11的底面即印刷电路板22的底面的温度达到大约45℃并保持该温度例如60分钟。
与此杂交反应同时启动药物溶液管线(line)(s22)。特别地，通过控制三向电磁阀441和445，利用侧支管道系统446，通过打开三向电磁阀433，从嵌入剂供应源431中供应大约10秒钟嵌入剂。打开三向电磁阀455，管道系统450中的嵌入剂流入嵌入剂废物槽464。然后，重复将嵌入剂和空气从管道系统435中交替导入侧支管道系统446中，例如进行5秒钟。然后，仅将空气从管道系统435中导入侧支管道系统446中。在此阶段，废物流入废物槽462中。从缓冲液供应源421中将缓冲液导入侧支管道系统446中。之后，重复将Milli Q水和空气交替从管道系统435中导入侧支管道系统446中，例如每次进行5秒钟。
当启动这个药物溶液管线并完成及杂交反应完成时，洗涤管道系统(s23)。对于管道系统洗涤，例如将印刷电路板22的温度用温度控制系统14调节为大约25℃，将侧支管道系统446用Milli Q水清洗，重复将空气和Milli Q水交替导入，例如每次5秒钟。然后，洗涤芯片夹(s24)。对于洗涤芯片夹，将药物溶液导入途径从侧支管道系统446转变至管道系统440，向管道系统440中重复交替导入空气和MilliQ水，例如每次5秒钟。之后通过液体传感器443证实芯片夹11已经用水填满，导入途径转换为侧支管道系统446。
然后，清洗管道系统(s25)。在清洗管道系统中，首先将空气导入侧支管道系统446以不与缓冲液和Milli Q水混合。然后，重复将空气和缓冲液交替导入侧支管道系统446中，例如每次5秒钟。通过侧支管道系统446中的液体传感器447证实侧支管道系统446已经用缓冲液置换。然后，将缓冲液注入芯片夹(s26)，在将缓冲液注入芯片夹中，首先将侧支管道系统446转换成管道系统440，重复将空气和缓冲液交替导入芯片夹11中，例如每次5秒钟。然后，将缓冲液充填于芯片夹11中(s27)。在缓冲液充填中，将缓冲液导入芯片夹11，同时用液体传感器443监测芯片夹11中的情况，通过在例如60℃保持30分钟洗去非必需的样品(s28)。在洗去非必需样品的步骤之后，将管道系统440转换为侧支管道系统446，通过导入Milli Q水洗涤管道系统(s29)。在这个洗涤管道系统中，重复交替导入空气和Milli Q水，例如每次5秒钟。
然后洗涤芯片夹(s30)。在洗涤芯片夹中，将侧支管道系统446转换为芯片夹11，重复交替导入空气和水，例如每次5秒钟。之后通过液体传感器443证实Milli Q水已经充填进芯片夹11之后，将转换为侧支管道系统446。然后开始测量。在测量中，首先用嵌入剂清洗管道系统(s31)。在用嵌入剂清洗管道系统中，废物流入嵌入剂废物槽464中，同时空气导入侧支管道系统446中。然后，重复将空气和嵌入剂导入侧支管道系统446中，例如每次大约5秒钟，使用液体传感器447检测侧支管道系统446是否已经用嵌入剂置换。
然后，将嵌入剂注入芯片夹11中(s32)。在这个步骤中，首先将侧支管道系统446转换为芯片夹11，重复交替导入空气和嵌入剂，每次大约5秒钟。然后，在用液体传感器443监测下，嵌入剂充填进芯片夹11中(s33)。之后进行测量(s34)。当测量完成时，将Milli Q水导入侧支管道系统446，然后交替导入空气和Milli Q水，每次大约5秒钟，将管道系统用空气置换以洗涤管道系统(s35)。
最后，将侧支管道系统446转换为芯片夹11，交替导入空气和Milli Q水，例如每次5秒钟，将芯片夹11进一步用空气置换以进行洗涤芯片夹(s36)。由此，完成一系列流动步骤。
根据图16所示使用图15的流动系统13步骤，为了有效进行药物溶液置换，在管道系统中进行空气和药物溶液的一系列交替流动，如药物溶液/空气/药物溶液/空气，这样可以使溶液流动。采用这种方法可以在药物溶液置换中使得旧的药物溶液与新的药物溶液的混合最小化。因此可以减少液体交换的过渡状态及最终改善电化学性质的再生产率。再者，缩短药物溶液流动时间及减少药物溶液的量可以通过有效的药物溶液交换而实现。另外，由于反应小池115中药物溶液浓度通过这种药物溶液/空气的相继流动而通常保持恒定，因此改善了电流性质的平面一致性，即改善了检测的可靠性。
另外，在将药物溶液充填进小池115的方法中，在其中双向电磁阀444作为芯片夹的出口阀门的情况中，在芯片夹下游的管道系统440中压力降低之后(在泵454开动的情况中，通过控制双向电磁阀451使减压区452中压力降低，控制双向电磁阀453以保持减压区452的低压状态)，打开双向电磁阀44，由此药物溶液可以导入芯片夹反应小池115中。另外，图16示出的流程仅是一个实例，可以根据测量目标、对象和条件进行各种改变。
图17示出测量系统12的具体构造。图17中示出的测量系统12是3个电极形式的恒电位仪12a，通过反馈(负反馈)关于辅助电极502输入的参考电极503的电压，将希望的电压施加于溶液(不管电极各种条件的变化)或小池115中溶液。更特别地，恒电位仪12a改变辅助电极502的电压，以使得参考电极503的电压相对于工作电极501设定在预先确定范围，及测量嵌入剂电化学氧化电流。工作电极501是其上固定了具有与靶核酸互补的序列的核酸探针的电极，是检测小池115中反应电流的电极。辅助电极502是在工作电极之间应用预定电压的电极，为小池115提供电流。参考电极503是将电极电压反馈给辅助电极502的电极，以控制参考电极503与工作电极501之间的但也在预定范围内，由此控制了辅助电极502的电压，及可以高精确度地检测氧化电流而不受小池115中各种检测条件的影响。将产生检测电极之间电流的电压起伏图的电压起伏图产生电路510与反相放大器512(OPc)的倒置输入终端连接，以通过配线512b控制参考电极503的参比电压。
电压模式产生电路510是将来自控制结构15的数字信号转换为模拟信号以产生电压起伏图的电路，其具有DA转换器。电阻器Rs与配线512b连接。将反相放大器512的非倒置输入终端接地，将配线502a与输出终端连接。将反相放大器512的倒置输入终端的配线512b与输出终端上的配线502a用配线512a连接。在这个配线512a中，提供了由反馈电阻器Rff和开关SWf组成的保护性电路500。配线502a与终端C连接。终端C与芯片21上的辅助电极502连接。当安置多个辅助电极502时，将终端C与各个电极并联连接。由此，通过一种电压起伏图，可以将电压同时用于多个辅助电极502。在配线502a中，安置了控制向终端C施加电压的开关的开关Swo。
反相放大器512中安置的保护性电路500未设定为提供辅助电极502过量电压。因此，在测量时应用过量电压，溶液被电分解，因此可以在不影响对所希望嵌入剂的氧化电流的检测而进行稳定测量。终端R与电压跟随放大器513(OPr)连接。电压跟随放大器的倒置输入终端用与其输入终端连接的配线513b和配线513a形成短路。在配线513b中，安置了电阻器Rf，其与配线512b的电阻器连接，配线512a和配线512b交叉。由此，通过将参考电极503的电压反馈至电压起伏图产生电路510产生的电压起伏图而获得的电压输入反相放大器512中，基于通过倒置扩大这种电压获得的输出数据，控制辅助电极502的电压。
终端W通过配线501a与跨阻抗放大器(trans impedance amplifier)511(OPw)的倒置输入终端连接。将跨阻抗放大器511的非倒置输入终端接地，与其终端连接的配线511b与配线501a通过配线511a连接。在配线511a中安置了电阻器Rw。假定这个跨阻抗放大器511的输出侧终端O的电压为Vw，电流为Iw，则Vw＝Iw·Rw。得自这个终端O的电化学信号在控制装置15中输出。由于有多个工作电极501，因此提供了相应于各自的工作电极501的多个终端W和终端O。从多个终端O的输出信号用后文描述的信号转换部件转换，进行将模拟信号转换为数字信号，因此几乎在同时可以获得作为数字数值的每个工作电极501的电化学信号。或者，终端W和终端O之间的跨阻抗放大器511电路可以由多个工作电极501参与。在这种情况中，配线501a可以具有信号转换部件以从多个终端W中转换配线501a。
使用图17所示这个恒电位仪12a的测量系统12的作用通过对比使用先前的恒电位仪的情况而阐述。先前的恒电位仪示于图18。如图18所示，先前的恒电位仪12a’的构造与图17所示的恒电位仪12a几乎相同。不同之处是在反相放大器512中无保护性电路500。电压起伏图产生电路510的输出终端I的电压为Vrefin，终端C的电压为Vc，终端R的电压为Vrefout。参考电极503的反馈导致Vrefout＝Rf/Rs·Vrefin。
然后，阐述一个基于测量数据利用计算机16进行信号分析的测量数据分析程序实例。在此，使用图19所示流程图阐述基因型确定程序，以确定在靶核酸的SNP位置的核苷酸是否是G型(纯合型)、T型(纯合型)或者GT型(杂合型)。尽管在图5中未特别表明，但是计算机16的主要处理器16a通过执行分析程序而执行类型确定过滤、类型确定处理和确定结果输出，所述分析程序包括进行基因型确定过滤、基因型确定处理和确定结果输出的多个命令。另外，为了控制前述控制装置15，单独提供控制程序。这些分析程序和控制程序可以由计算机16中贮存在记录工具读出装置中的分析程序的读出(readingout)而执行，或者可以通过从计算机16中记忆装置如磁盘中读出而执行。
假定进行这种测量数据分析，阐述4个核苷酸取代类型SNP的实例。首先，制备作为被测靶核酸的在SNP位置的A、G、C和T四种核苷酸，将具有与靶核酸互补的核苷酸序列的多个(每种)核酸探针固定在每个工作电极501上。单独将具有与这四种核酸探针不同序列的多个核酸探针(后文称作阴性对照探针)固定在其它工作电极501上(s61)。原则上固定在一个工作电极501上的核酸探针的种类是一种。
然后，将含有待检靶核酸的样品注入其上固定了前述核酸探针的芯片中，产生杂交反应(s62)，通过用缓冲液洗涤及通过导入嵌入剂产生电化学反应，使用测量系统12计算代表性(representative)电流数值(s63)。代表性电流数值是指在数量上有效把握每个杂交探针的杂交反应的出现的数字值，一个实例是指定信号电流数值的最大值(电流峰值)。电流峰值是通过测量来自与固定在每个工作电极501上的核酸探针杂交的双链核酸结合的嵌入剂的氧化电流信号，获得电流峰值。通过减去除了来自的氧化电流信号之外的背景电流进行电流峰值的检测。当然，根据信号处理的精确度和目的可以采用任何数值作为各自的电流数值，例如氧化电流信号的综合值。当然，不限于电流值，也可以采用电压值或者通过对电流和电压进行数字值分析处理获得的数值作为代表性数值。
关于其中在SNP位置的核苷酸是A、G、C和T型的靶核酸的测量数据，即各自的电流数值分别指定为Xa、Xg、Xc和Xt，阴性对照核酸探针的电流数值指定为Xn。另外，由于根据各自的种类获得多个各自的电流数值，第一个Xa指定作Xa1，第二个Xa指定作Xa2，以此类推，以将其彼此区分。另外，其中在SNP位置的核苷酸是A、G、C和T型的靶核酸的所得各自的电流数值的编号指定为na、ng、nc和nt，阴性对照核酸探针获得的电流数值指定为nn。
然后，为了在所得各自的电流数值Xa、Xg、Xc、Xt和Xn中除去明显异常数据，执行类型确定过滤处理程序(s64)。这种类型确定过滤处理程序的流程图示于图20。对Xa、Xg、Xc、Xt和Xn分别单独进行图20所示的这种类型确定过滤处理。例如，在Xa情况中，在针对Xa获得的na电流数值中，通过这种类型确定过滤排除看起来明显异常的数据。关于Xg、Xc、Xt和Xn，进行相似的程序。另外，在图20的说明中，由于根据数据种类进行相似的处理，因此阐述了过滤Xa的程序。特别地，如图20示出，首先设定测量组的所有测量数据，即设立数据集(s81)。例如，在Xa情况中，设定Xa1、Xa2…Xana作为数据集。
然后，关于这些测量数据Xa1、Xa2…Xana，计算CV值(后文称作CV0)(s82)。这个CV0是通过将测量数据Xa1、Xa2…Xana的标准偏差除以平均值而获得。这样确定了所得数值CV0是否为10％或更高，即0.1或更高(s83)。如果是10％或更高，则计算通过从测量数据中除去最小值获得的na-1数据集的CV值(后文称作CV1)(s84)。如果低于10％，则确定了没有明显异常的数据，继续进行后文描述的类型确定程序。在计算CV1之后，确定CV0≥2×CV1是否建立(s85)。如果这个不等式建立，则继续进行程序(s86)，通过从测量数据中除去最小值获得的na-2数据集重新设定为数据集，返回进行程序(s82)，重复过滤异常数据。如果不等式未建立，则确定不是在最小侧而是在最大侧存在异常数据，计算通过从测量数据中除去最大值获得的na-2数据集的CV值(后文称作CV2)(S87)。这样确定了CV0≥2×CV2是否建立(S88)。如果建立，则将通过从测量数据中除去最大值而获得的na-3数据集进一步重新指定为数据集，返回进行程序(s82)，重复过滤异常数据。如果未建立，则确定无明显异常数据，继续进行后文所述类型确定程序。对于Xg、Xc、Xt和Xn也进行前述类型确定过滤程序。
然后，通过使用获得的类型确定过滤结果执行类型确定处理(s65)。这种类型确定处理程序的一个实例使用图21的流程图阐述。另外，图21示出确定在靶核酸的SNP位置的核苷酸是G型、T型、还是GT型的类型的实例。这种类型确定处理大概包括最大组确定算式，和2个样品t-检验算式。如图21示出，首先算出每组各自的电流数值的平均值(s91)。所述组包括Xa、Xg、Xc、Xt和Xn组，不同组的靶核酸不同，相同靶核酸在相同组。提取从中已经通过(s64)的类型确定过滤程序除去明显异常数据的测量数据。当然，可以提取从中已经通过除了(s64)的类型确定过滤程序之外的过滤程序除去异常数据的测量数据，或者可以提取未经任何过滤的测量数据。另外，可以获得不是各自的电流数值的平均值，而是对这些统计学数值进行统计学处理另外的统计学处理的数值。在此阐述了其中在靶核酸的SNP位置的核苷酸是A、G、C和T是A-T组及阴性对照组为N组的案例。另外，关于每组Xa、Xg、Xc、Xt和Xn的所得平均值是Ma、Mg、Mc、Mt和Mn。
然后，关于所得平均值Ma、Mg、Mc、Mt和Mn，确定最大值是否是G组的平均值Mg(s92)。如果是最大值，继续进行程序(s93)，如果不是最大值，返回进行程序(s97)。在(s97)中，关于平均值Ma、Mg、Mc、Mt和Mn，确定最大值是否是T组的平均值Mt。如果是最大值，继续进行程序(s98)，如果不是最大值，这样导致G组和T组均不是最大值，则由于未能确定而再次进行测试。在(s93)中，确定了G组测量数据Xg1、Xg2…与N组测量数据Xn1、Xn2…之间是否存在差异。为了确定是否存在差异，使用2样品t-检验。特别地，对比概率P与通过2样品t-检验获得的显著性水平α之间的代表性关系，如下进行确定 H0如果P≥α，则不存在显著性差异(无效假设) H1如果P＜α，则存在显著性差异(备择假设)。
显著性水平α可以由使用者使用计算机16设定。在(s93)的实例中，询问H1是在G组的测量数据与N组的测量数据之间数值是否存在差异，针对这个询问，假设H0要求设定这两组之间无差异。鉴于两组之间的差异总结在G组测量数据的平均Mg和N组测量数据的平均Mn中，获得概率。为了基于G组统计值Xg1，Xg2，…和N组统计值Xn1，Xn2，…计算概率，计算统计常数t和自由度

并从t分布的概率密度变量的积分值获得概率P。对于获得的概率P，如果P≥α，则H0不能被排除，且确定被保留。也就是，确定无差异。如果P＜α，则H0被排除，取假设H1，确定存在差异。当以这种方式确定“存在差异”这一确定结果时，程序走向(s94)，当确定“无差异”时，由于未能确定而再次进行检验。
在(s94)中，针对G组和A组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则程序走向(s95)，如果没有差异，则由于未能确定而再次进行检验。在(s95)中，针对G组和C组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则程序走向(s96)，如果没有差异，则由于未能确定而再次进行检验。在(s96)中，针对G组和T组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则确定是G组类型，因为G组类型是最大平均值，并且其它测量组之间有差异。如果没有差异，则确定其是GT组类型，因为G组类型是最大平均值，并且G组类型和T组类型之间测量结果中没有差异。在(s98)中，针对T组和N组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则程序走向(s99)，如果没有差异，则由于未能确定而再次进行检验。在(s99)中，针对T组和A组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则程序走向(s100)，如果没有差异，则由于未能确定而再次进行检验。在(s100)中，针对T组和C组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则程序走向(s101)，如果没有差异，则由于未能确定而再次进行检验。在(s101)中，针对T组和G组，如(s93)一样使用2样品t检验确定两组之间是否有差异。如果有差异，则确定是T组类型，因为T组类型是最大平均值，并且其它测量组之间有差异。如果没有差异，则确定其是GT组类型，因为T组类型是最大平均值，并且T组类型和G组类型之间在测量结果中没有差异。
上述确定结果显示在计算机16中配置的未示出的显示装置中。(s66)。通过使用这种类型确定算法，可以确定杂合(hetero)类型。
尽管在图19-21中示出了确定一种类型相应于G类型、T类型还是GT类型的程序，该程序当然可以适用于确定A类型、G类型、C类型和T类型的任意两种类型，或它们的杂合类型。另外，不是必须获得关于A类型、G类型、C类型和T类型组四种测量数据，可以仅获得关于SNP核苷酸的可能的两组的数据，或者可以向这两组中加入一组阴性对照。
使用图22的顺序图解释使用上述个体区分测试装置进行个体区分的自动化分析程序。如图22所示，首先，使用计算机16，设定用于自动化分析的自动化分析条件参数，用户指示计算机16基于所设定的自动化分析条件参数执行自动化分析(s301)。自动化分析条件参数是用于控制控制装置15的控制参数。控制装置15中使用的控制参数包括用于控制测量系统12的测量系统控制参数，用于控制流动系统13的流动系统控制参数和用于控制温度控制系统14的温度控制系统控制参数。测量系统控制参数是输入设定参数，并包括初始值、inclement值、完成值、测量时间间隔和动作模式。
流动系统控制参数具有电磁控制参数用于控制图15中所示的电磁阀403，413，423，433，441，442，444，445，451，453和463，具有传感器控制参数用于控制液体传感器443和447，以及具有泵控制参数用于控制泵454。这些电磁阀控制参数、传感器控制参数和泵控制参数包括对照对象的对照量、对照对象的对照定时以及用于控制对照对象的对照条件，以作为参数细节和作为依次执行图16的(s22)至(s36)所示步骤系列的条件。
控制参数的给出原则上伴有流动系统控制参数。也就是说，通过设定流动系统控制参数，设定相应于流动系统13的动作的温度控制参数。由此可以控制温度控制系统14和流动系统13的温度。
通过执行自动化分析，自动化分析条件参数被送至控制装置15(s302)。在接收到的自动化分析条件参数中，基于测量系统控制参数，控制装置15控制测量系统12，并且基于流动系统控制参数，该机构控制流动系统13，基于温度控制系统控制参数，该机构控制温度控制系统14。另外，基于每个控制参数中所含的控制定时和控制条件，控制装置15进行定时以控制这些测量系统12、流动系统13和温度控制系统14。因此，通过由用户设置的自动化分析条件参数可以自由地确定控制顺序，但是在图22中，将解释一代表性实例。
独立于这一自动化分析，用户可制备芯片夹11。之后，首先用基材固定螺丝25将其上密封了个体区分芯片21的印刷电路板22固定在芯片夹11的支持物111上，在所述芯片中，希望的核酸探针固定在工作电极501上，由此进行向芯片夹11的附着(s401)。具有上盖固定螺丝117的与密封材料24a集成的芯片夹上盖112和支持物111被固定，以形成小池115的状态制成(s402)。样品通过注射孔119被注射到芯片夹11中(s403)。芯片夹11被置于装置上，并且进行启动程序，由此，启动杂交反应(s21)。希望的是待被注射的样品体积稍大于小池115的容积量。由此，小池115可被样品完全充满，不留空气。
控制装置15基于自计算机16中接受的测量系统控制参数开始控制测量系统的定时(timing)(s303)。另外，控制装置15基于自计算机16中接受的流动系统控制参数相继控制流动系统13的每个元件(s304)。另外，尽管在图22中未特别示出，但结合这个流动系统13的控制，温度控制系统14的温度基于温度控制系统控制参数而被控制。通过这种控制，流动系统13自动进行流动步骤，包括图16的(s21)至(s36)(除了s34之外)所示杂交反应(s305)，同时温度控制系统14被自动控制，以便个体区分芯片21置于流动步骤中指定的温度下。控制装置15指令测量系统12进行测量，同时对这个流动步骤的测量步骤中途定时(s34)(s305)。即在流动步骤(s34)的测量步骤定时时，初始数值、inclement数值、完成数值、测量时间间隔和动作设置模式贮存在控制装置15的初始数值寄存器151、inclement数值寄存器152、完成数值寄存器153和间隔寄存器154及动作设置寄存器155中。或者，(s303)的测量系统定时控制可以与(s305)同时进行。
基于这种测量指令的测量系统12例如通过产生电压模式(s306)进行测量，所得测量信号从末端0输入控制装置15中(s307)。控制装置15处理接受的测量信号，将其作为测量数据在数据存储器15b中贮存(s308)。将这种测量数据通过局域总线17输入计算机16中(s309)。计算机16接收这种测量数据(s310)。
当以这种方式获得必需的测量数据时，计算机16基于测量数据实施图20(s64)所示的类型确定过滤(type determination filtering)。当类型确定过滤完成时，基于过滤的数据实施图21所示类型确定处理(s65)。将所得确定处理结果在计算机16上配置的显示器上显示(s66)。
对要区分的个体和样品进行上述类型确定，结果数据贮存在计算机16中。计算机16对比这些结果，确定它们是否一致。另外，确定结果的可靠性从预先输入的等位基因排列和基因型排列的数据中确定，这可以与确定结果一起显示。
计算机16与控制装置15之间的处理分配不限于前述分配方式。例如，当测量系统12、流动系统13和温度控制系统14具有解释计算机16的指令的处理器并实施每个元件时，可以省略控制装置15。
为了控制测量系统12、流动系统13和温度控制系统14的定时，当这些测量系统12、流动系统13和温度控制系统具有14定时处理器时，基于处理器控制的定时实施每个程序。在这种情况中，如果计算机16为这些测量系统12、流动系统13和温度控制系统14发送自动化分析条件参数，则非必需定时。或者，计算机16可以控制测量系统12、流动系统13、温度控制系统14和控制装置15的定时。
另外，已经示出了注射孔119与出口116b连通的实例，但是该孔也可以与入口116a连通。另外，已经示出了工作电极501和个体区分芯片21上的焊盘221的Ti或Au薄板结构实例，但是可以使用其它材料的电极和焊盘。另外，工作电极501的排列不限于图14所示。每个工作电极501、辅助电极502和参考电极503的电极数目不限于图中所示。
另外，流动系统13不限于如图15所示。例如，根据反应的种类，通过加入供应系统以供应除了空气之外的药物溶液、Milli Q水、缓冲液和嵌入剂，或者气体，可以在小池115中进行更复杂的反应。另外，可以使用除了电磁阀之外的其它方式控制管道系统之间供应途径和供应量。图16中示出流动系统13的动作仅是一个实例，可以根据反应目标不同而对动作加以改变。
另外，流体通道601a-601d不限于如图9B所示排列。例如，检测流体通道601a可以与直线连接小池入口部分115a和115b平行排列，或者各自的流体通道601a-601d可以不是直线的流体通道，而可以是曲线流体通道。再者，已经示出但不限于其中入口116a和出口116b与小池底面垂直的实例，小池入口可以设计为与小池底面平行。
根据本发明上述实施方案，可以自动进行个体区分测试及结果确定。
实施例 表1示出选择的单核苷酸多态性实例。描述了在亚洲人(中国人或日本人)作为样品时，对于每种单核苷酸多态性，每个核苷酸的等位基因频率和基因型频率。
表2示出了从表1的基因型频率、每个基因型(C/C、T/T、C/T)中最大频率(Max值)和最小频率(Minimum值)计算的估计的杂合性，以其倒数(1人/多少人)表示区分能力(鉴定能力)。每个柱的最低区分能力阶(step)分别通过乘以区分能力获得。因此，关于表1中的22个SNP，可以看出即使在最高频率的组合中，大约1人/8.38×106人(大约每8380千人)具有相同基因型，在最低频率组合中，1人/5.22×1019人具有相同基因型。
表1 表2 在本发明的详细解释中，描述了一种计算基因型组合的存在概率的方法，所述方法描述了将基因型的频率相乘然后取倒数。然而，在这个实施例中，对于每个SNP，预先计算基因型的倒数作为的区分能力，之后可以进行乘法计算。
然后，在上表示出的SNP中，选择任意5个SNP，制造其上固定了核酸探针以检测SNP的阵列。所用核酸探针的序列在表3中示出。
表3电极SNP-碱基序列(5′-3′) No.
-SH，硫醇修饰。
将含有每种核酸探针(30μg/mL)和NaCl(400mM)的溶液点于阵列的电极上，维持1小时。之后用蒸馏水洗涤、通风干燥，以获得固定了核酸的芯片。
作为靶核酸，合成通过PCR扩增的区域，并将其用作模板样品。表4示出了用作靶核酸的合成的寡聚物。
表4靶核酸(合成的寡聚物)
将表4示出的每种合成的核酸溶解于2×SSC溶液中至1×1014拷贝/mL，获得靶核酸溶液。在表4所示合成的核酸中，将在多态性位点含有G的核酸制备为样品1，在多态性位点含有A的核酸制备为样品2。将制造阵列浸入50μL制备的靶核酸溶液中，使阵列上的核酸探针与靶核酸溶液中的靶核酸杂交。将所述阵列浸入0.2×SSC溶液(35℃)中40分钟以洗去非特异性结合的靶核酸。用超纯水洗涤并通风干燥。将Hoechst 33258(50μM)溶解于20mM磷酸盐缓冲液(100mM NaCl)中，将通风干燥的芯片浸入该溶液中，5分钟后进行电化学测量。检测Hoechst 33258的氧化峰高度，将其用作电流峰值。
得自每个电极的电流峰值示于图23。图23A是样品1的测试结果。样品1明显均示出C/C纯合类型。因此，从表1的数值中可以确定具有这种基因型的个体以1人/696人存在。
另一方面，图23B示出的样品2均示出T/T纯合，从表1的数值中可以确定1人/5979人。
如上所述，根据本发明可以选择有利于个体区分的多个单核苷酸多态性，可以将个体区分所需的单核苷酸多态性的数目最小化。从而提供了一种简便、快速及经济的个体区分方法。
本领域技术人员易于了解本发明的其它优势和变化。因此，本发明广义而言不限于本文描述和示出的特定内容和实施方案。因此，在不偏离所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内可以对本发明进行各种修改。
序列表
<110>株式会社东芝(KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA)
<120>个体区分方法以及用于个体区分测试的阵列、装置和系统
<130>06S0113P
<150>JP 2005-188452
<151>2005-06-28
<160>20
<170>PatentIn version 3.2
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<213>Artificial
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gaggggaggg ctggggaggg aagggaaggg agaagactct 100
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ttagagtgaa aggctgctct ctactccttt acatgtatcc accttgggag acttatttct60
tttacttatg gtcatctctt gtgtccttca aaaggtacaa 100
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aattgctttt gaatactgat gtgcccaaag ttaaaaaact ataaatgggt ccttggtcag60
ctaattccaa aacaatacac cccagacttc tgttaacact 100
权利要求
1. 一种用于确定对象个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性的对象个体区分方法，所述方法包括
从待区分个体对象所属的群体中存在的单核苷酸多态性的组中选择多个单核苷酸多态性的步骤；和
确定所述对象个体具有的核苷酸序列和样品的核苷酸序列中所选择的多个单核苷酸多态性的基因型的步骤；和
通过对比所述基因型确定一致性的步骤，
其中在选择步骤中，选择符合如下(i)-(iii)中任一条件的单核苷酸多态性
(i)在2核苷酸取代类型的单核苷酸多态性的情况中，假定2个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X和Y，X+Y＝1，且Y≤X；
0.5≤X≤0.7；
(ii)在3核苷酸取代类型的单核苷酸多态性的情况中，假定3个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X；
1/3≤X且(1-X)/2≤Y且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9；和
(iii)在4核苷酸取代类型的单核苷酸多态性的情况中，假定4个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X；
1/4≤X且(1-X)/3≤Y，且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
2. 权利要求1的方法，其中条件(i)中等位基因频率符合0.55≤X＜0.7。
3. 权利要求1的方法，其中条件(i)中等位基因频率符合0.6≤X＜0.7。
4. 权利要求1的方法，其中条件(i)中等位基因频率符合0.65≤X≤0.68。
5. 权利要求1的方法，其进一步包括
通过计算所述对象个体具有的基因型组合在所述群体中存在的概率而确定所述确定一致性的步骤所得结果的可靠性，
其中所述概率是通过将基因型频率相乘并取倒数而计算，
针对所述对象个体具有的基因型的所有被选单核苷酸多态性，由等位基因频率计算基因型频率。
6. 用于确定对象个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性的阵列，其中核酸探针固定在基材上，其中
所述核酸探针具有与含有单核苷酸多态性的靶序列互补的序列，以及
所述单核苷酸多态性选自待区分对象个体所属群体中存在的单核苷酸多态性的组，并且符合如下(i)-(iii)中的任一条件
(i)在2核苷酸取代类型的单核苷酸多态性的情况中，假定2个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X和Y，X+Y＝1，且Y≤X；
0.5≤X≤0.7；
(ii)在3核苷酸取代类型的单核苷酸多态性的情况中，假定3个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y和Z，X+Y+Z＝1，且Z≤Y≤X；
1/3≤X且(1-X)/2≤X且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9；
(iii)在4核苷酸取代类型的单核苷酸多态性情况中，假定4个可能的核苷酸各自的等位基因频率为X、Y、Z和W，X+Y+Z+W＝1，且W≤Z≤Y≤X；
1/4≤X且(1-X)/3≤Y且X+Y＜1，及
(a)Y≤1/2·X且X＜2/3，或者
(b)1/2·X＜Y且XY＜2/9。
7. 权利要求6的阵列，其中条件(i)中等位基因频率符合0.55≤X＜0.7。
8. 权利要求6的阵列，其中条件(i)中等位基因频率符合0.6≤X＜0.7。
9. 权利要求6的阵列，其中条件(i)中等位基因频率符合0.65≤X≤0.68。
10. 区分个体的测试装置，其包含
权利要求6的阵列；
在阵列基材上的流体通道，其沿着药物溶液或空气的流动方向配置；
沿着所述流体通道的多个工作电极，每一电极均位于基材上，其上固定有探针；
辅助电极，每一辅助电极均排列在相应于所述工作电极的所述流体通道的内周表面上，并提供与工作电极的电势差；
参考电极，每一参考电极均排列在相应于工作电极的所述流体通道内周表面上，并反馈检测到的电压至工作电极；
入口，其开在所述流体通道中，使药物溶液或空气从所述流体通道的上游侧流至流体通道中；
出口，其开在所述流体通道中，使药物溶液或空气从所述流体通道流至所述流体通道的下游侧；以及
注射口，通过其将测试溶液注入所述流体通道中。
11. 区分个体的测试系统，其包含
权利要求10的区分个体的测试装置；
供应系统，其包含与入口连通并供应药物溶液或空气通过入口进入所述流体通道中的第一管道系统，以及控制第一管道系统的药物溶液或空气流速的第一阀；排出系统，其包含与出口连通并使药物溶液或空气通过出口从所述流体通道排出的第二管道系统，控制第二管道系统的药物溶液或空气流速的第二阀，及位于第二管道系统中并从所述流体通道抽吸药物溶液或空气的泵；
测量系统，其包含提供工作电极与辅助电极之间电势差的电压施加单元；
控制阵列温度的温度控制系统；
控制装置，其控制所述供应系统的第一阀，排出系统的第二阀和泵，测量系统的电压施加单元，和温度控制系统，所述控制装置检测来自工作电极或辅助电极的电化学反应信号并将所述电化学反应信号作为测量数据进行贮存；及
计算机，其向所述控制装置提供控制条件参数对其进行控制，同时基于测量数据执行分析核苷酸序列的处理，并确定个体具有的核苷酸序列与样品具有的核苷酸序列之间的一致性。
全文摘要
本发明提供了一种区分个体的方法。所述方法包括选择和使用符合本发明限定的任一条件的单核苷酸多态性。
文档编号C12N15/09GK101248188SQ20068001918
公开日2008年8月20日 申请日期2006年6月27日 优先权日2005年6月28日
发明者高桥匡庆, 桥本幸二 申请人:株式会社东芝